HLA typeringen: nieuwe DNA technieken. Wendy T.N. Swelsen Afdeling Immunogenetica, HLA diagnostiek

Transcriptie

1 HLA typeringen: nieuwe DNA technieken Wendy T.N. Swelsen Afdeling Immunogenetica, HLA diagnostiek 1

2 Structuur presentatie DNA typeerstraat Nieuwe techniek: Next Generation Sequencing (NGS) 2

3 Afdeling Immunogenetica, HLA Hematopoïetische stamceltransplantatie Solid organ transplantatie Transfusie problematiek Ziekte associaties Populatie studies / research doeleinden 3

4 HLA complex 1 2 HLA klasse I HLA klasse II HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP 4

5 HLA typeren Serologische technieken detectie HLA antigenen DNA technieken detectie HLA allelen PCR-SSP spoedbepalingen (orgaandonatie, refractaire patiënten) PCR-SSO lage resolutie HLA typeringen (bijv. A*01) PCR-SBT hoge resolutie HLA typeringen (bijv. A*01:01) typeerstraat 5

6 Toename aantal HLA allelen 6

7 Efficiënt HLA typeren in typeerstraat DNA isolatie/kwantificeer Experimate Chemagen en Trinean unit Pre-PCR pipetteer robot Xiril Hybridisatie robot HLA Luminexhybridiseer GenProbe 2D barcode opslag Middleware software CLIS ABI-3130xl sequencer Post- PCR pipetteerrobot Xiril Elektronisch te versturen uitslagen 7

8 Sample track and trace 2D barcode gelabelde tubes en 96 wells platen 8

9 DNA isolatie robot Import werklijst van CLIS DNA isolatie Bloed Wangslijm Kwantificering Normalisatie Export resultaten naar CLIS 9

10 Pre-PCR robot Import werklijst CLIS Verschillende set-ups tegelijkertijd Pipetteren bij 4 C en KT Export werklijst naar hybridiseer station (PCR-SSO) post-pcr robot (PCR-SBT) Pre-PCR robot 4x96 reacties / run 10

11 Luminex-hybridiseer station (PCR-SSO) Import werklijst Hybridisatie gelabelde PCR producten aan beads Meting in Luminex apparaat Hybridiseer station 5x96 testen / run 11

12 Post-PCR robot (PCR-SBT) Import werklijst Zuivering PCR producten Set-up sequentie reacties Zuivering sequentie producten Export sample file naar sequencer Post-PCR robot 4x96 sequentie reacties / run 12

13 Efficiënt HLA typeren in typeerstraat DNA isolatie/kwantificeer Experimate Chemagen en Trinean unit Pre-PCR pipetteer robot Xiril Hybridisatie robot HLA Luminexhybridiseer GenProbe 2D barcode opslag Middleware software CLIS ABI-3130xl sequencer Post- PCR pipetteerrobot Xiril Elektronisch te versturen uitslagen 13

14 Voordelen HLA typeerstraat Continu kwaliteitsniveau Geen monsterverwisseling Geen schrijffouten Geen pipetteerfouten Minder hands-on time 14

15 Nieuwe technieken

16 Nieuwe technieken Registry typing SSO SBT sanger, batch-wise Kostenbesparing Intermediate resolutie typeer niveau Patiënt en stamceldonor typering SBT sanger SBT next-generation sequencing 16

17 Next generation sequencing Methode om heel veel verschillende genen tegelijkertijd te sequencen, waarbij materialen van verschillende patiënten gepooled kunnen worden. 17

18 NGS: oplossing HLA typeer probleem? Toename aantal HLA allelen meer ambiguïteiten 18

19 Genomische organisatie HLA Chromosoom 6 DPB1 DQB1 DRB1 B C A DPB1 DQB1 DRB1 B C A HLA-A gen HLA-A gen

20 Ambiguïteiten bij Sanger sequencing (1) Allel combinatie 1 A*01:01:01:01 & A*11:01:01 Allel combinatie 2 A*01:19 & A*11*19 Geen phasing vervolgonderzoek nodig 20

21 Ambiguïteiten bij Sanger sequencing (2) Typering DRB1*03:01 + DRB1*12:01 / *12:10 Niet gekarakteriseerde DRB1 regio exon 1 21

22 Karakteristieken NGS (1) Clonale amplificatie Emulsie PCR Bridge PCR Voordeel: direct allel-specifieke typering (geen phase ambiguïteiten) 22

23 Karakteristieken NGS (2) Uitgebreide parallelle sequencing Voordeel: sequencen additionele exonen en intronen 23

24 Vier NGS platforms Roche 454 GS FLX, GS Junior Life technologies IonTorrent PGM Illumina s Miseq Pac Biosciences SMRT 24

25 Hoge resolutie HLA typering & NGS HLA typering in 1 run Analyse van grote genomische regio s Gelijktijdige analyse van veel monsters Kostenbesparing indien voldoende schaalgrootte 25

26 Acknowledgements Afdeling Immunogenetica Masja de Haas Junior Lardy Peter van Eede Miranda van de Weerd Moleculair platform Ellen van der Schoot Richard van Hien 26

27 Deze dia alléén voor grote grafische uitingen gebruiken (vergeet niet deze textbox te verwijderen)