STATE OF THE ART MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK VAN VIRALE EN ATYPISCHE LUCHTWEGPATHOGENEN

Transcriptie

1 MICROLABBLAD informatiebulletin van het laboratorium microbiologie twente achterhoek Het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek wenst alle lezers een heel goed en gezond 2006 toe! Om het jaar goed in te zetten vindt u twee artikelen over nieuwe detectiemethoden. De eerste is beschreven door Ron Hendrix. Zijn artikel gaat over de moleculaire diagnostiek van virale en atypische luchtwegpathogenen. Dit onderzoek is per direct aan te vragen. Vervolgens vindt u een uitleg over de real-time PCR. Bert Mulder geeft u informatie over uitbreiding van het fecesonderzoek op darmpathogenen met Cryptosporidium. Dit zal met ingang van februari 2006 doorgevoerd worden. In 2005 is veel werk verzet om elke keer een goed MicroLabBlad uit te geven. Voor 2006 is deze inzet niet anders. U kunt uw vragen, opmerkingen en suggesties aan ons mailen: info@labmicta.nl. inhoudsopgave State of the art moleculaire diagnostiek van virale en atypische luchtwegpathogenen 216 Uitleg real-time PCR 222 Fecesonderzoek darmpathogenen wordt uitgebreid met Cryptosporidium 225 colofon Micro Lab Blad is een uitgave van: Redactie: S.D. Meijer E. Roelofsen Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek Burgemeester Edo Bergsmalaan AD Enschede Telefoon: (053) , Telefax: (053) info@labmicta.nl, Website: Openingstijden: ma. t/m vr. 08:00-17:00 uur, za. en zo. 10:00-11:00 uur Zesde jaargang Nummer 1 Januari 2006

2 STATE OF THE ART MOLECULAIRE DIAGNOSTIEK VAN VIRALE EN ATYPISCHE LUCHTWEGPATHOGENEN R ON H ENDRIX Samenvatting Broncho-pneumonieën kunnen door diverse organismen veroorzaakt worden waaronder virussen en andere intracellulair verblijvende organismen. Vooral bij kinderen is de oorzaak meestal viraal, maar ook bij volwassenen blijkt dat in 15-20% van de broncho-pneumonieën een virale verwekker aangetoond kan worden. Ook aan het andere einde van het spectrum, de al dan niet immuungecompromitteerde oudere patiënt, blijken virale verwekkers een steeds grotere rol te gaan spelen (tabel 1 en 2). Kinderen Volwassenen Ouderen (*1) Immuundisfunctie (*2) Frequent Rhinovirussen Herpesviridae (Epstein-Barr Virus, Rhinovirussen Cytomegalovirus, Mycoplasma pneumoniae Varicella-zoster virus, Herpes Simplex virus) Zeldzaam Coronavirussen Coronavirussen Coronavirussen Enterovirussen Enterovirussen Rhinovirussen Rhinovirussen Herpes Simplex Virus Herpes Simplex Virus Chlamydia pneumoniae Chlamydia pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Tabel 1: virale verwekkers pneumonie *1 Hieronder vallen vooral ouderen met diabetes mellitus, nierfunctiestoornissen en COPD *2 Hieronder vallen transplantatiepatiënten en oncologische patiënten Diagnostiek van deze verwekkers blijft echter een moeizame zaak. Hoewel er in het medisch microbiologisch laboratorium diverse onderzoekstechnieken beschikbaar zijn (virale kweek, antigeendetectie, serologie) blijft een diagnose vaak uit, of komt veel te laat om binnen het behandelplan nog van nut te kunnen zijn. Vanaf januari 2006 biedt het Laboratorium Microbiologie een nieuwe moleculaire detectiemethode aan: een real-time PCR. Deze is in nauwe samenwerking met dr. Rob Schuurman, moleculair bioloog werkzaam binnen ons laboratorium maar vooral ook binnen de vakgroep medische microbiologie van het Universitair Medisch Centrum Utrecht, opgezet. Deze moleculaire detectiemethode maakt het mogelijk binnen twee werkdagen, de aan- of afwezigheid van,,, Rhinovirus, Parainfluenzavirus, Humaan Metapneumovirus,, Chlamydia pneumonia en Mycoplasma pneumonia te bepalen in respiratoire materialen. 216

3 Syndroom Verkoudheid Pharyngitis Kroep Bronchiolitis Pneumonie Frequente oorzaak Rhinovirus Coronavirus Herpes Simplex Virus Enterovirus Epstein-Barr Virus Zeldzame oorzaak Enterovirus Rhinovirus Coronavirus Coronavirus Rhinovirus Rhinovirus Epstein-Barr Virus Tabel 2: virale verwekkers pneumonie naar klinisch syndroom Virale diagnostiek Binnen de virologie zijn er van oudsher 3 standaardtechnieken beschikbaar: antigeendetectie in klinische materialen, virale kweek en serologie. Vooral de laatste 15 jaar zijn deze technieken fors aangevuld met een vierde lijn: de moleculaire diagnostiek. De oudste techniek is de viruskweek in cellijnen waarbij klinisch materiaal op een cellaag wordt gebracht die vervolgens dagen tot weken wordt geïncubeerd. Om de dag worden deze cellen bekeken op het ontstaan van een virus specifiek cytopathogeen effect (CPE). Vaak duurt het echter meer dan een week voordat er iets zichtbaar is. Dit probleem is gedeeltelijk opgelost met de komst van de monoklonale antilichamen waarbij vaak al na 2 à 3 dagen gekeken kan worden naar de mogelijke aanwezigheid van een specifiek virus, de zogenaamde versnelde virale kweek (figuur 1, 2 en 3): Figuur 1: Figuur 2: Herpes Simplex in weefselkweek Cytomegalovirus in weefselkweek Figuur 3: Rhinovirus directe fluorescentie MICROLABBLAD 217

4 Een aantal virussen, waaronder Herpes Simplex Virus (HSV), Varicella Zoster Virus (VZV) en Cytomegalovirus (CMV), is hiermee goed aantoonbaar. Het blijft echter een technisch moeilijk proces dat ook veel eisen stelt aan de afname en transport van het klinisch materiaal. Tevens is de opbrengst van deze techniek voor met name de respiratoire virussen nog steeds teleurstellend. Een alternatief is ontwikkeld in de vorm van de directe virusdetectie in klinische materialen met behulp van monoklonale antilichamen. Vooral het (RSV) kan hiermee snel en betrouwbaar worden aangetoond. De techniek heeft een zeer goede positief voorspellende waarde, echter de negatief voorspellende waarde is slecht. Dit komt omdat de hoeveelheid virus die in klinisch materiaal aanwezig is erg laag kan zijn waardoor het virus met deze technieken niet aantoonbaar is, terwijl het wel duidelijk symptomen veroorzaakt. De laatste standaardtechniek, de serologie, is uiterst krachtig in het aantonen van doorgemaakte infecties, maar laat je ook weer in de steek bij het aantonen van een acute respiratoire infectie. De meest gebruikte techniek hiervoor is de complement binding reactie (CBR). Het probleem bij deze techniek is dat er 2 serummonsters noodzakelijk zijn. Eén tijdens de acute fase van de ziekte, en één 10 tot 14 dagen later. Het spreekt voor zich dat de uitkomst nog maar weinig toevoegt aan het acute klinische probleem, hooguit aan het begrip achteraf. De moleculaire technieken hebben inmiddels bewezen een uiterst krachtig alternatief te zijn voor het aantonen van acute infecties vooral bij die aandoeningen waar kweek en/of serologie erg lang op zich laat wachten. Zo kan de diagnose Chlamydia trachomatis en tuberculose met hoge betrouwbaarheid met een PCR binnen 2 werkdagen worden aangetoond of verworpen. Het ligt dan ook voor de hand deze technieken ook op het gebied van de virale respiratoire infecties toe te passen. Dit is echter door de grote diversiteit aan betreffende virussen niet zo gemakkelijk. Moleculaire detectie respiratoire virussen Zoals uit tabel 1 en 2 valt op te maken, speelt een behoorlijk aantal virussen een rol bij de frequent voorkomende respiratoire infecties. Tevens zijn er nog 2 andere organismen die ook nog een rol kunnen spelen bij deze infecties namelijk Chlamydia pneumoniae en Mycoplasma pneumoniae. Het moleculair aantonen van al deze verwekkers met een standaard PCR met alle erbij horende controles zou zeer veel werk kosten en vrijwel onbetaalbaar zijn. De komst van de realtime PCR heeft daar veel verandering in gebracht. Toch is het nog een moeilijke taak omdat voor iedere verwekker apart een detectiemethode opgezet moet worden. Haalbaar is de detectie van de organismen uit tabel 3: Organisme 1 t/m 4 A en B Humaan Metapneumovirus Rhinovirus Chlamydia pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Taxonomische groep Orthomyxoviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae Paramyxoviridae Paramyxoviridae Picornaviridae Adenoviridae Target RNA RNA RNA RNA RNA RNA DNA DNA DNA Tabel 3: voor genoemde micro-organismen is detectie door middel van real-time PCR mogelijk 218

5 Geschikte respiratoire materialen (zie verder) dienen zo spoedig mogelijk na afname op het Laboratorium Microbiologie afgeleverd te worden. Eenmaal binnengekomen, wordt direct RNA en DNA uit deze materialen geïsoleerd. Dit gebeurt volledig geautomatiseerd en gestandaardiseerd met behulp van de Magna-pure (Roche Diagnostics) (figuur 4): Figuur 4: Magna-pure (Roche Diagnostics) Daarna wordt het virale RNA omgezet in DNA zodat het in de real-time PCR verwerkbaar is. Het real-time platform waarop wij werken is de ABI-prism (Applied Biosystems) (figuur 5): Figuur 5: ABI-prism (Applied Biosystems) Afhankelijk van het moment van binnenkomst van de klinische materialen duurt dit hele proces 1 of 2 werkdagen. Komen de materialen s morgens vroeg binnen dan kan het proces dezelfde dag afgerond worden, anders duurt het tot de volgende middag. MICROLABBLAD 219

6 Resultaten tot nu toe Binnen het Universitair Medisch Centrum Utrecht loopt deze aanpak al een jaar en de behaalde resultaten zijn zeer goed. Hoewel de data nog verder geanalyseerd en gepubliceerd moeten worden, was Rob Schuurman bereid een tipje van de sluier op te lichten. Let wel: het betreft nog premature data en iedere detaillering ontbreekt! Het resultaat is echter indrukwekkend. Zowel binnen een patiëntenpopulatie van het Academisch Ziekenhuis Utrecht (AZU) als het Wilhelmina Kinderziekenhuis (WKZ), beiden onderdeel van het Universitair Medisch Centrum Utrecht, zijn respiratoire materialen met behulp van een virale kweek en met behulp van de nieuwe real-time PCR geanalyseerd (tabel 4): Techniek Aantal materialen Kweek positief Real-time PCR positief Dubbelinfecties AZU 88 4 ( 5%) 51 (58%) 10 ( 9%) WKZ (18%) 133 (70%) 57 (24%) Tabel 4: resultaten vergelijking kweek en real-time PCR binnen het Universitair Medisch Centrum Utrecht (AZU = Academisch Ziekenhuis Utrecht, WKZ = Wilhelmina Kinderziekenhuis Utrecht) Uit beide populaties blijkt de gevoeligheid van de real-time PCR vele malen hoger dan de gevoeligheid van de kweek. Tevens valt op dat er bij diverse patiënten sprake is van dubbelinfecties. De gevonden virussen staan weergegeven in tabel 5: Type verwekker Rhinovirus Coronavirus Humaan Metapneumovirus Chlamydia pneumoniae Mycoplasma pneumoniae AZU 20 % 18 % 11 % 8 % 5 % 3 % 1 % 1 % WKZ 28 % 10 % 31 % 13 % 6 % 7 % 9 % 3 % Tabel 5: verdeling verwekkers respiratoire beelden Het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek is de mening toegedaan dat deze resultaten zo goed zijn, dat deze test nu standaard aangeboden moet worden. Indicatiegebieden Zoals al uit de tabellen blijkt, komen virale infecties vooral bij kinderen maar zeker ook redelijk frequent bij volwassenen voor. Deze real-time PCR kan dan ook aangevraagd worden bij patiënten met een niet- typisch beloop van een luchtweginfectie. Dus afwijkend van het typische beloop van een bacteriële pneumonie, die voornamelijk gekenmerkt wordt door een febriele temperatuur, een duidelijke lobaire pneumonie op de X-thorax en een duidelijke leucocytose met vooral granulocyten in de differentiatie. 220

7 Aanleveren respiratoire materialen Lang niet alle respiratoire materialen zijn even geschikt voor deze techniek. Zo heeft bij een volwassene een broncho-alveolaire lavage (BAL) de voorkeur. Bij kleine kinderen is een neusspoelsel, zoals nu reeds afgenomen wordt bij verdenking op een RSV-infectie, uitstekend materiaal. Echter alle andere respiratoire materialen (sputum, bronchiaalsecreet en indien niet anders mogelijk een nasopharynx-wat) zijn met deze techniek te analyseren. Voorwaarde is wel een snel transport naar ons laboratorium. Het huidige aanvraagformulier voorziet nog niet in de mogelijkheid dit moleculair respiratoir panel direct aan te kruisen. Wilt u het echter aanvragen, schrijf dan duidelijk bij de klinische gegevens: moleculair respiratoir panel. Tevens is het verstandig de dienstdoende arts-microbioloog van de aanvraag op de hoogte te brengen. Als aan bovenstaande voorwaarden is voldaan, kan de uitslag binnen 2 werkdagen bekend zijn. Uiteraard worden positieve bevindingen direct doorgebeld naar de aanvrager. U kunt dit panel vanaf nu aanvragen! MICROLABBLAD 221

8 UITLEG REAL-TIME PCR R ON H ENDRIX Zoals u weet, vormt de PCR (polymerase chain reaction) de kerntechniek binnen de moleculaire detectie van infectieziekten. Met deze techniek (figuur 1.) kunnen relatief simpel kleine hoeveelheden DNA in vitro vermeerderd worden tot een hoeveelheid die met diverse andere technieken aantoonbaar is. Juist in deze andere technieken zit het probleem. Ze zijn per definitie noodzakelijk om de specificiteit van de PCR te borgen en kosten extra veel tijd en dus geld. DNA-DNA hybridisatie (figuur 2) is de sleutel voor deze specificiteit. Een oplossing hiervoor is de hybridisatiestap niet meer na de PCR te doen, maar tijdens de PCR zodat gedurende de reactie in real-time een eventueel positief signaal gemeten kan worden. Hierdoor combineer je de specificiteit van een hybridisatie achteraf met de snelheid van het in real-time meten. Een gemiddelde real-time PCR is in de regel binnen 2 uur klaar. Figuur 1: standaard PCR 222

9 Bij een PCR binden (hybridiseren) 2 virus specifieke primers aan complementaire stukken DNA, dus van de target afkomstige stukken DNA. Door het target-dna enkelstrengs te maken (denatureren) kunnen de primers op deze heel specifieke plaatsen binden. Deze primers vormen het startpunt van de DNA-synthese waardoor nieuw van het virus afgeleid DNA gevormd wordt. Door dit proces 40 maal te herhalen (amplificatie) ontstaan onder ideale omstandigheden 240 stukjes nieuw materiaal die gemakkelijk met vervolgtechnieken aantoonbaar zijn. Figuur 2: nucleinezuur hybridisatie DNA en RNA zijn opgebouwd uit 5 bouwstenen. DNA uit de bouwstenen A C G en T en RNA uit de bouwstenen U A G en C waarbij er altijd 2 bouwstenen ernaar streven aan elkaar te binden. Dit zijn A aan U en/of T en G aan C. Dus hele ketens DNA en/of RNA zullen ernaar streven altijd aan een totaal identieke maar complementaire DNA-keten te binden oftewel te hybridiseren. Als de DNA-volgorde van een organisme bekend is, kan altijd een stukje DNA gekozen worden dat uniek is voor dat organisme. Dit stukje DNA kan in het laboratorium gemaakt worden. Als dat toegevoegd wordt aan de PCR-reactie na amplificatie zal het er altijd naar streven te binden aan een stuk target-dna van dat specifieke organisme, indien dit natuurlijk aanwezig is. Is dit niet aanwezig dan zal het ook niet binden. De bindingsreactie kan zichtbaar gemaakt worden door het nagemaakte stukje DNA te voorzien van een vlaggetje. MICROLABBLAD 223

10 Door naast de primers nog een specifiek stukje DNA met een slim vlaggetje aan de PCR-reactie toe te voegen, blijkt het mogelijk de reactie in real-time te volgen. Dit specifieke stukje DNA bevat naast het slimme vlaggetje, in moleculaire termen een fluorescerend label, ook nog een ander vlaggetje dat voorkomt dat het fluorescerend label licht gaat uitzenden. Dit andere vlaggetje heet in moleculaire termen een quencher. Echter, wanneer een organisme waarnaar gezocht wordt in het materiaal aanwezig is, zal dit gevlagde stukje DNA binden aan het specifieke DNA en later uit elkaar vallen, waarbij de quencher los komt van het fluorescerende label, zodat er licht uitgestraald kan worden. Dit uitstralen van licht is een maat voor het positief worden van de PCR. Figuur 3: real-time PCR 224

11 FECESONDERZOEK DARMPATHOGENEN WORDT UITGEBREID MET CRYPTOSPORIDIUM B ERT M ULDER Ondanks de aanwezigheid van Cryptosporidium wordt deze diagnose veelal niet gesteld tijdens het bacteriologisch fecesonderzoek op darmpathogenen. Door het systematisch toevoegen van dit onderzoek kan de diagnose cryptosporidiosis veel vaker worden gesteld. In de zomer van 2005 is binnen het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek een onderzoek verricht naar de diagnostiek van Cryptosporidium in feces. In dit onderzoek werden verschillende diagnostische methoden vergeleken en de resultaten zullen in 2006 worden gepresenteerd op (internationale) congressen en gepubliceerd in de literatuur. De onderzoeksresultaten hebben echter ook directe consequenties voor de fecesdiagnostiek op darmpathogenen binnen het laboratorium. Van de 515 onderzochte fecesmonsters waren er namelijk 37 positief voor Cryptosporidium. Dit percentage van boven de 7% is veel hoger dan gebruikelijk voor fecesonderzoek dat gericht is op verwekkers als bijvoorbeeld Shigella en Yersinia en kan wedijveren met het percentage positieve onderzoeksresultaten voor veel voorkomende pathogene verwekkers als Campylobacter en Salmonella. De conclusie van het onderzoek luidt dat cryptosporidiose tegenwoordig beschouwd moet worden als een protozoaire darmpathogeen bij de mens, ook indien het immuunsysteem volledig intact is. Figuur 1. Cryptosporidium Opvallend was dat veel van de positieve monsters alleen voor fecesonderzoek binnen het laboratorium bacteriologie waren ingezonden en niet voor onderzoek op darmparasieten. Toch hoeft dit geen verwondering te wekken, aangezien de incubatietijd van een Cryptosporidium-infectie tussen MICROLABBLAD 225

12 de 2 en 10 dagen ligt en derhalve de infectie eerder tot het klinische beeld van een (sub)acute gastro-enteritis leidt dan tot het beeld van een chronische parasitaire infectie. Voeg daarbij het epidemiologische feit dat Cryptosporidium-infecties in Nederland niet alleen in de maanden augustus en september een piek laten zien, en dat daarnaast een tweede jaarlijks terugkerende piek in incidentie gezien wordt in de maanden maart en april, en tussen beide pieken ook patiënten met Cryptosporidium-infecties worden gezien, en het zal geen verbazing wekken dat het Laboratorium Microbiologie Twente Achterhoek heeft besloten met ingang van februari 2006 een onderzoek op Cryptosporidium toe te voegen aan het routine fecesonderzoek op darmpathogenen. Vooralsnog zal onderzoek op Cryptosporidium alleen worden uitgevoerd op ingezonden (water)dunne en brijige fecesmonsters. De opbrengst en resultaten van de toevoeging van deze vorm van diagnostiek aan het onderzoek op darmpathogenen zal na een jaar worden geëvalueerd en (opnieuw) met de aanvragers worden gecommuniceerd. Bij personen met een goed werkend immuunsysteem is het beloop van de Cryptosporidiuminfectie vergelijkbaar met bijvoorbeeld de gastro-enteritis veroorzaakt door Campylobacter, namelijk self-limiting. In de praktijk behoeven derhalve lang niet alle patiënten medicamenteus te worden behandeld. Indien eventueel toch medicamenteuze behandeling geïndiceerd is, kan het beste gekozen worden voor therapie met paromomycine 3 dd 10 mg/kg po, gedurende 1-4 weken.