ONTVANGST STALEN VOOR FRAGMENTANALYSE. 1 WERKPROCEDURE 1.1 Voorbereidingen. 1.2 Aanvraagprocedure

Transcriptie

1 ONTVANGST STALEN VOOR FRAGMENTANALYSE 1 WERKPROCEDURE 1.1 Voorbereidingen Reacties worden door de klant zelf uitgevoerd.. SnaPshot analyses en experimenten met custom microsatellieten worden door de GSU enkel uitgelezen, de reacties dienen eveneens zelf uitgevoerd te worden. Voor grotere analyzes (SNPplex of genome wide linkage analyze) kan besproken worden dat de voorbereidingen binnen de GSU worden uitgevoerd. Neem hiervoor contact op met Jan Hellemans (09/ ). De laatste stap voor de analyze, het overbrengen naar de juiste buffer met lengtemerker in een voor de sequencer geschikte plaat, wordt steeds door de GSU uitgevoerd. Voor de analyse van custom microsatellieten staat een standaard protocol ter beschikking op de CMGG website ( 1.2 Aanvraagprocedure Eerste aanvraag Voor de eerste aanvraag dien je contact op te nemen met de GSU om je Finch account in orde te brengen. Hiervoor hebben we de volgende informatie nodig: Gebruikersnaam (zoals bij UGent) Voornaam Achternaam Instituut / vakgroep / dienst Telefoonnummer 1 of meerdere labgroup(en) 1 of meerdere projecten + informatie over de labgroup waar ze deel van uitmaken Stuur deze informatie bij voorkeur via naar de GSU ( info.gsu@medgen.ugent.be) zodat we je account kunnen instellen en je eerste labgroup en project aan kunnen maken. Je wachtwoord wordt initieel gelijkgesteld aan je gebruikersnaam. De klant wordt via verwittigd dat zijn/haar Finch-account operationeel is. Bestelbon opmaken Maak een interne bestelbon ten gunste van 'Vakgroep Pediatrie en Genetica' (leveranciersnummer: GE02) voor een 'interne wetenschappelijke dienst' (artikelnummer: ). Maak hierin gebruik van de aangewezen product- of service code (zie Overzicht) en vul het juiste aantal in. Deze bestelbon met als nummer 4 3XX XXX XXX dient goedgekeurd te worden door het diensthoofd, en afgegeven te worden samen met de stalen. De juiste werkwijze voor het aanmaken van een bestelbon is terug te vinden onder document : Aanmaak fragmentanalysebestelbon voor GSU. Services Code Beschrijving Prijs Eenheid GSUs005 Fragment analyse (ABI3130xl run) 25,00 1 run (16 wells) GSUs006 Fragment analyse (ABI3730xl run) 150,00 1 run (96 wells) Producten Code Beschrijving Prijs Eenheid GSUp well plaat (AB-0600) + seal (AB-0588) 4,90 plaat GSUp003 strip-8 (AB-0266) 0,90 strip

2 1.3 Runinformatie aanmaken Voor elke analyse moet opgegeven worden waar welk staal zich bevindt, en hoe ze geanalyseerd moet worden. Hiervoor kan gebruik gemaakt van de Run Editor software die te vinden is op de website: faciliteiten Sequencing Tools Run Editor (GSU-RunEditor-vXX.xls, met XX = versienummer). Controleer telkens of je de laatste versie van de Run Editor gebruikt door te klikken op check for newer version. Aanvaard het uitvoeren van macro's om gebruik te kunnen maken van de mogelijkheden van deze Run Editor. 1. New run

3 2. Format: meestal 96-well plate Application: Fragment analysis 3.Instellingen a. Toestel ABI3130xl: low throughput, veelvouden van 16 metingen of minder ABI3730xl: high throughput, veelvouden van 96 metingen b. Analyse methode: dit is de methode waarmee de data automatisch geanalyseerd worden, kies Microsatellite Default. De analysemethode kan nadien bij de analyse nog gewijzigd worden.

4 c. Size standard: dit is de lengtemerker die bij de automatische analyse gebruikt wordt, kies bij voorkeur de best passende. Deze kan nadien bij heranalyse nog gewijzigd worden. ABI3130xl: GS120LIZ GeneScan 120 LIZ Size Standard is ontworpen voor DNA-fragmenten in het bereik nucleotiden en biedt negen single-stranded label fragment van: 15, 20, 25, 35, 50, 62, 80, 110 en 120 nucleotiden. Met GS120LIZ kunnen de fragmenten gelabeld worden met de kleurstoffen FAM, VIC, NED of PET. GS400HD GeneScan 400 HD ROX Size Standard is ontworpen voor DNA-fragmenten in het bereik van nucleotiden en biedt 21 gelabelde fragmenten van: 50, 50, 90, 100, 120, 150, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380 en 400 nucleotiden. GS500 GeneScan -500 ROX Size Standard is ontworpen voor DNA-fragmenten in het bp bereik en biedt 16 single-stranded fragmenten van 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, en 500 basen. GS500LIZ Gebruik deze Size Standard voor fragmenten tussen 35 en 500 bp. De Size standard bevat 16 LIZ kleurstof-label, single-stranded DNA-fragmenten van: 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, en 500 nucleotiden. De fragmenten kunnen gelabeld worden met de kleurstoffen FAM, VIC, NED of PET. ILS600 De interne Lane Standard 600 marker is een stockoplossing van 22 DNA-fragmenten, variërend in grootte van bp. Tussen de 60 en 200bp liggen er om de 20bp fragmenten terwijl er van 200 tot 500 bp om elke 25 bp fragmenten liggen en tussen de 500 en 600bp om de 50bp fragmenten. ABI3730xl: GS120Liz GeneScan 120 LIZ Size Standard is ontworpen voor DNA-fragmenten in het bereik nucleotiden en biedt negen single-stranded label fragment van: 15, 20, 25, 35, 50, 62, 80, 110 en 120 nucleotiden. Met GS120LIZ kunnen de fragmenten gelabeld worden met de kleurstoffen FAM, VIC,

5 NED of PET. GS400HD GeneScan 400 HD ROX Size Standard is ontworpen voor DNA-fragmenten in het bereik van nucleotiden en biedt 21 gelabelde fragmenten van: 50, 50, 90, 100, 120, 150, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380 en 400 nucleotiden. GS500 GeneScan -500 ROX Size Standard is ontworpen voor DNA-fragmenten in de bp bereik, en biedt 16 single-stranded fragmenten van 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, en 500 basen. GS500Liz Gebruik deze Size Standard voor fragmenten tussen 35 en 500 bp. De Size Standard bevat 16 LIZ kleurstof-label, single-stranded DNA-fragmenten van: 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, en 500 nucleotiden. De fragmenten kunnen gelabeld worden met de kleurstoffen FAM, VIC, NED of PET. SNPlex_48plex_v1 d. Results group: slechts 1 mogelijkheid De results group definieert het file type, de file name, de locatie waar de file gesaved wordt, de Analysis software en autoanalysis. ABI3730xl= FragmentResults-4 ABI3130xl=FragmentResults

6 e. Instrument protocol: dit is de belangrijkste instelling omdat ze bepaalt hoe de resultaten uitgelezen moeten worden, en ze bij de analyse niet meer gewijzigd kan worden. Het instrument protocol bevat alles dat nodig is om het toestel te doen lopen. Kies steeds een instrument protocol dat overeen komt met de toepassing en gekozen dyes (zie onderstaande tabel). Contacteer bij twijfel de GSU. ABI3730xl: Fragment-Any4Dye-HDR Fragment-G5 SNPlex-S Snapshot-AnyDye PP16-Any4Dye ABI3130xl: Fragment-D Fragment-E5 Fragment-F Fragment-G5

7 4. Vul staal- en gennamen in. Telkens er een naam aan een bepaald welletje gegeven wordt moet het welletje geslecteerd worden (grijs) en wordt er sample of primer gekozen waarin de naamgeving ingevuld wordt.

8 2 1 5.Print view: deze knop kan gebruikt worden om een overzicht van de run af te drukken. 6.Export: Plate name = Frag_1stelettervoornaam+achternaam_datum Plaatselijk saven van run layout en doormailen naar info.gsu@medgen.ugent.be of binnenbrengen via USB stick. Dye Set DS-02 DS-30 DS-33 DS-40 Blauw dr110 6-FAM 6-FAM 6-FAM Groen dr6g HEX VIC dr6g Geel dtamra NED NED Rood drox PET Lengtemerker LIZ ROX LIZ LIZ Filter set E5 D G5 S Toepassingen SNaPhot Linkage mapping set Linkage mapping set SNPlex

9 Instrument protocol op ABI3130xl Nog te optimaliseren v2 Custom oligo s Fragment-D v2.5 Custom oligo s Fragment-G5 Instrument protocol op ABI3730xl Snapshot- Any5Dye Fragment- Any4Dye-HDR Fragment-G5 SNPlex-S 1.4 Afleveren van de producten Alle staaltjes dienen afgegeven te worden in het bureautje van de GSU (lokaal ). Een export van de run layout moet ook bezorgd worden aan de GSU, en een Finch folder dient opgegeven te worden om later de resultaten te kunnen downloaden. Dit kan gebeuren via , of met behulp van een USB stick. De aangewezen verdunning van de PCR-producten kan niet algemeen worden vastgelegd, maar dient proefondervindelijk bepaald te worden. De verdunde PCR-producten worden afgegeven. Telkens er een andere verdunning wordt afgegeven, wordt er een nieuwe bestelbon aangemaakt. 2 VERWERKINGSTERMIJN Fragmentanalyse-resultaten zijn na aflevering aan de GSU na 24u beschikbaar op de Finch website. Indien er door geplande onderhoudswerkzaamheden of technische problemen grotere termijnen gelden zal hiervoor melding gemaakt worden op de Finch website als een Message of the day 3 AFHALEN VAN RESULTATEN Zie instructies onder Fragment-analyse: ophalen resultaten