Familiaire Hypercholesterolemie: een kijkje in de keuken van de DNA-diagnos=ek

Transcriptie

1 Filiaire Hypercholesterolemie: een kijkje in de keuken van de DNA-diagnos=ek Joep Defesche Klinische Gene0ca Academisch Medisch Centrum, Amsterd Roermond, 16 mei 2017

2 Nouvelle Cuisine reduce to the MAX zero excess Next Genera*on Sequencing: reduce to the MAX maximal excess NGS

3 wat wil men in de diagnos*ek? meer genen meer pa*ënten maximale nauwkeurigheid minimale kosten minimale turn-around-*me minimale ruimte

4 Next-genera=on Sequencing voor lipiden diagnos=ek gouden standaard: Sanger sequencing A A

5 NGS plaborms

6 2005: : Solid 2011: Ion Torrent 2015: MiSeq

7 work flow NGS DNA fragmenteren library maken (barcodes) materiaal pa*ënten poolen hybridiseren (1) captures maken opzuiveren en verrijken (PCR) hybridiseren (2) opzuiveren sequencen MiSeq kwaliteitscontrole data analyse week 1 week 2 week 3 valida*e (Cartagenia)

8 Ultrasone fragmenta*e DNA

9 library maken = barcode

10 een kijkje in de keuken van de DNA-diagnos=ek captures maken Nimblegen sequence capture 60-mer DNA probes

11 captures maken Library prep Sple prep Hybridiza*e pool sples LM-PCR Bioinforma*ca: barcode iden*fica*e en mapping Sple 1 Index 1 Sple 1 Sple 2 Sple 3 Sple 4 Index 2 Index 3 Index 4 1 sple (N Indexen) 1 sple (N Indexen) Sple 2 Sple 3 Sple 4 Sple 5 Index 5 Sple 5 Sple N Index N Sple N

12 wat maakt Next Genera*on Sequencing next genera*on? niet: het sequencing combina*e van beproefde methoden Sanger-, pyro-, en solid phase-sequencing wel: de mogelijkheid om een groot aantal DNA fragmenten per pa*ënt en per gen van elkaar te onderscheiden: unieke pa*ënt-specifieke barcodes adaptors linkers gen-specifieke captures

13 Illumina: Sequencing by synthesis

14 Illumina MiSeq

15 kwaliteitscontrole, data analyse, valida*e

16

17

18

19

20 CNV CALLS 17D2956 Z-score Gen Freq Mean Std chr19: ,9 LDLR 12/1651 OK OK NM_ LDLR E7-10 del chr19: ,1 LDLR 9/1651 OK OK NM_ LDLR E7-10 del chr19: ,5 LDLR 8/1651 OK OK NM_ LDLR E7-10 del chr19: ,6 LDLR 9/1651 OK OK NM_ LDLR E7-10 del dele*e exon 7, 8, 9 en 10

21

22 gen panel voor dyslipidemie fenotype gen cdna exonen intron seq. overerving hypercholesterolemie LDLR dominant APOB dominant PCSK dominant LIPA recessief LDLRAP recessief ABCG recessief ABCG recessief STAP dominant hypo-alfalipoproteinemie ABCA dominant LCAT dominant APOA dominant hyper-alfalipoproteinemie SCARB dominant CETP dominant LIPG (EL) dominant LIPC (HL) dominant APOC dominant hypertriglyceridemie LPL dominant APOC dominant APOA dominant GPI-HBP dominant LMF dominant APOE dominant / recessief chylomicron reten*on disease SAR1B recessief hypocholesterolemie ANGPTL dominant MTTP dominant IDOL (MYLIP) dominant APOB dominant PCSK9 dominant cerebrotendineuze xanthomatose CYP27A recessief sta*ne resisten*e CYP7A recessief myopathie op sta*nes SLCO1B dominant totaal

23 rapportage indica*e: hypercholesterolemie, hypertriglyceridemie, filiaire muta*e etc. uitgevoerd onderzoek: meestal NGS dyslipidemie panel 29 genen uitslag: wel of geen muta*e gevonden op basis van indica*e aanvullende bevindingen: muta*es niet in rela*e tot indica*e toelich*ng methode en kwaliteit

24 aanvullende bevindingen niet gerapporteerd: varianten met onduidelijke klinische relevan*e dragerschap muta*es recessieve aandoeningen bijvoorbeeld: LIPA, CYP27A1, ABCG5/G8, CYP7A1 wel gerapporteerd: klinisch relevante varianten m.b.t. gezondheidsrisico en behandeling vaak: hypertriglyceridemie, laag HDL, sta*ne intoleran*e waar mogelijk literatuurverwijzingen

25 rapportage Opmerkingen Er zijn geen aanwijzingen voor pathogene muta*es in de resterende met dyslipidemie geassocieerde genen met NextGen sequen*e en CNV analyse. Alle coderende exonen van de 29 in de toelich*ng genoemde genen, inclusief de 20 flankerende intron nucleo*den, zijn geanalyseerd met sequen*e analyse. Met deze techniek kunnen puntmuta*es en kleine dele*es of inser*es worden gedetecteerd. Er is CNV analyse gedaan om exon dele*es of duplica*es te kunnen iden*ficeren. De aanwezigheid van muta*es buiten de geanalyseerde fragmenten kan echter niet worden uitgesloten. Alleen pathogene muta*es worden gerapporteerd. Muta*es waarvan de klinische relevan*e niet duidelijk is worden niet gemeld. Toelich=ng Methode en kwaliteit: Apparaat: MiSeq Experiment nr: DL_ (experiment in Genesis) Chemie: MiSeq Reagent Kit v2, 2 x 150 bp Analyse progrma s: BWA-MEM(0.7.5), GenomeAnalysisTK-2.8 Haplotype Caller, Cartagenia v Verrijking target sequen*es: Nimblegen SeqCap easy choice (OID42813) van versie DLv2. Minimale coverage (met minimaal MAPQ20 en BaseQ20) van 30 reads Gemiddelde ver*cale coverage (met minimaal MAPQ20 en minimaal BaseQ20): 650 ± 139, Sanger sequencing is gebruikt voor beves*gingen van gevonden muta*es en analyse van gebieden met coverage lager dan 30 reads. Op grond van valida*e experimenten schanen wij de gevoeligheid van de gecombineerde test (NextGen en Sanger) voor nucleo*de subs*tu*es en dele*es, inser*es en duplica*es tot 68 nucleo*den op >99% (100% in onze valida*e).

26 Next Genera*on Sequencing met Illumima/MiSeq Dyslipidemie pakket senvarng veel genen, veel pa*ënten lange hands-on *jd: 3 weken controle, sequencing en analyse: >1 week snp check 100% coverage; niet bij-sangeren inclusief CNV analyse (dele*es, duplica*es) geen beves*ging analyse: op geleide van fenotype? kosten: 3x basis tarief