Whole genome sequencing op direct materiaal voor virus detectie en typering. Janette Rahamat-Langendoen, arts-microbioloog

Transcriptie

1 Whole genome sequencing op direct materiaal voor virus detectie en typering Janette Rahamat-Langendoen, arts-microbioloog

2

3 Acute luchtweginfecties Belangrijke oorzaak van ziekenhuis opnames bij kinderen < 5 jr; geassocieerd met morbiditeit en mortaliteit > 65% veroorzaakt door virussen Ontwikkelingen in moleculaire diagnostiek: verbetering in detectie van virale oorzaken van luchtweginfectie, maar in aanzienlijk deel van luchtweginfecties nog steeds geen oorzaak te vinden Gebruik van WGS in virale diagnostiek: Verbreden palet aan virussen dat gedetecteerd kan worden Detectie en karakterisering in 1 stap

4 Gedetecteerde pathogenen in kinderen met CAP waarvoor ziekenhuisopname, VS, Jain S et al. N Engl J Med 2015;372:

5 Gedetecteerde pathogenen in volwassen met CAP waarvoor ziekenhuisopname, VS, Jain S et al. N Engl J Med 2015;373:

6 De studie Doel: bepalen viroom direct op klinisch materiaal met behulp van multiplex whole genome sequencing als proof of principle voor het gebruik van deep sequencing technieken in virale diagnostiek Patiënten: respiratoir materiaal (nasofarynxspoelsel, sputum) van 8 pediatrische patiënten met matige tot ernstige luchtweginfectie twee controle samples van gezonde volwassenen alle samples eerder getest met routine RT-PCR voor respiratoire pathogenen (14 virussen, 2 bacteriën) Zoll et al. J Clin Virol 2015 May;66:6-11

7 sample no. materiaal leeftijd (dgn) geslacht symptomen ernst routine diagnostiek PCR Ct 1 sputum 10 v apnoe O 2 negatief 2 sputum 42 m apnoe en bradycardie MV HRV 25 3 sputum 122 m resp insufficientie O 2 hmpv 23 4 sputum 4 m respiratoire problemen negatief 5 NPA 329 v milde dyspnoe negatief 6 NPA 827 v matige dyspnoe O 2 RSV sneltest 7 NPA 406 v matige dyspnoe O 2 HRV >40 8 NPA 158 v O 2 negatief 9 NPA volw m negatief 10 NPA volw m negatief

8 Basis: -Isolatie DNA/RNA -verrijken van virale partikels (depletie van humaan rrna) -Whole genome amplificatie en sequencing (IonTorrent) -Analyse van sequenties (humaan, viraal, bacterieel) -Assembly van virale genoom

9 Resultaten Sample no Aantal reads Humaan Bacterieel Viraal Onbekend

10 RSV-A HRV-C HRV-C HRV-A Other enteroviruses Anellovirus HRV-A38 hmpv

11 Sample no. materiaalsoort routine PCR Ct waarde WGS resultaten 1 sputum negatief negatief 2 sputum HRV 25 HRV-A38 3 sputum hmpv 23 hmpv 4 sputum negatief negatief 5 NPA negatief HRV-C 6 NPA RSV sneltest RSV-A 7 NPA HRV >40 HRV-C 8 NPA negatief negatief 9 NPA negatief negatief 10 NPA negatief negatief Sample no 5: Analyse van virale sequentie wees op verschillende mismatches tussen forward primer van routine PCR en target sequentie in 5 -UTR van HRV-C

12 Conclusie WGS op direct materiaal bevestigt de resultaten gevonden met routine PCR: vergelijkbare gevoeligheid Eén sample, in routine getest als negatief, was HRV-C positief m.b.v. WGS: Variabiliteit van HRV target regio voor detectie met PCR Voorkeur voor sequentie-onafhankelijke detectiemethodes (zoals WGS) Met WGS verbreding palet aan virussen dat gedetecteerd kan worden, plus detectie en karakterisering van virale verwekkers in 1 stap (versnelt het diagnostisch proces) HRV en RSV karakterisering Detectie van meerdere virussen in 1 sample (HRV-C en verschillende soorten enterovirus) Anelloviruses:

13 Conclusie Anellovirus: Veel voorkomend in populatie, meeste mensen worden geïnfecteerd in eerste maand na geboorte Drie genera: Torque-teno virus Torque-teno-like mini virus Torque-teno-like midi virus Klinische relevantie? Associatie met luchtweginfectie? Nog niet duidelijk

14

15 Norovirus RNA virus in familie van Caliciviridae, zonder envelop Genus norovirus: 5 genogroepen, 3 kunnen mens infecteren GI, GII, GIV Genogroep verdeeld in genotypes GII.4 Mens is de enige gastheer Genogroup I Genogroup IV GII.4 Meest voorkomende oorzaak van gastro-enteritis. 5-31% van patiënten opgenomen met gastro-enteritis. 5-36% van poliklinische patiënten met diarree Genogroup II Genotype II.4 epidemiologisch wat verschillend:. Oorzaak van grote uitbraken. Antigene drift: opkomende nieuwe varianten, minder immuniteit

16 De studie Proof of principle : met behulp van WGS in 1 stap - Betrouwbare detectie norovirus - Accurate genotypering Epidemiologische surveillance (globaal/regionaal) Outbreak management (ziekenhuis) Bronopsporing (GGD/ ziekenhuis) Bavelaar et al. J Clin Virol Nov;72:122-5

17 Methode 10 feces samples, bekend norovirus + in routine PCR 8 hiervan eerder getypeerd (UMC Groningen) obv ORF 2 (capside); geselecteerd op basis van hoogste prevalentie 2 samples met onbekend genotype van norovirus uitbraak geriatrie RadboudUMC

18 Methode

19 Resultaten + coxsackie B1

20 Resultaten GII.4 Ook op feces leidt WGS tot: -betrouwbare detectie van verwekker -accurate genotypering

21 Rol WGS in routine diagnostiek? Voordelen: - detectie en karakterisering in 1 proces (surveillance, outbreak management) - tijdswinst - detectie andere virussen/onbekende virussen Uitdagingen: - kosten - getraind personeel - klinische interpretatie: pathogeen of niet

22 Radboudumc Afdeling Medische Microbiologie Jan Zoll Herjan Bavelaar Willem Melchers Afdeling Kindergeneeskunde Inge Ahout Jop Jans Gerben Ferwerda Marien de Jonge UMC Groningen Afdeling Medische Microbiologie Bert Niesters University of Aberdeen Adilia Warris

23