Kwantitatieve PCR van potentieel toxische cyanobacteriën in oppervlaktewateren

Transcriptie

1 Kwantitatieve PCR van potentieel toxische cyanobacteriën in oppervlaktewateren Edwin Kardinaal, Danielle van der Linde, Lonneke Hensen & Bart Wullings KWR Watercycle Research Institute, Nieuwegein

2 Inhoud Q-PCR ontwerp Wat doet Q-PCR Gebruik fycocyaninegenen Wat zijn de doelorganismen Resultaten Test van methodiek op veldsamples Q-PCR resultaten in vergelijk met microscopische tellingen Toepassing methodiek in huidig beleid Algemeen toepasbaar? Conclusies 2

3 3

4 Nederlandse regelgeving mbt toxische cyanobacteriën in recreatie- en zwemwater in 2010 Indien cyanobacteriën een relevant gevaar lijken te vormen: Dagelijkse observatie van mogelijke drijflagen Intensieve monitoring of tellen van cyanobacteriën (wekelijks of eens per twee weken) tijdens het zwemseizoen Focus op potentieel toxische cyanobacteriën (Microcystis, Planktothrix, Anabaena, Aphanizomenon en Woronichinia) < cellen/ml; tweewekelijkse monitoring > cellen/ml < cells/ml; waarschuwen > cellen/ml: negatief zwemadvies HOE? 4

5 Methoden om cyanobacteriën te monitoren in zwemwater Microscopische tellingen Kwantificeren van cellen op basis van visuele waarnememingen Fluorometrie Detectie van cyanobacterie specifiek chlorofyl Q-PCR? Kwantificeren van specifiek DNA 5

6 Q-PCwattuh? Elk organisme bevat DNA: uniek voor soort (of individu). DNA niks meer dan opeenvolging van stikstofbasen : Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) en Guanine (G) ATGCGTGCAATGTTTACGCGTAAAGCGTGCACGTTAGAGTACGTGCAGT TACGCACGTTACAAATGCTCATTTCGCACGTGCAATCTCATGCACGTCA 6

7 Zo werkt dat! (1) 7

8 Zo werkt dat! (2) 8

9 Q-PCR of kwantitatieve real-time polymerase ketting reactie Techniek gebaseerd op het real-time meten van selectieve DNA-vermenigvuldiging in de PCR-reactie Isolatie van genetisch materiaal (DNA) Detectie op basis van verschillen in DNA-volgorde Kenmerken: snel (<4 uur) selectief en gevoelig kwantitatief robuust (elk watertype) Mogelijkheid om meerdere targets te detecteren Microcystis, Planktothrix, etc gecombineerd met een interne controle 9

10 Q-PCR primer en probe design Fycocyanine operon (cpcba) Uniek voor cyanobacteriën Grote collectie van referentie sequenties beschikbaar in databases (totaal 1000 cpcba sequenties) Één kopie van cpcba operon op genoom Microcystis Sequentie-informatie operon gebruikt voor fylogenetische studies Q-PCR primers en probes (Taqman) ontworpen op basis van verschillen en overeenkomsten 10

11 Vissen in de soep.. Microcystis Aphanizomenon Planktothrix Anabaena 11

12 Dendrogram van Anabaena en Aphanizomenon cpcba sequenties A B Anabaena bergii, Aphanizomenon ovalisporum Anabaena variabilis, Anabaena siamensis e.g. Anabaena flos-aquae, A. kisseleviana, A.bergii, A. sphaerica, Aphanizomenon aphanizomenoides, C e.g. Anabaena solitaria, A. planktonica, A. viguieri, A. spiorides, A. circinalis, A. smithii, A. ucrainica, A. affinis, A. elipsoides, and A. lemmermannii D e.g. Aphanizomenon glacile, A. flos-aquae, A. issatschenkoi, Anabaena lemmermannii, A. circinalis, A. flos-aquae 12

13 De onderzochte locaties locaties Ca. 8 monsternamemomenten Totaal 182 monsters 13

14 Relatie celtelling en qpcr (1) 14

15 Relatie celtelling en qpcr (2) 15

16 Connectie celdichtheden vs. DNA kopie aantallen Bestaat er een relatie tussen celdichtheden en DNA kopie aantallen? Afhankelijk van: groeifase (seizoen) celtellingen genus en/of soort Proef: Groei cyanobacteriën onder gecontroleerde omstandigheden, kwantificeer cellen en meet DNA kopie aantallen. 16

17 Relatie cyanobacteriecellen vs. DNA kopie aantallen Groeiproef: Celtellingen mbv (omkeer)microscoop Celtellingen mbv flowcytometrie DNA kopie aantallen mbv qpcr 17

18 Verhoudingen laboratorium proef 18

19 Omrekenfactoren Ratio tussen de kwantitatieve resultaten van de qpcr van de cyanobacteriën in de groeiproef ten opzichte van de microscopische celtelling en flowcytometerbepalingen. 19

20 De onderzochte locaties locaties Ca. 7 monsternamemomenten Totaal 232 monsters 20

21 Correlaties het grote plaatje Planktothrix Anabaena 86 R 2 = 0,4096 R 2 = 0,875 log genkopieën (/ml) log log cellen cellen (/ml) (/ml) 21

22 Match tussen celaantallen en DNA kopieën op locatie cellen // DNA kopie aantallen per per ml ml Camping Kennemermeer De Watermolen Anabaena C Aphanizomenon D Microcystis Planktotrix Anabaena sp. Aphanizomenon Microcystis sp. Planktothrix sp Weeknummers Weeknummers 22

23 Correlaties per locatie 23

24 Verhoudingen op basis van lab en veld Veld 2010 Verhoudingen Veld 2011 Labstudie velddata Anabaena Aphanizomenon Microcystis Plaktothrix DNA kopiëen/cel DNA kopieën / cel Cultures Anabaena De Dommel Aphanizomenon Delfland RWS IJG Microcystis Rijnland RWS Plank oost tothrix WS Fryslan Zuiderzeeland nederland 24

25 Reproduceerbaarheid tussen laboratoria DNA kopie aantallen 1,0E+08 1,0E+07 1,0E+06 1,0E+05 1,0E+04 1,0E+03 1,0E+02 1,0E+01 1,0E+00 Aphanizomenon I Aphanizomenon II Aphanizomenon III M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 DNA contr. 25

26 Conclusies Goede relatie cellen en DNA kopie aantallen: zie de 2 veldstudies, meer dan 400 monsternamemomenten! Na correctie resultaten van beide technieken in zelfde orde grootte Vergelijkbare resultaten tussen laboratoria qpcr gericht op fycocyaninegenen biedt goed alternatief voor microscopische tellingen: betere risicobeoordeling! Nog te doen: Meer laboratoria, intercalibratie Uitbreiden naar andere genera: i.i.g. Woronichinia / Phormidium 26