NGS testen in de neuro-oncologie uitdagingen en (on)mogelijkheden

Transcriptie

1 NGS testen in de neuro-oncologie uitdagingen en (on)mogelijkheden Erik Jan Dubbink Klinisch Moleculair Bioloog in de Pathologie Department of Pathology Erasmus MC, Rotterdam 9e Bijeenkomst Werkgroep "Moleculaire Diagnostiek in de Pathologie" , Utrecht

2 Disclosure belangen spreker GEEN

3 Histologische classificatie van gliomas Glioblastoma Oligodendroglioma Astrocytoma

4 Moleculaire classificatie van gliomas Glioblastomas Oligodendrogliomas Astrocytomas Killela P J et al. PNAS 2013;110:

5 Moleculaire diagnostiek van het glioom Diagnostisch mutatiespectrum + co-deletie 1p/19q Prognostisch co-deletie 1p/19q Predictief co-deletie 1p/19q, MGMT methylering, EGFR amplificatie, intragene EGFR deletie, PTEN deletie Gecombineerde mutatie en copy-number-variatie detectie NGS analyse one size fits all

6 Custom-made neuro-oncologie panel Complete genen ATRX, CIC, EGFR, FUBP1, NOTCH1, PTEN, TP53 Hot spots regio s BRAF, H3F3A, IDH1, IDH2, PIK3CA Detectie van MGMT methylering nog niet mogelijk Genomische regio s 1p, 7p, 7q, 10q, 19q

7 Methodes van diagnostische detectie van LOH FISH fluorescentie in situ hybridisatie MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification Microsatelliet, nucleotide repeat, analyse Microsatelliet analyse NGS en repeats SNP analyse met NGS Ion Torrent platform

8 Ion Torrent platform

9 Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNIPs Single nucleotide polymorphisms (SNPs) zijn een type polymorfismen, natuurlijk voorkomende variaties die betrekking hebben op één basenpaar Allel 1 AAGCCTAGCAC TTCGGATCGTG Allel 2 AAGCTTAGCAC TTCGAATCGTG

10 Single nucleotide polymorphisms (SNPs) SNIPs Single nucleotide polymorphisms (SNPs) zijn een type polymorfismen, natuurlijk voorkomende DNA variaties die betrekking hebben op één basenpaar Ongeveer 1 op ~300 nucleotiden Frequentie waarin varianten voorkomen verschilt per SNP Hoog polymorfe SNPs: minor allel frequentie 0,45-0,50 SNP dichtheid: dichtheid SNPs per kb

11 Custom-made neuro-oncologie panel Complete genen ATRX, CIC, EGFR, FUBP1, NOTCH1, PTEN, TP53 Hot spots regio s BRAF, H3F3A, IDH1, IDH2, PIK3CA Genomische regio s 1p, 7p, 7q, 10q, 19q SNP selectie dbsnp Hoog polymorf Dichtheid 1 SNP per 2-3 mb Totaal 526 amplicons

12 LOH analyse mbv de PGM LOH op basis van SNPs Selectie hoog polymorfe SNPs in regio van interesse (dbsnp) (bv chromosoom 1p en 19q) Genotype bepalen mbv NGS analyse niet informatief G G informatief G C niet informatief Berekenen van percentage variante allel (B-allel of minor allel frequentie) C C

13 LOH analyse mbv de PGM

14 LOH analyse mbv de PGM G G Homozygous Variant G Heterozygous G C C Homozygous Reference C C

15 LOH analyse mbv de PGM G Loss Reference Allele G C Loss Variant Allele G C C G C

16 LOH analyse mbv de PGM G Amplification Variant Allele G G C Amplification Reference Allele G C C G C C

17 LOH analyse mbv de PGM Homozygous Variant Loss Reference Allele Amplification Variant Allele Heterozygous Loss Variant Allele Amplification Reference Allele Homozygous Reference

18 In de praktijk - gevoeligheid

19 Chromosoom 1p, normaal % Variant Chromosomale positie (Mb)

20 Chromosoom 1p verlies, 40% tumor % Variant Chromosomale positie (Mb)

21 Chromosoom 1p verlies, 60% tumor % Variant Chromosomale positie (Mb)

22 Chromosoom 1p verlies, hoog tumor % % Variant Chromosomale positie (Mb)

23 In de praktijk - voorbeelden

24 Partieel verlies 1p

25 Glioblastoom 80% EGFR locus Chromosoom 7

26

27 Leesdiepte plot chromosoom 7

28 Glioblastoom 80% PTEN locus Chromosoom 10q

29 Leesdiepte chromosoom 10

30 Conclusies Lage dichtheid SNP analyse door middel van NGS is een gevoelige methode voor detectie van grote chromosomale afwijkingen imbalance in routine FFPE weefsels De data zijn makkelijk en in één oogopslag te interpreteren Normaal referentieweefsel is niet nodig Zeer goed te combineren met mutatie analyse De analyse kan worden uitgevoerd op zeer kleine hoeveelheden DNA (3-10 ng) Breed toepasbaar en makkelijk te implementeren

31 Uitdagingen Aantonen van amplificaties van EGFR Aantonen van (kleine) homozygote deleties Aantonen van TERT promoter mutaties Aantonen van MGMT methylering

32 Winand Dinjens Ronald van Marion Ina Geurts-Giele Peggy Atmodimedjo Lotte Douglas-Berger Rute Pedrosa Isabelle Meijssen Dorine den Toom Carolina Valente Hein Sleddens Ludo Uytdewilligen Niels Krol Margot van den Akker

33 Dank voor uw aandacht