De moleculaire diagnostiek van B-NHL: detectie van breuken met behulp van FISH

Transcriptie

1 De moleculaire diagnostiek van B-NHL: detectie van breuken met behulp van FISH Philip Kluin, UMCG, Daphne de Jong, VUMC Yvonne van Norden, HOVON en Alle deelnemers HOVON kwaliteitsronde

2 De oorsprong en de verspreiding van normale B-lymfocyten Ontwikkeling voorloper B-cellen Ontwikkeling rijpe B-cellen in lymfeklier, MALT etc Plasmacellen in lymfeklier, MALT, beenmerg etc MALT MALT Aanmaak Ig antigen onafhankelijk Ig affiniteits verhoging en Ig klasseswitch antigen afhankelijk

3 acute lymfatische leukemie maligne lymfomen plasmacel tumoren & CLL B cel maligniteiten in alle stadia Ontwikkeling voorloper B-cellen Ontwikkeling rijpe B-cellen in lymfeklier, MALT etc Plasmacellen in lymfeklier, MALT, beenmerg etc MALT MALT

4 RAG1/2 gemedieerde VDJ recombinatie in voorloper B-cellen VH DH JH E C C C 3 C 1 C 1 E C 2 C 4 C C 2 E V D J E IgM transcript Chromosoom 14

5 In voorloper B-cel van folliculair lymfoom gaat iets mis. Chromosoom 14 VH DH JH E C C C 3 C 1 C 1 E C 2 C 4 C C 2 E BCL2 E + BCL2 Chromosoom 18

6 Kiemcentrumreactie in rijpe B cellen Somatic hyper mutations: affinity maturation of BCR Class switching: from IgM to IgG / IgA etc Activation induced deaminase AID / AICDA / HIGM2

7 VDJ recombinaties, somatische hypermutaties en klasseswitch De enzymen (RAG1/2 en AID) en DNA repair mechanismen treffen ook andere targets: inmiddels groot aantal targets van AID bekend waaronder MYC Het ontstaan van DNA breuken in zowel de IG genen als deze targets kan zorgen voor chromosomale translocaties met activatie van oncogenen zoals MYC.

8 Meest bekende translocaties in B- NHL t(14;18)(q21;q32): BCL2 en IGH* t(3;?)(q27;?): BCL6 en IGH, IGK, IGL of andere genen t(8;14)(q24;q32): MYC en IGH* t(11;14)(q13;q32): CCND1 en IGH* t(11;18)(q21;q21): BIRC3 en MALT1 * of IGK of IGL op #2, resp. #22

9 Welke NHL hebben een t(14;18)? 90% folliculair lymfoom graad 1&2, 30-50% folliculair lymfoom 3A & B 15-20% DLBCL 30-35% GCB type (CD+, MUM1-), deel is progressie uit folliculair lymfoom? 0-5% ABC type (CD-, MUM1+) Meeste dubbelhit lymfomen (MYC breuk met andere breuk (BCL2 > BCL6 > 9p13 > CCND1 > IRF4)

10 Welke NHL hebben een t(11;14)? 99% MCL // CCND1 + <5% atypische CLL & 15% SLVL = indolente variant MCL, SOX11 negatief 33% B-PLL & paraimmunoblastair lymfoom = blastair MCL 15% myeloma (breakpoints in Ig switch sites), all strongly CCND1 +

11 Welke NHL hebben een MYC / 8q24 breuk? 90-0% Burkitt lymfomen // goede prognose en genezing mits adekwaat behandeld -15% DLBCL Slechte prognose en nieuwe therapie nodig >50% dubbelhit met ook BCL2/BCL6 breuk of beide 30-50% intermediate lymfomen Erg slechte prognose >50% dubbelhit met ook BCL2/BCL6 breuk of beide % van getransformeerde folliculaire lymfomen (dus ook dubbelhit), sporadisch ook MCL (idem) fors deel van progressief multipel myeloom

12 Hoe belangrijk is het detecteren van een MYC breuk? MMML data, S Aukema et al, Haematologica 2014 non mbl (GEP) MYCR+ lymfomen mbl Zeer belangrijk, alles in de juiste context

13 Waarom niet alleen MYC IHC? Y69 rabbit monoclonal Afkappunten verschillen (mediaan, 40, 50, 70% etc) Eenzijdige relatie: de meeste MYC-breuk+ lymfomen hebben hoge MYC expressie In DLBCL vaker MYC expressie (30-40%) dan breuk (-15%) Verschillen in GCB en ABC groepen: MYC breuken vaker in GCB, BCL2 breuken uitsluitend in GCB MYC en BCL2 expressie juist vaker in ABC Vooral MYC+ BCL2+ dubbelexpressie is belangrijk

14 MYC en overleving (563 R-CHOP behandelde DLBCL; Mod Pathol 2013) MYC breuk in alle DLBCL MYC breuk in GCB DLBCL MYC breuk in DLBCL met hoge MYC expressie (>75%)

15 Nieuwe HOVON studie(s) Alle DLBCL, BL & intermediate lymfomen: screening voor MYC breuken niet BL:

16 Dus voorbereiden op wat komen gaat.. FISH rondzending voor MYC, BCL2 en BCL6 TMA gemaakt van 11 cases uit Würzburg (gouden standaard) 7 augustus 2013 verstuurd aan 17 labs, sommige labs kregen op verzoek een nieuwe coupe Gegevens verwerkt en 13 december feedback

17 Probes in 17 labs Abbot / Vysis Dako Kreatech geen BCL2 ba BCL6 ba MYC ba MYC-IGH

18 0 Number of results Number of results Probes Probe 1 Dako (6-9 Probe 2 labs) Abbott/Vysis (6-9 labs) Probe 1 Probe 3 Kreatech (1 lab)

19 Scores Probe 1 Goed: zowel lab als ref zijn beide pos of beide neg Vals+: ref is negatief en lab oordeelt positief Vals-: ref is positief en lab oordeelt negatief : core er af No concl: geen (interpreteerbare) data Goed-dubieus: afgegeven als dubieuze conclusie, maar wel juist beoordeeld Fout-dubieus: afgegeven als dubieuze conclusie, maar wel fout beoordeeld

20 Number of labs Forse verschillen tussen cases Case 7 Case Lab 11: BCL2: <%, geen breuk, polysomie BCL6: <5%, geen breuk, polysomie MYC: breuk in 63% MYC IGH: fusie in 76% Lab 11: BCL2: breuk in 73% BCL6: <5%, geen breuk MYC: breuk in 65% MYC IGH: <5% geen fusie

21 Dus breuk met deletie Nog een casus Case 9 Lab 11: BCL2: breuk, 81% BCL6: <5%, geen breuk MYC: breuk in 25% (andere labs hoger %) tgv extra losse signalen 5 zijde (centromeer) MYC IGH: <5%, geen fusie

22 Probe 1 Individuele labs, voorbeeld lab 1 Lab 1

23 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Lab 5 maar 1 vals+! Lab 6 Lab 7 Lab 8 Lab 9 Lab Lab 11 Lab 12 Lab 13 Lab 14 Lab 15 Lab 16 Lab 17

24 Welke labs tellen en heeft dat invloed? Probe 1 Lab 1 semiquantitatief quantitatief

25 Lab 2 Lab 3 Lab 4 Lab 5 Lab 6 Lab 7 Lab 8 Lab 9 Lab Lab 11 Lab 12 Lab 13 Lab 14 Lab 15 Lab 16 Lab 17

26 Percentages breuk per lab (alleen als geteld) BCL2 MYC 0 Vals + casus Grote & consistente verschillen tussen labs!

27 Tellen is meer dan tellen, lab 11 2 of 3 analisten kijken 1 telt, 2 kijken globaal evt kijkt patholoog mee vast score formulier Geen goede verklaring voor verschillen tussen labs: vergelijking exacte werkwijze noodzakelijk

28 CONCLUSIES Goede participatie en waardevolle resultaten Geen grote verschillen tussen probe sets Maar 2/17 labs (12%) hadden alles goed 5 labs (incl 1 met missing core; 30%) hadden alle MYC break apart tests goed Grote verschillen in kwantificering tussen labs Relatie tussen tellen en scores niet keihard, maar de twee labs zonder fouten tellen Vaker vals negatief dan vals positief worden losse signalen van één kleur (= breuk) over het hoofd gezien? Sommige labs hebben vaak een onzekere uitslag; deze is voor de kliniek niet erg behulpzaam

29 Tot slot: dank aan de organisatoren en