Overzicht van DNA technieken in de onco-hematologie

Transcriptie

1 Overzicht van DNA technieken in de onco-hematologie Cytogenetica en moleculaire diagnostiek Friedel Nollet, PhD Moleculair Bioloog AZ Sint-Jan Brugge-Oostende AV

2

3 Overzicht Chromosomen DNA (RNA) Genoom Epigenoom

4 Chromosomen Tjio JH, Levan A. The chromosome number of man. Hereditas, 1956, 42:1-16.

5 Karyotypering METHODE (1) Celkweek met Cochicine (een mitotisch gif, stop celdeling in metafase) (2) microscopische opname (3) software analyse en interpretatie

6 Waarom? Aangeboren chromosomale afwijkingen Verworven chromosomale afwijkingen Down syndroom Trisomie 21 (1959) Myelodysplastisch syndroom

7 Karyotypering bij AML en CLL PROGNOSE OP BASIS VAN RECURRENTE CHROMOSOMALE AFWIJKINGEN Acute Myeloïde Leukemie Chronische Lymfoïde Leukemie David Grimwade et al. Blood 2010;116: Döhner H, et al. N Engl J Med. 2000;343:

8 Fluorescente in situ hybridisatie (FISH) SNELLE, GERICHTE CHROMOSOOMANALYSE Bijvoorbeeld : opsporen van t(11;14)(q13;q32) bij mantelcellymfoom FISH karyotypering Chr. 11 Chr. 14

9 Karyotypering en FISH - Acute myeloïde leukemie - Myelodysplastisch syndroom (del5q!) - Chronische lymfoïde leukemie (del17p!) - Mantelcellymfoom: >95% t(11;14) - Folliculair lymfoom: >95% t(14;18) - Burkitt lymfoom : 90% t(8;14) - MALT lymfoom : ~50% t(11;18) - Grootcellig B-cel lymfoom, multiple myeloom, Diagnose Predictief (therapie- Keuze) Prognose

10 Wat? Waarom? Hoe? Chromosomen DNA (RNA) Aneuploidieën Translocaties Deleties Amplificaties Puntmutaties, Translocaties Karyotypering FISH PCR Genoom Mutatie profiel NGS

11 Wat is DNA? DEOXYRIBONUCLEÏNEZUUR

12 DNA: onze genetische code DNA BASEN CODEREN VOOR AMINOZUREN DNA basen A: adenine G: guanine C: cytosine T: thymine aminozuren

13 Wat is RNA (ribonucleinezuur)? DNA TRANSCRIPTIE NAAR RNA - TRANSLATIE NAAR EIWIT

14 Een gen EXPRESSIE WORDT SUBTIEL GEREGULEERD DOOR DE PROMOTOR REGIO intron intron exon exon exon Regulerende regio (promotor) Eiwit coderend DNA

15 Polymerase ketting reactie GEBASEERD OP HET NATUURLIJK PROCES VAN DNA REPLICATIE

16 Opsporen van DNA mutaties POLYMERASE KETTING REACTIE Een ketting reactie om uit zeer kleine hoeveelheden DNA een stukje DNA te vermeerderen zodat er genoeg is om te onderzoeken

17 DNA mutatieonderzoek in de onco(-hematologie) WELKE MUTATIES? Groei stimulerend gen (proto-oncogen) Let s go Oncogen Activerende mutatie <- Normaal - > - Tumor - Groei inhiberend gen Inactiverende mutatie Inactief Tumor suppressor gen No

18 Mutaties in oncogenen SIGNAALTRANSDUCTIE PATHWAYS

19 Puntmutatie in een oncogen BIJVOORBEELD JAK2 gen ( basen): - Chromosoom basen coderend aminozuren Puntmutatie : Genomische coördinaat : 9: G>T Coderende positie c.1849g > T Eiwit positie : 617 (Valine) JAK2 Val617Phe of JAK2 V617F

20 Translocatie bij oncogenen chromosoom A chromosoom B chromosoom A chromosoom B Na translocatie : teveel aan oncogeen eiwit

21 BCR-ABL1 fusie-eiwit - t(9,22) bij CML TYROSINE KINASE INHIBITOR - IMATINIB - 3D STRUCTURE

22 Overzicht DNA (RNA) analyses IN DE ONCO-HEMATOLOGIE Translocaties - t(9;22) BCR-ABL1 translocatie : chronische myeloïde leukemie (>95%) (RNA!) - acute leukemie : test met 28 recurrente translocaties (RNA!) - t(14;18) BCL2-IgH translocatie : folliculair lymfoom (PCR positief 60-70%) Puntmutaties - JAK2 V617F : polycythemie vera (>95%), essentiële thrombocytemie en primaire myelofibrose (50-60%) - CALR, MPL : essentiële thrombocytemie en primaire myelofibrose (30-40%) - BRAF V600E: hairy cellymfoom (95%) - MYD88 L265P : Waldenström (95%) - FLT3, NPM1, CEBPA : bij acute myeloïde leukemie Andere DNA testen - Klonaliteitsanalyse bij B-/T-cel maligniteiten - DNA fingerprinting (chimerismetest) na stamceltransplantatie Diagnose Predictief (therapie- Keuze) Prognose Opvolging (gevoeligheid tot 1: )

23 Wat? Waarom? Hoe? Chromosomen DNA (RNA) Aneuploidieën Translocaties Deleties Amplificaties Puntmutaties, Translocaties Karyotypering FISH PCR Real time PCR Genoom Mutatie profiel NGS

24 Revolutie in het DNA onderzoek NEXT GENERATION DNA SEQUENCING Read Length Max. throughput Illumina MiSeq 2x300 bp basen (menselijk genoom is ~ basen) clusters per mm 2

25 Mutatie profilering Rossi et al., Blood : Diffuse large B-cell lymphoma genotyping on the liquid biopsy NGS myeloïd 21-genen panel ASXL1 KIT CALR MPL NGS myeloïd CEBPA 21-genen panel NPM1 CSF3R RUNX1 DNMT3A SETBP1 EZH2 SF3B1 FLT3 SRSF2 IDH1 TET2 IDH2 TP53 JAK2 U2AF1 WT1

26

27

28 Wat? Waarom? Hoe? Chromosomen DNA (RNA) Aneuploidieën Translocaties Deleties Amplificaties Puntmutaties, Translocaties Karyotypering FISH PCR Real time PCR Genoom Mutatie profiel NGS Epigenoom Epigenetische wijzigingen?

29 Epigenetica Overerving van kenmerken niet via de A,C,T,G basen vb. overerving van gen-expressiepatroon van cel naar dochtercel Hoe? oa. door DNA methylatie : de 5 de DNA base

30 overerfbaarheid van DNA methylatiepatroon DNMT (DNA METHYL TRANSFERASE) ENZYMES

31 Hypo-/hypermethylatie BIJ KANKER / VAN TUMOR SUPPRESSORGENEN CpG islands transcriptie Geen transcriptie

32 Epigenetische wijzigingen in de oncologie? Hoge frequentie aan mutaties in genen betrokken in epigenetische wijzigingen bij maligniteiten (DMNT3A, ASXL1, TET2, IDH1/2, ). Hypomethylerende agentia (decitabine, azacytidine) zorgen voor een heractivatie van tumorsuppresorgenen.

33