Cover Page. The handle holds various files of this Leiden University dissertation.

Transcriptie

1 Cover Page The handle holds various files of this Leiden University dissertation. Author: Phylipsen, Marion Title: Development of new technological applications for post- and prenatal diagnosis of the hemoglobinopathies Issue Date:

2 Samenvatting

3

4 Samenvatting Hemoglobinopathieën (Hb-pathieën) zijn recessieve erfelijke vormen van bloedarmoede, gekenmerkt door microcytaire hypochrome anemie. Dragers van Hb-pathie zijn meestal asymptomatisch, maar kinderen van ouders die beiden drager zijn hebben een risico van 25% op een ernstige vorm van Hb-pathie. Hb-pathieën worden veroorzaakt door mutaties in de genen die de sub-eenheden aanmaken om het hemoglobine (Hb) molecuul te vormen, de a- en b-globine genen. Deze mutaties kunnen enerzijds leiden tot een verandering in de primaire structuur van het eiwit waardoor een abnormaal Hb ontstaat. Anderzijds kan een mutatie zorgen voor een verminderde aanmaak van Hb, dit veroorzaakt een thalassemie. Doordat dragers van een Hb-pathie beschermd zijn tegen de ernstige gevolgen van malaria tropica, komen Hb-pathieën het meest voor in gebieden waar malaria heerst of geheerst heeft, zoals de Mediterrane landen, het Midden Oosten en Zuidoost Azië. Echter, door immigratie uit landen met een hoge incidentie komen Hb-pathieën nu ook steeds vaker voor in noord Europese landen. Ongeveer 7% van de totale wereldbevolking is gezonde drager van een Hb-pathie; dit leidt jaarlijks tot de geboorte van ongeveer kinderen met een ernstige vorm van Hb-pathie. In Nederland worden elk jaar ongeveer 60 kinderen geboren die aangedaan zijn met thalassemie major of sikkelcelziekte. Tot nu toe is er, behalve beenmergtransplantatie, nog geen genezing mogelijk voor deze patiënten. Tegenwoordig worden er in endemische landen nationale programma s geïmplementeerd om dragers van een Hb-pathie te identificeren om primaire preventie te faciliteren. Men kan risicoparen dan een geïnformeerde reproductieve keuze aanbieden, waaronder afbreken van de zwangerschap. Zo n nationaal programma ten behoeve van preventie is echter nog niet geïmplementeerd in de Nederlandse zorg. De diagnostiek voor Hb-pathie onderzoek bestaat uit drie verschillende onderdelen, namelijk hematologische, biochemische en moleculaire onderzoeken. De uitslagen van alle testen samen vormen de complete diagnose. In dit proefschrift wordt ingegaan op het ontwikkelen en optimaliseren van moleculaire technieken, zowel voor post- als prenataal onderzoek, ten behoeve van verbetering van de diagnostiek voor Hb-pathieën. Hoofdstuk 2.1 beschrijft een diagnostische test, gebaseerd op de gap-pcr techniek, om acht in Zuidoost Azië veel voorkomende deleties in het b-globine gencluster te detecteren. Deze techniek is snel, eenvoudig, goedkoop en kan in elk moleculair diagnostisch laboratorium toegapast worden. In hoofdstuk 2.2 beschrijven wij de toepassing van de multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) techniek voor de detectie van deleties in de a- en b-globine genclusters. In tegenstelling tot conventionele methoden zoals Southern blotting en fluorescente in-situ hybridisatie (FISH), is MLPA in staat om op een snelle en goedkope manier bekende en onbekende deleties en duplicaties te detecteren met een zeer hoge resolutie. Dit onderzoek laat zien dat de MLPA methode zeer geschikt is om deleties in de a- en b-globine genclusters te detecteren; zowel deleties met bekende breekpunten, minder frequent voorkomende en negen nog niet eerder beschreven deleties werden gevonden. De toepasbaarheid van MLPA wordt verder toegelicht in hoofdstuk 2.3. In deze studie is een cohort van 37 Australische patiënten verdacht van thalassemie dragerschap, waarvan de onderliggende moleculaire oorzaak met de conventionele technieken nog niet gevonden was, gescreend met MLPA. Uiteindelijk konden 27 patiënten gediagnosticeerd worden als thalassemie patiënt vanwege een deletie in het a- of b-globine gencluster. Daarbij werden in deze studie

5 niet eerder beschreven deleties gevonden. Hieruit blijkt dat de MLPA techniek een waardevolle aanvulling is op de huidige technieken die gebruikt worden voor Hb-pathie diagnostiek. Hoewel met behulp van MLPA de lengte van deleties relatief nauwkeurig te bepalen is, blijven de exacte breekpunten onbekend. Vanuit wetenschappelijk oogpunt is het interessant om de breekpunten te bepalen, omdat zo meer kennis verkregen zou kunnen worden over mechanismes die ten grondslag liggen aan het ontstaan van deze deleties. Hoofdstuk 2.4 beschrijft de ontwikkeling en toepassing van de fine-tiling array comparative genomic hybridization (acgh) methode voor Hb-pathieën. Deze studie laat zien dat het met gebruik van deze techniek mogelijk is om breekpunten zeer nauwkeurig te bepalen in alle 36 patiënten die getest zijn. Met deze kennis was het relatief eenvoudig om simpele gap- PCR methoden te ontwikkelen voor 10 deleties. Verder toont deze studie aan dat deleties in het a-globine gen cluster meestal lijken te ontstaan door het nonallelic homologous recombination (NAHR) mechanisme, terwijl er in het b-globine gencluster vaker sprake is van het nonhomologous end joining (NHEJ) mechanisme. In hoofdstuk 4.1 wordt de -- AW deletie beschreven. Deze deletie, gevonden in een Nederlandse familie, heeft een lengte van 8.2 kb en neemt beide a-globine genen weg. Na sequentie analyse van het breekpuntfragment kon worden geconcludeerd dat deze deletie waarschijnlijk is ontstaan door een niet-homologe recombinatie tussen een Alu- en een L1- repeat. Dit type recombinatie is zeer zeldzaam en nog niet eerder beschreven in het a-globine gencluster. Hoofdstuk 4.2 beschrijft een patiënt met HbH ziekte en b-thalassemie, als gevolg van gecombineerd dragerschap van een mutatie in het a- en b-globine gen en een onbekende deletie in het a-globine gencluster. Deze deletie, -- BGS genaamd, is met behulp van MLPA, acgh, PCR en sequentie analyse nader gekarakteriseerd. De deletie neemt 131 kb van het a-globine gencluster weg; het regulatoire element en beide a-globine genen zijn gedeleteerd maar het q-gen is nog intact. Omdat er een orphan sequentie van 57 bp in het breekpuntfragment werd gevonden, kan worden geconcludeerd dat deze deletie waarschijnlijk is ontstaan door vorming van twee loops vanwege recombinatie tussen verschillende Alu-repeats op beide allelen. Deze studies tonen het belang aan van MLPA, acgh en breekpuntanalyse binnen de diagnostiek voor Hb-pathieën. Het is van belang om dergelijke a 0 -thalassemie deleties te kunnen detecteren, omdat er in combinatie met andere a 0 -thalassemieën (bijvoorbeeld -- SEA, -- MedI, -- MedII en -- DutchII ) een risico van 25% op het letale HbBart s hydrops foetalis syndroom in het nageslacht bestaat. De MLPA methode is ook zeer waardevol in de prenatale diagnostiek van Hb-pathieën, zoals wordt beschreven in hoofdstuk 3.1. Twee risicoparen, waarvan een partner drager is van een bekende puntmutatie in het b-globine gen en de ander van een b-thalassemie waarvan de moleculaire oorzaak niet gevonden kon worden, werden onderzocht met behulp van MLPA. Een deletie van het regulatoire element, dat upstream van het b-globine gen ligt, veroorzaakt namelijk ook een b-thalassemie terwijl het b-globine gen zelf intact is. In dit geval zou het intacte (maar inactieve) gen kunnen leiden tot een misdiagnose: de foetus wordt ten onrechte gekarakteriseerd als een gezonde drager van b-thalassemie, maar heeft geen functionele b-globine genen, wat leidt tot thalassemie major. Dit was echter niet het geval in de onderzochte risicoparen; na analyse met behulp van MLPA bleek er sprake te zijn van een niet eerder beschreven deletie die het b-globine gen wegneemt. Ten behoeve van verbetering van de prenatale diagnostiek voor Hb-pathieën is een pyrophosphorolysis-activated polymerization (PAP) assay opgezet (hoofdstuk 3.2). Deze techniek 192

6 is in staat om het vrij foetaal DNA, dat circuleert in de bloedbaan van een zwangere vrouw, te detecteren. Omdat het vaak voorkomt dat beide ouders drager zijn van dezelfde mutatie, waarbij geen onderscheid gemaakt kan worden tussen foetale en maternale mutaties, is besloten om deze studie op te zetten voor 12 SNPs in linkage met het ziekte gen, in plaats van voor de mutatie zelf. Genotypering van deze SNPs gebeurt met behulp van melting curve analysis (MCA), een zeer snelle en nauwkeurige methode. PAP wordt vervolgens uitgevoerd voor de SNPs die vader wel heeft en moeder niet, om zo te kunnen bepalen welk paternale allel de foetus heeft geërfd. De combinatie van PAP en MCA vormt een betrouwbare methode voor niet-invasieve prenatale diagnose van b-thalassemie en sikkelcelziekte, op voorwaarde dat een eerder geboren kind of ander familielid beschikbaar is om linkage met de paternale SNPs te bepalen. Indien er informatieve SNPs aanwezig zijn in vader (en afwezig in moeder), maakt deze methode in principe 50% van de huidige invasieve ingrepen, die een risico op een miskraam met zich meebrengen, overbodig. De diagnostiek voor Hb-pathieën is de laatste jaren sterk verbeterd, voornamelijk door de implementatie van de MLPA techniek. Naar aanleiding hiervan is de arraycgh technologie toegepast om de breekpunten met een hogere resolutie te bepalen. Dit heeft geleid tot karakterisatie van verschillende deleties en duplicaties in de globine genclusters. Met deze kennis konden relatief eenvoudige PCR assays opgezet worden om de huidige gap-pcr uit te breiden. De ontwikkeling van de MLPA, PAP en MCA technieken heeft ook geleid tot verbetering van de prenatale diagnostiek. Vooral de niet-invasieve prenatale diagnostiek zal een aanzienlijke verandering teweeg brengen, vanwege het minimale risico op een miskraam. In de toekomst zal de nieuwste generatie technieken die het mogelijk maken om het gehele genoom te sequencen een belangrijke rol gaan spelen, zowel in post- als (niet-invasieve) prenatale moleculaire diagnostiek. 193

7