Moleculaire markers & risicostratificatie in 2020

Transcriptie

1 Moleculaire markers & risicostratificatie in 2020

2 Belangenverklaring NAAM :J.H. Jansen ORGANISATIE: Radboudumc In overeenstemming met de regels van de Inspectie van de Gezondheidszorg (IGZ), zijn sprekers verplicht een belangenverklaring in te vullen. Wij vragen u daarom dit formulier in te vullen. Pas als u dit formulier heeft ingevuld is het voor u toegestaan om uw abstract te presenteren. U bent verplicht om uw presentatie met dit formulier te beginnen. VERKLARING x Ik heb geen potentiële belangenverstrengeling Ik heb de volgende mogelijke belangenverstrengelingen Type van verstrengeling / financieel belang Naam van commercieel bedrijf Ontvangst van subsidie(s)/research ondersteuning: Ontvangst van honoraria of adviseursfee: Lid van een commercieel gesponsord speakersbureau Financiële belangen in een bedrijf (aandelen of opties) Andere ondersteuning (gelieve te specificeren):

3 Gebruik van moleculaire diagnostiek I: classificatie II: III: IV: Aanpassen van behandeling op basis van risicoprofiel(bv stamcel transplantatie) Toepassing van therapie die zich richt op gemuteerde eiwit(bv tyrosine kinase inhibitors bij CML) Gevoelige bepaling van restziekte, vroeg ingrijpen bij ontwikkelend recidief

4 Survival 100% Mutaties definieren verschillende prognostische groepen (AML) 1-2%: Bcr-Abl 7%: PML-RAR 20%: CBF (AML1-ETO & CBFB-MYH11) overall 10%: MLL 25%: Flt3-ITD => Behandeling wordt afgestemd op risicoprofiel (years)

5 Mutaties definieren bepalen gevoeligheid voor gerichte therapie Survival 100% %: Bcr-Abl 10%: MLL 25%: Flt3 atra 7%: PML-RAR 20%: CBF Overall FLT3 inhibitors eg PKC412 (years) => Behandeling wordt afgestemd op type mutatie

6 CML: kwantitatief vervolg van subklinische ziekte I II III Bcr-abl positieve cellen

7 Huidige moleculaire diagnostiek bij AML Mutaties Incidentie (%) Prognose targeted behandeling PML-RAR 5-7 goed ATRA, arsenicum) CBFB-MYH11 10 goed AML1-ETO 10 goed Flt3 30 slecht PKC412 /AC220 EVI1 10 zeer slecht C/EBPA 7 goed NPM1 30 goed

8 Klassieke technieken voor moleculaire diagnostiek Cytogenetics FISH SNP-arrays Soutern blotting PCR voor specifieke mutaties Q-PCR voor gen-expressie

9 Nieuwe methode Cytogenetics FISH SNP-arrays Soutern blotting PCR voor specifieke mutaties Q-PCR voor gen-expressie Next generation sequencing (NGS)

10 Next Generation Sequencing

11 Sequentielewasstappen met nucleotiden: bij incorporatie komt er een H+ vrij

12 Klassieke technieken voor moleculaire diagnostiek Basale principe: op een drager (glas, chip) wordt 1 DNA of cdna molecuul aangebracht Op 1 lokatie, waarna een sequentie reactie wordt ingezet op het geheel

13 Next Generation Sequencing 1 chip bevat 11 x 10 6 sensors

14 Individuele sequenties worden vergeleken met referentie: aantal reads bepaalt gevoeligheid Diepte: whole genome: whole exome amplicon-based 1000 en meer

15 Kosten van sequencing dalen exponentieel

16 Sequencing capaciteit per machine/dag stijgt exponentieel 1 genome = +/- 3 x 10E9 baseparen

17 De meeste klassieke moleculair diagnostische technieken zijn in principe door NGS vervangbaar mutaties Kwantitatief gen expressie (sequencen van cdna) Fusie genen (software in ontwikkeling) Allel frequenties (mbv SNP analyse) komende jaren nog veel optimalisatie nodig: zowel hardware- als softwarematig

18 Kunnen we alle extra informatie interpreteren?

19 Hematopoiesis Stem cells mature end cells FLT3-Ligand SCF IL2 IL4 MCSF B/T cells Monocytes macrophages IL6 IL3 GMCSF EPO TPO IL7 GCSF IL5 EPO granulocytes platelets erythrocytes bone marrow Pheripheral blood

20 Pathways involved in proliferation and differentiation control P P Cell cycle d d G0 M G1 S G2 d d Gene transcription In case of abberant regulation: p53 is activated leading to apoptotis

21 Biologische classificatie van AML Gene Frequency Prognostic impact Gene function NPM % Favorable Nuclear import, apoptosis FLT3 ITD 20-25% Unfavorable Growth factor receptor DNMT3A 20-23% Unfavorable Epigenetic transcription regulation Various MLL 10-15% Unfavorable Epigenetic transcription regulation N-RAS/K-RAS 10-15% Intermediate Signal transduction CEBPA 10-15% Favorable (bi-allelic mutations) Transcription factor CBFB-MYH11 10% Favorable Transcription factor AML1-ETO 10% Favorable Transcription factor TET2 8-13% Unfavorable Epigenetic transcription regulation IDH2 6-10% Unclear Epigenetic transcription regulation PML-RAR 5-10% Favorable Transcription factor ASXL1 5-10% Unfavorable Epigenetic transcription regulation RUNX1 5-10% Unfavorable Transcription factor FLT3-TKD 5-7% Intermediate Growth factor receptor WT1 3-10% Unclear/poor Transcription factor IDH1 3-9% Unclear Epigenetic transcription regulation PTPN11 3-5% Intermediate Signal transduction C-KIT 2-6% (high in CBF leukemia) Unfavorable in CBF leukemia Growth factor receptor CBL <2% (16% in inv16) Unclear Signal transduction

22 Gene Frequency Gene function TET % Epigenetic regulation ASXL1 15 % Epigenetic regulation RUNX1 15 % Transcription Factor SF3B % (up to 80% in RARS-T) Splicing Factor CSF1R 10-15% Growth factor receptor NRAS(KRAS) 10-15% Signal Transduction TP53 10 % Transcription factor, apoptosis U2AF35 10 % Splicing Factor SRSF2 10% Splicing Factor Biologische classificatie van MDS EZH2 5-10% Epigenetic regulation DNMT3A 5-8% Epigenetic regulation IDH1 5-7 % Epigenetic regulation ATRX 5% Epigenetic regulation JAK2 5% Signal Transduction C/EBPa 5% Transcription Factor NPM1 3-5% Nuclear import, apoptosis IDH2 3-5% Epigenetic regulation MLL 3% Epigenetic regulation ETV6 3% Transcription Factor UTX 3% Epigenetic regulation FLT-3 2% Growth factor receptor ZRSR2 1-3% Splicing Factor PRPF40B 2% Splicing Factor SF3A1 1-2% Splicing Factor SF1 1-2% Splicing Factor CBL 1-2% Signal Transduction U2AF65 0-1% Splicing Factor

23 Biologische classificatie van gemuteerde genen in AML en MDS I: growth factor receptors extracellular II: signal transduction molecules cytoplasm III:cell cycle nucleus IV:transcription factors VI: Epigenetic regulators V:Apoptosis VII: RNA splicing factors

24 Biological classification of genes mutated in MDS with a frequency of > 1% I: Growth factor receptors: CSF1R / FLT3 II: Signaltransduction: RAS / JAK2 / CBL III: Transcription factors: C/EBPa/ RUNX1 / ETV6 IV: Cell cycle regulators: V: Apoptosis: TP53 / NPM1 VI: Epigeneticregulators: TET2 / IDH1 / IDH2 / DNMT3A / EZH2 / ATRX/ MLL / ASXL1 / UTX VII: Spliceosome: SF3B1 / SF1 / PRPF40B / U2AF65 / U2AF35/ SF3A1 / SRSF2 / ZRSR2

25 Mutaties in hetzelfde biologisch pad komen nbiet samen voor bij een patient IDH % IDH-2 2-oxoglutarate DNMT3A 5% TET % Transcription repression

26 Campbell Blood 2013 The long tail of cancer (MDS)

27 Campbell Blood 2013 Bij individuele patienten meestal meerdere mutaties

28 Walter NEJM 2012 Clonale evolutie van verschillende subcloons

29 Walter NEJM 2012 Clonale evolutie van verschillende subcloons

30 Conclusies en kanttekeningen Next generation sequencing zal in de komend jaren snel zijn intrede doen. 2% van ons genoom is coderend voor eiwitten. Belang van overige sequenties (mirna, lncrna, SNPs, Epigenetische code etc) is nog lang niet opgehelderd Voor directe klinische praktijk is nog lang niet altijd duidelijk wat het nut van alle mogelijke informatie is: nut staat of valt bij mogelijkheid om therapie op basis van de verkregen informatie aan te passen. Dit wordt lastiger naarmate er meer sub- groepen ontstaan. Belang van subclones en clonale evolutie Hopelijk convergentie door begrip van biologische werkingsmechanismen van mutaties, waardoor groepering van mutaties mogelijk wordt Eerst verbreding, daarna versmalling? Komende 10 jaar: hardware heeft zeer korte afschrijvingstijd Gezien dalende kosten, stijgend throughputen stijgende complexiteit: dom screenen, slim analyseren