Chromosomale translocatie detectie in sarcomen d.m.v. reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) Marjolijn Ligtenberg

Transcriptie

1 Aanvraag voor Moleculaire Diagnostiek Door patholoog Chromosomale translocatie detectie in sarcomen d.m.v. reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) Marjolijn Ligtenberg Uitgangsmateriaal: Paraffineweefsel Vriesweefsel Beenmergbiopten Cytologisch materiaal 4e bijeenkomst werkgroep moleculaire diagnostiek in de pathologie 27 februari 2009 Laboratorium Management Systeem Registratie en controle aanvraag lab moleculaire diagnostiek Weefselbewerking (paraffine, vries, cellen, bloed) Aanvraag barcode sticker Weefsel intern of extern Registratie aanvraag in eigen systeem Weefsel representatief - Percentage tumor/verdachte cellen door patholoog. Laboratorium Management Systeem Vooraf HE dikke coupes achteraf HE DNA/RNA isolatie Weefsel representatief Voldoende materiaal (µg) Kwaliteit voldoende Diagnostische test bv Translocatie-detectie PCR agarosegel DNA -> Sizeladder-PCR 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp RNA -> cdna -> PCR huishoudgen 400 bp 300 bp 200 bp 100 bp Doel: Aantonen van een specifieke translocatie mbv PCR 1

2 Moleculair resultaat Voorlopige uitslag Weefsel representatief Kwaliteit DNA / RNA Voldoende verdachte / tumorcellen Conclusie moleculaire test (bv ondersteunt wel/niet; sluit niet uit met restrisico) Evt. overleg met aanvrager Moleculair bioloog of bevoegd analist autoriseert uitslag Moleculaire uitslag komt in enverslag (PALGA) Patholoog integreert uitslag in eindconclusie PARAFFINE VRIES Opslag en Transport kamertemperatuur -80 C ULV Stikstof / droogijs DNA / RNA +/- +++ Morfologie +++ (gefixeerd) + (ongefixeerd) Snijden microtoom cryostaat Weefsel Bewerking +++ +/- RNA isolatie Paraffine Deparaffineren ProtK o.n RNA-Bee Chloroform Isopropanol precipitatie OD-meting cdna synthese 1 dag Vries RNA-Bee Chloroform Isopropanol precipitatie OD-meting cdna synthese 1,5 uur cdna synthese Random hexameren Supercript II o C o C 3 95 o C Controle en translocatie specifieke 1-staps PCR s Opzetten RT-PCR assay 75% 75% 85% 85% 95% Behoefte bij pathologen Literatuurstudie: frequentie; exonfusies Primerontwerp (amplicongrootte verschillende fusies) Opzoeken van itieve controles (PALGA) Optimalisatie RT-PCR Validatie op itieve en atieve controles Sequentie-analyse Vaststellen SOPs Vastleggen standaard uitslagteksten 2

3 Literatuur: fusie tussen ETV6 exon 5 en NTRK3 exon 13 (nu 16) Primers in ETV6 exon 5 en NTRK3 exon 13 (nu 16) (Bourgeois et al., 2000) 110 bp PALGA selectie van mesoblastisch nefroom/ congenitaal fibrosarcoom 6 tumoren ( ) Positieve controles: 3/6 ; 2/6 ntb (oud, slecht RNA); 1 (SYT-SSX +) Negatieve controles: 0/16 Knezevich et al, Nat Genet 1998 ETV6 NTRK3 exon 5 exon 13 (nu 16) HMBS 150bp. Herhaalde RNA isolatie en cdna synthese levert niets op ntb ETV6-NTRK3 110 bp primer-dimer Official Symbol SS18 Official Full Namesynovial sarcoma translocation, chromosome 18 Also known as SYT; SSXT; SYT-SSX1; SYT-SSX2; MGC116875; SS18 Synoviaal sarcoom 110 bp RT-PCR SS18-SSX1/2 PBGD >> HMBS 150bp. 110 bp 3

4 Overall survival of patients with localized Fig. 5 disease at presentation univariate P was 0.08, multivariate was P = 0.04 Discussie in literatuur: Vaak geen significant verschil Klinisch niet relevant Ladanyi, M. et al. Cancer Res 2002;62: Copyright 2002 American Association for Cancer Research Proces bekken met forse weke delen uitbreiding bij 17- jarige jongen botpijpje bekken rechts Botfragmenten met reactieve ombouw en een small blue round celpopulatie tumor IHC: CD99 sterk membraneus + Desmine; MyoD1; Myogenine - Synaptophysine - CK pan AE; CK8/18; EMA ; 10 X bot bcl-2 - CD34; CD45; CD3; CD20; CD79a Moleculair onderzoek naar Ewing s sarcoom translocaties Ewing s sarcoom: EWSR1-FLI1 translocaties Type 2 Type 1 Type 3 PCR: A: 7 & 9 B: 7 & 7 C: 9 & 7 Khoury, Expert rev. Mol. Diagn. (2008) Ewing s RT-PCR Type 1 EWSR1 FLI1 Gevoeligheid RT-PCR afhankelijk van primer design 331 bp 155 bp HMBS 150 bp. HMBS 250 bp. EWSR1-FLI1 A 7 & 9 EWSR1-FLI1 B 7 & 7 EWSR1-FLI1 C 9 & 7 EWSR1-ERGA 7 & 9 EWSR1-ERG B 7 & 6 PCR: A: 7 & B: 7 & C: 9 & 7 Type 2 Type 1 Type 3 Primer set gebruikt door o.a. Bridge et al, Modern Pathology Khoury, Expert rev. Mol. Diagn. (2008) 4

5 FISH probes (Vysis; break apart) CHN CHOP FKHR Nadelen RT-PCR Validatie en implementatie tijdrovend Geen gevalideerde kits Positieve controle materialen nodig Moleculair biologische expertise en apparatuur nodig Voordelen RT-PCR Kleine hoeveelheid en laag % tumorcellen voldoende Op vriesmateriaal snelle diagnostiek mogelijk Nieuwe fusiegenen makkelijk toe te voegen Informatie over exacte variant van de fusiegenen Informatie over fusiepartners Met dank aan het team van het moleculaire diagnostieklab Annemiek Paul Monique Monique Marian Marjolijn Yvonne Patricia Sandra Manja Greet Riki. en de pathologen m.n. Han van krieken Konnie Hebeda Piet Slootweg Uta Flucke Monika Looijen Willeke Blokx Pieter Wesseling 5