Next Generation Sequencing: meer met minder

Transcriptie

1 Next Generation Sequencing: meer met minder Robert van der Geize Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie (KMBP) Xs2HiTek-workshop 'Diagnostiek in de Pathologie' Boerhaavelaan 59 Postbus 516, 7550 AM Hengelo T info@labpon.nl

2 Afdeling Moleculaire Pathologie LabPON SOMATISCHE MUTATIE ANALYSE CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN (FISH) EPIGENETISCHE VERANDERINGEN (METHYLATIE) B-CEL CLONALITEIT MICROSATELLIET INSTABILITEIT WEEFSELIDENTIFICATIE HPV

3 Afdeling Moleculaire Pathologie LabPON SOMATISCHE MUTATIE ANALYSE: NEXT GENERATION SEQUENCING CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN (FISH) EPIGENETISCHE VERANDERINGEN (METHYLATIE) B-CEL CLONALITEIT MICROSATELLIET INSTABILITEIT WEEFSELIDENTIFICATIE HPV

4 Mutatie analyse 1. Amplificatie (PCR) van elke moleculaire marker 2. Mutatie voorscreening (HRM analyse) 3. DNA sequentie analyse: Sanger sequencing PCR Sanger sequencing

5 Steeds meer moleculaire aanvragen 2015: extrapolatie

6 Steeds meer analyses 2010 Longtumoren EGFR exon KRAS exon 2 Darmtumoren KRAS exon 2 Melanomen - Gliomen EGFR exon KRAS exon 2 BRAF exon 15 ERBB2 exon 20 KRAS exon 2-4 NRAS exon 2-4 BRAF exon 15 BRAF exon 15 NRAS exon 2-4 IDH1 exon 4 IDH2 exon ALK FISH ROS1 FISH RET FISH MSI MLH1 MGMT 1p19q FISH Beschikbare hoeveelheid patiëntmateriaal is zeer beperkt

7 Next Generation Sequencing Parallelle analyse van meerdere markers (exonen) Relatief weinig input DNA nodig (ca ng) Poolen van patientmateriaal mogelijk Hogere sensitiviteit t.o.v. huidige (Sanger) sequentieanalyse Relatief eenvoudig nieuwe markers toe te voegen Kwalitatieve data (aanwezigheid mutatie) Kwantitatieve data (amplificatie/deletie, genexpressie niveaus) Nadeel: langere doorlooptijd (3-4 dagen)

8 Darmtumoren Sanger sequencing Next Generation Sequencing meer met minder 7 single-plex qpcr reactions 70 ng DNA Per patient 1 multi-plex PCR reaction 5 ng DNA Meerdere patienten 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 10 ng 5 ng

9 Sequencers Ion Torrent Illumina PGM PROTON ION S5 HiSeq MiSeq NextSeq

10 Ion Torrent PGM

11 Workflow NGS - Aanvraag (dag 1 tot 16:00 uur) - Moleculair patholoog tekent tumorgebied af (dag 1) - Dissectie tumorcellen (dag 1) - DNA isolatie (dag 2) 7,5 uur 5,5-16 uur (overnacht) 3,5 uur 2,5 uur 0,5 DNA library Maken+qPCR (dag 2) Clonale amplificatie van de DNA library (emulsie PCR, dag 2) Opwerken clonale amplificaten (dag 3) Sequencing (dag 3) Data analyse (dag 3)

12 DNA library maken DNA barcode (patient identificatie)

13 Clonale amplificatie mbv emulsie PCR 1 DNA read

14 Data analyse Ion314 chip Ion316 chip Ion318 chip

15 Data analyse SeqNext (JSI Medical Systems) - intuïtieve software - correcte nomenclatuur - CNV analyse - mutatie database - gebruikerbeheer (loggen) - TV (analisten) en MV (moleculair bioloog/patholoog) mogelijk - meerdere labs in NL Ion Torrent Reporter (Life Technologies/ThermoFisher) NextGene (SoftGenetics) Lasergene Genomics Suite (DNAstar)

16 genenpanel genen exonen varianten coverage

17 Genenpanels voor targeted gene sequencing Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel KRAS EGFR BRAF PIK3CA AKT1 ERBB2 PTEN NRAS STK11 MAP2K1 ALK DDR2 CTNNB1 MET TP53 SMAD4 FBX7 FGFR3 NOTCH1 ERBB4 FGFR1 FGFR2 FFPE ( bp) 1 Multiplex PCR: 92 amplicons (22 genen) Community panel: gevalideerd

18 Genenpanels voor targeted gene sequencing Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Research Panel KRAS EGFR BRAF PIK3CA AKT1 ERBB2 PTEN NRAS STK11 MAP2K1 ALK DDR2 CTNNB1 MET TP53 SMAD4 FBX7 FGFR3 NOTCH1 ERBB4 FGFR1 FGFR2 Diagnostiek: Selectieve analyse van markers met klinische relevantie (software)

19 Validatie NGS Horizon Diagnostics referentie samples (commercieel) - bekende mutaties en tumorpercentages Patient materiaal uit diagnostiek met bekende uitslag Minimale tumorpercentage - >10% mutant allel (=20% tumor): mutatie aantoonbaar - achtergrond van random varianten (ruis) 2-8% (Hi-Q DNA polymerase) Sensitiviteit - Minimaal aantal benodigde reads bij 10% mutant allel

20 Sensitiviteit NGS BRAF V600E (10% allel) KRAS A146T (10% allel) NRAS G12A (6% allel) EGFR H773insNPH (10% allel)

21 Eigen genenpanel Multiplex PCR: 20 amplicons (11 genen) Ion AmpliSeq TM Designer: vastzetten van amplicons EGFR (4) KRAS (3) NRAS (3) HRAS (2) BRAF (1) ERBB2(1) PIK3CA (2) IDH1 (1) IDH2 (1) AMELX AMELY Voordelen - Klinische relevante genen/markers - Meer reads per marker - Meer samples op een chip - Makkelijk uitbreidbaar met nieuwe markers - Sexe identificatie mbv AMELX/AMELY (signaleren verwisselingen)

22 Kosten van NGS in de diagnostiek Werkuren Afschrijving ( /jaar) Onderhoud ( 5.000/jaar) Software server + 3 clients ( /jaar) Validatie ( )

23 Troubleshooting tijdens validatie DNA input: 15 ng/ml (100 pm ) library DNA (protocol) X Qubit 2.0 DNA concentratie - Ongebalanceerd aantal reads per sample bij multiplexing - Hoog percentage polyclonalen V Ion Library TaqMan Quantitation Kit - Gebalanceerde reads bij multiplexing - C t waarde als referentie voor DNA input - Kosten 1000/250 reacties aanpassen assay: 1/sample - Polyclonalen 20-30% (soms >40%)? Ion Library Equalizer Kit

24 Troubleshooting Chip loading V

25 Troubleshooting Chip loading X

26 Moleculaire Pathologie Analisten Abdel Ayoub Sandra ten Brinke Martine Bult Miranda Gouma Christel Jolink Kim Olde-Boerrigter Inge Raspe Nicole de Waal Hans Wilke Moleculair pathologen Sietske Riemersma Maria Tebar Casper Jansen Klinisch moleculair bioloog (KMBP) Robert van der Geize

27

28 Workflow Emulsie PCR: clonale PCR Exact 1 DNA molecuul per bead nodig OK =! Polyclonaal (niet OK)

29 Chromosomale afwijkingen Translocaties (FISH) met Next Generation Sequencing DNA DNA RNA NGS RNAseq

30 Chromosomale afwijkingen Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel Translocaties ALK, ROS1, RET Community panel Multiplex PCR RNAseq