CML en stoppen moleculaire diagnostiek

Transcriptie

1

2 CML en stoppen moleculaire diagnostiek Moderator Dr. P. Kuiper-Kramer 1st author / speaker Dr. Bert A. van der Reijden Bert.vanderReijden@radboudumc.nl Dept of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboudumc

3 Conflict of Interest Disclosure Form In accordance with the rules of the Health Care Inspectorate (IGZ) Name: Affiliation: Bert van der Reijden Radboudumc I have no potential conflict of interest to report I have the following potential conflict(s) of interest to report Type of affiliation / financial interest Name of commercial company Receipt of grants/research supports: Receipt of honoraria or consultation fees: Participation in a company sponsored speaker s bureau: Stock shareholder: Other support (please specify): Scientific advisory board CML advisory board Novartis

4 BCR-ABL: is tyrosine constitutieve kinase fosforylering ABL is cytoplasmatisch eiwit Groeifactoren: activatie ABL Fosforylatie bindingspartners Celdeling, apoptose ABL ATP Signaal tr eiwit p BCR- ABL ATP Fosforylatie zonder groeifactor Signaal tr eiwit p Toename celdeling Apoptose remming

5 Therapie gericht op BCR-ABL Imatinib lijkt op ATP, bindt ABL beter dan ATP BCR- ABL Imatinib p Signaal tr eiwit Celdeling Apoptose 10 jrs overleving van <50% naar ~90%

6 Tumorgrootte en reductie bij BCR-ABL positieve CML Aantal cellen Therapie (mnd) Diagnose * >12

7 Fusiegendetectie met PCR op cdna (RNA) niveau BCR ABL genomisch DNA transcriptie en RNA splicing reverse transcriptie fusie mrna fusie cdna: RT-PCR Primers Polymerase, dntps, MgCl 2 Genomisch DNA: breukpunten in grote intronen maar 1 kopie per cel RNA/cDNA: RNA splicing: breukpunten bij elkaar meerdere kopieen per cel

8 Kwantificeren BCRABL leukemiecellen met qpcr 1 cyclus BCR ABL 2 cdna 2 cycli 4 UV 3 cycli 8 Q R 4 cycli n cycli 16 2 n Fluorescente DNA probe R = reporter Q = quencher licht wordt geabsorbeerd

9 Degradatie fluorescente probe tijdens amplificatie Q R exonuclease activiteit polymerase: destructie probe Q Geen absorptie licht Gemeten tijdens PCR (real time) Signaal = hoeveelheid PCR product R

10 Kwantificeren BCRABL leukemiecellen met qpcr 1 cyclus 2 cycli BCR ABL 2 4 cdna 3 cycli 8 4 cycli 16 Exponentiële toename Signaal evenredig starthoeveelheid n cycli 2 n

11 Fluorescent signaal qpcr amplificatieplot: toename signaal per cyclus exponentiële fase Drempelwaarde 0 PCR cycli 43 Signaal exponentiële fase correleert met oorspronkelijke cdna concentratie

12 100% 10% 1% 0.1% 0.01% Kwantificering gebaseerd op calibratiereeks Verdunningsreeks Bijv K562 cellijn cycli BCRABL sample Vergelijk aantal cycli met calibrator cycli

13 qpcr normalisatie en voldoende input: referentiegen Referentiegenen PBGD, GUS, ABL Verdunningsreeks: normalisatie Vaste cdna input: gedefinieerd aantal cycli 1 cyclus meer: Q maal 2 1 cyclus minder: Q delen 2 Gevoeligheid: 1 op gehaald?

14 BCRABL internationale schaal (%) Major molecular repons (MMR), MR 4 en MR 4,5 bij CML Maximale waarden na Imatinib 3 mnd Zwak positief Detectie limiet mnd MMar3 12 mnd MMR MR 4 MR 4,5 100% IS: mediaan 3x30 BCRABL/BCR waarden 0.1% = major moleculaire respons Tijd

15 Relatieve hoeveelheid samples Uitstekende relatieve BCRABL kwantiteiten 0,1 0,09 0,08 0,07 0,06 n = 21 labs Maximaal 4x hoger tov ref Minimaal 4x lager tov ref 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 REF voudige verdunning tov 100-voudige BCRABL verdunning Gemiddeld ref = 0,025 (40-voudige verdunning)

16 BCRABL niveau Kinetiek zeer goed, absolute waarden sterk verschillend Oorzaken Referentiegen Berekening 1 ipv 100 BCRABL verdunning Correctie gewenst

17 Bepalen conversiefactor (CF) Laboratorium A (centraal lab) Laboratorium B (deelnemend lab) 30 patiëntensamples Lab B naar Lab A Vergelijk data: conversiefactor BCR-ABL lokaal * CF = BCR-ABL IS Iedere 2 jaar herhalen

18 Absolute waarden zeer vergelijkbaar naar conversie

19 BCR-ABL qpcr bewerkelijk, hoog afbreukgehalte Poolen 3 buizen bloed Leukocyten- en RNA isolatie cdna synthese BCR-ABL qpcr sample BCR-ABL qpcr calibratiereeks qpcr normalisatiegen Interpretatie resultaten

20 BCR-ABL qpcr in een cartridge (Cepheid technologie) 200 ul bloed Lysis stap (10 min) Pipetteer in cartridge 11 kamertjes RNA isolatie cdna synthese BCRABL qpcr Normalisatie qpcr Resultaat na 2,5 uur Op Internationale Schaal Sensitiviteit indien negatief

21 Efficiency Genexpert Cepheid vs BCRABL qpcr Reductie hands on tijd (3:19 hrs vs 0:28 hrs) Spaghetti diagram Conv qpcr Spaghetti diagram Cepheid Courtesy Nancy Boeckx, Leuven University

22 Conclusies BCRABL chronische myeloide leukemie Monitoren therapierespons: BCRABL qpcr BCRABL waarden op Internationale schaal 3 maanden na TKI: < 10% 6 maanden na TKI < 1% 12 maanden na TKI <0.1% Cepheid technologie: Geen conversiefactor nodig Resultaat < 24 uur

23 Additionele ABL puntmutaties in BCRABL: resistentie 10% van patiënten resistentie Vaak mutatie ATP-bindend domein BCRABL Imatinib bindt niet meer, ATP wel: recidief BCR- ABL Imatinib ATP p Signaal tr eiwit p Bewijs werking middel

24 Detectie ABL mutaties in BCRABL BCR ABL cdna Amplificatie BCR-ABL: >10-3 Amplificatie tyrosinekinasedomein Sanger sequencen Resistent? Puntmutatie L248V Q252H E255V T315I Imatinib Nilotinib Dasatinib Ponatinib Ja Nee Nee Nee Ja Nee Ja Nee Ja Ja Nee Nee Ja Ja Ja Nee

25 BCRABL internationale schaal (%) Resistentie: verlies Imatinib respons na initiële daling Puntmutaties meetbaar boven MMR Zwak positief Detectie limiet Time