1. Welk van de onderstaande DNA sequenties zijn mogelijke herkenning-sites voor restrictie-enzymen? c 5' GAATTC 3' c 5' GGGGCCCC 3' c 5' CTGCAG 3' 5'

Transcriptie

1 proefexamen

2 1. Welk van de onderstaande DNA sequenties zijn mogelijke herkenning-sites voor restrictie-enzymen? c 5' GAATTC 3' c 5' GGGGCCCC 3' c 5' CTGCAG 3' 5' CTAAATC 3' 5' GGAACC 3'

3 Restriction Endonucleases

4 2. Alle onderstaande beweringen over complexe transcriptie-units zijn waar, behalve: complexe transcription units kunnen meerdere poly(a)sites bevatten. complexe transcription units kunnen meerdere mrna s produceren. complexe transcription units coderen voor verschillende eiwit-varianten. complexe transcription units kunnen meerdere translatiestopcodons bevatten. c complexe transcription units zijn algemeen in bacteriën. 3. Alle onderstaande beweringen over alternatieve splicing zijn waar, behalve c door alternatieve splicing worden mrna s gemaakt zonder een poly(a) staart. door alternatieve splicing kan van één gen meerdere mrna s worden geproduceerd. door alternatieve splicing kan één gen coderen voor meerdere polypeptiden. alternatieve splicing vindt plaats in spliceosomen. alternatieve splicing is algemeen in eukaryote genomen.

5 Alternative splicing results in complex transcription units in eukaryotic genomes Lodish:

6 4. Het restrictie-enzym EcoRI herkent de sequentie GAATTC terwijl restrictie-enzym RsaI alleen de sequentie AATT herkent. Als u het genomisch DNA isoleert uit Arabidopsis cellen (genoom: 150x10 6 bp) hoeveel restrictiefragmenten verwacht u als u het enzym EcoRI gebruikt? > x10 6 : 4 6 (B) En met enzym RsaI? > x10 6 : 4 4 Beschrijf waarom het EcoRI en/of het RsaI enzym wel/niet is geschikt om een 'large insert' (>100 kb) genomische bank (een zogenoemde 'BAC library') te maken. RsaI knipt veel vaker dan EcoRI, terwijl je juist grote fragmenten wil cloneren. Dus EcoRI zou meer geschikt.

7 5. (A) Wat is minisatelliet DNA? een repetitief stuk dna, tandem repeat, van bp dat in heel veel copy-en verspreid in het genoom voorkomt (B) Waar kan minisatelliet DNA voor gebruikt worden? DNA Fingerprinting; het onderscheiden van individuen op basis van verschillen in hun DNA In geval van minisatelliet kun je gebruik maken van een southern blot (het principe van een southern blot moet je weten)

8 DNA fingerprinting depends on differences in length of simple-sequence DNAs Probes: a = λ33.6 b = λ33.15 c = λ33.5 Lodish:

9 Micro satellite Griffiths 9e: Chapter 4: Simple sequence length polymorphisms

10 5. Tomaat heeft 5 functionele genen welke coderen voor het Rubisco small subunit eiwit. (A) In hoeverre kan het functioneren van de 5 genen verschillen? De kernwoorden zijn hier sub-functionalizatie en neo-functionalizatie.. Er kunnen veranderingen optreden in de promoter waardoor genen op andere plekken/andere weefsels tot expressie komen. Zo kan bijvoorbeeld de functie van het oude gen dat gedupliceerd is worden verdeeld over de nieuwe copyen (= sub-functionalizatie). Of er treden mutaties op in het coderende gebied waardoor de functie van een gen veranderd. De oude copy behoudt dan de oude functie. Dit is neo-functionalizatie. (B) Andere plantensoorten hebben, in vergelijking tot tomaat, meer Rubisco small subunit genen, waarvan een aantal niet functioneel zijn. Hoe zijn deze additionele kopieën ontstaan? Door duplicatie, gevolgd door mutaties.

11 Gene families arise due to gene duplication Globine and RbcS genes form a gene family, which arose as result of gene duplications. Gene duplications are an important force in evolution. Promoter evolution can lead to sub-functionalization (2 new genes divide the old function). Protein evolution can lead to neo-functionalization (one copy obtains new function). Mutations can disrupt gene functioning leading to emergence of a pseudo-gene.

12 6. Beschrijf de processen dat eukaryoot pre-mrna ondergaat voordat het in het cytoplasma vertaald wordt in eiwit. Te noemen in volgorde: Er wordt een 5 CAP toegevoegd (aan de 5 kant van het pre-mrna) Er wordt een poly-a staart toegevoegd aan de 3 kant op na knippen van het pre-mrna op de poly-adenylerings site De intronen worden er uitgespliced (dit gebeurt in/door de spliceosomen)

13 Processing of eukaryotic mrna ' UTR ORF 3' UTR mrna contains ORF Lodish: (including movie: Movie: Life Cycle of an mrna)

14 7. Je student heeft een protocol uitgeschreven om een P.C.R. fragment te cloneren, en is de benodigdheden bijeen aan het zoeken. De volgende componenten zijn reeds gevonden: - Het PCR fragment geamplificeerd met primers die een BamHI en HindIII restrictie-site bevatten. - plasmide DNA met een ampicilline resistentie-gen en een multiple clonerings site met BamHI and HindIII restrictie-sites. - Bacterieel vloeibaar en vast (platen) groeimedium met en zonder ampicilline. - Restrictie-enzymen BamHI en HindIII. -Competente E. coli cellen die een plasmide kunnen opnemen. (A) Is deze lijst compleet, of ontbreekt er iets, en zo ja, wat? Ligase ontbreekt (B) Beschrijf hoe je te werk gaat om het PCR fragment te cloneren. Zie volgende slides

15 Cloning: inserting a DNA fragment in a recombinant plasmid

16 Ligase repairs phosphodiester bounds Lodish:

17 Plasmid cloning permits isolation of DNA fragments from complex mixtures

18 Plasmid cloning permits isolation of DNA fragments from complex mixtures DNA library Lodish: + Movie

19 8. Het GFP gen codeert voor het 'GREEN FLUORESCENT PROTEIN' en wordt in de moleculaire biologie vaak gebruikt om fusie-eiwitten te maken. Daarbij zijn zowel N- als C-terminale fusies met het te bestuderen eiwit of mogelijk (N-terminale fusie: eerst GFP dan het target eiwit, C-terminale fusie: eerst het target eiwit dan het GFP). Ontwerp 2 primers van 20 nucleotiden voor een PCR op de onderstaande GFP sequentie, zodat er een fusie gemaakt kan worden met het target gen waarbij GFP N-terminaal van het gecodeerde fusie eiwit zit (ATG is start codon, TAA= stop codon). Je hoeft geen rekening te houden met de te gebruiken cloneringsstrategie (dus geen restrictie-sites toevoegen!). >GFP 5' '-atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 61 gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 121 aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 181 gtcactactt tgacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacgg 241 catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 301 aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 361 aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 421 ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 481 atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 541 cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 601 ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 661 cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa-3' 3'- -5 LET OP: sequenties worden altijd in 5' 3' richting weergegeven (ook primers), tenzij expliciet anders vermeld! forward primer: reverse primer: 5'-atgagtaaag gagaagaact-3 5 -tttg tatagttcat ccatgc-3 Het stop codon TAA hoort in dit geval niet in de reverse primer

20 9. Een nucleotide bestaat uit 3 delen; een N-base, een suiker en één of meer fosfaatgroepen. Weergegeven zijn 3 verschillende nucleotiden. De 5 C-atomen van de suiker-groep zijn genummerd. (A) Welk nucleotide is de basis bouwsteen van RNA? B (met OH groepen of c-atoom 2 en 3) (B) En welke nucleotide is de basis bouwsteen van DNA? A (deoxyribonucleicacid; de OH groep of c-atoom 2 is vervangen door een H-atoom (C) Waarvoor wordt de overgebleven nucleotide gebruikt? Sequencing

21 Ribonucleotides found in RNA

22 Dideoxy sequencing method (Sanger sequencing)

23 x x x x x x

24 x x x x Wordt allebei goed geteld x x x x