Detectie van translocaties met behulp van NGS. B. Tops, PhD moleculaire dag,

Transcriptie

1 Detectie van translocaties met behulp van NGS B. Tops, PhD moleculaire dag,

2 Disclosures B. Tops Geen persoonlijk belang bij de inhoud/data van deze presentatie

3 Translocaties Indicatie 5 gen 3 gen Alveolair Rhabdomyosarcoom PAX3, PAX7 FOXO1A Synoviaal sarcoom SYT SSX1, SSX2 Myxoid liposarcoom FUS, EWSR1 DDIT3 Ewing/PNET EWSR1 FLI1, ERG Clear cell sarcoom EWSR1 ATF1, CREB Extraskeletaal Myxoid Chondrosarcoom EWSR1, TAF15 NR4A3 Desmoplastische Rondceltumor EWSR1 WT1 Congenitaal Fibrosarcoom ETV6 NTRK3 Laaggradig fibromyxoid sarcoom FUS CREB3L2 Chondroid Lipoom C11orf95 MKL2 Epithelioïd Hemangioendothelioom WWTR1, YAP1 CAMTA1, TFE3 Mesenchymaal Chondrosarcoom HEY1 NCOA2 Solitair Fibreuze Tumoren NAB2 STAT6 Longcarcinoom EML4, HIP1, KIF5B, KLC1, TPR, TFG, STRN ALK Longcarcinoom CCDC6, CUX1, KIF5B, TPM3, NCOA4 RET Longcarcinoom CD74, EZR, GOPC, LRIG3, SDC4, SLC34A2, TPM3 ROS1

4 Huidige methoden voor translocatie detectie FISH (potentieel fout negatieven; duur) IHC (subjectieve interpretatie) RT-PCR (meerdere breekpunten/fusiepartners)

5 Translocaties Indicatie 5 gen 3 gen Alveolair Rhabdomyosarcoom PAX3, PAX7 FOXO1A Synoviaal sarcoom SYT SSX1, SSX2 Myxoid liposarcoom EWSR1, FUS DDIT3 Ewing/PNET EWSR1 FLI1, ERG Clear cell sarcoom EWSR1 ATF1, CREB Extraskeletaal Myxoid Chondrosarcoom EWSR1, TAF15 NR4A3 Desmoplastische Rondceltumor EWSR1 WT1 Congenitaal Fibrosarcoom ETV6 NTRK3 Laaggradig fibromyxoid sarcoom FUS CREB3L2 Chondroid Lipoom C11orf95 MKL2 Epithelioïd Hemangioendothelioom WWTR1, YAP1 CAMTA1, TFE3 Mesenchymaal Chondrosarcoom HEY1 NCOA2 Solitair Fibreuze Tumoren NAB2 STAT6 Longcarcinoom EML4, HIP1, KIF5B, KLC1, TPR, TFG, STRN ALK Longcarcinoom CCDC6, CUX1, KIF5B, TPM3, NCOA4 RET Longcarcinoom CD74, EZR, GOPC, LRIG3, SDC4, SLC34A2, TPM3 ROS1

6 Translocaties Indicatie 5 gen 3 gen Alveolair Rhabdomyosarcoom PAX3, PAX7 FOXO1A Synoviaal sarcoom SYT SSX1, SSX2 Myxoid liposarcoom FUS, EWSR1 DDIT3 Ewing/PNET EWSR1 FLI1, ERG Clear cell sarcoom EWSR1 ATF1, CREB Extraskeletaal Myxoid Chondrosarcoom EWSR1, TAF15 NR4A3 Desmoplastische Rondceltumor EWSR1 WT1 Congenitaal Fibrosarcoom ETV6 NTRK3 Laaggradig fibromyxoid sarcoom FUS CREB3L2 Chondroid Lipoom C11orf95 MKL2 Epithelioïd Hemangioendothelioom WWTR1, YAP1 CAMTA1, TFE3 Mesenchymaal Chondrosarcoom HEY1 NCOA2 Solitair Fibreuze Tumoren NAB2 STAT6 Longcarcinoom EML4, HIP1, KIF5B, KLC1, TPR, TFG, STRN ALK Longcarcinoom CCDC6, CUX1, KIF5B, TPM3, NCOA4 RET Longcarcinoom CD74, EZR, GOPC, LRIG3, SDC4, SLC34A2, TPM3 ROS

7 EML4::ALK translocatie

8 EML4::ALK translocatie Chr 2

9 EML4::ALK detectie Chr 2 Abbott/Vysis

10 Huidige methoden voor translocatie detectie FISH (potentieel fout negatieven; duur) IHC (subjectieve interpretatie) RT-PCR (meerdere breekpunten/fusiepartners) Extra uitdagingen: Beperkt weefsel Doorlooptijd % neoplastische cellen

11 Translocatie detectie mbv NGS Methode RNA/DNA TAT Seq. capaciteit Detectie nieuwe translocaties Targeted (multiplex PCR) RNA Anchored PCR enrichment (e.g. NuGEN/Enzymatics) RNA RNAseq RNA WGS DNA

12 Strategie voor Targeted multiplex PCR Detectie van mutaties en translocaties in 1 assay (sequence run) Input materiaal: 10ng DNA/RNA Translocations (ALK, ROS1, RET) Uitgebreid: detecteerd alle bekende fusiepartners Unified assay design Ion AmpliSeq multiplex PCR voor mutaties Ion AmpliSeq multiplex RT-PCR voor translocaties Beide gelijktijdig sequencen op de IonPGM

13 OncoNetwork Global Consortium Cecily P. Vaughn ARUP Institute for Clinical and Experimental Pathology Utah, USA Prof. Harriet Feilotter Queen's University, Ontario Canada Prof. Ian Cree Warwick Medical School United Kingdom Marjolijn J.L. Ligtenberg Dr. Bastiaan Tops Radboud University Nijmegen Medical Centre, Netherlands Dr. Cristoph Noppen & Dr. Henriette Kurth VIOLLIER AG Basel, Switzerland Prof. Orla Sheils St James's Hospital Dublin, Ireland Prof. Pierre Laurent Puig Université Paris Descartes, Paris, France Dr. Ludovic Lacroix Institut Gustave Roussy Paris, France Dr. Jose Costa IPATIMUP Medical Faculty of Porto. Portugal Dr. Nicola Normanno Centro Ricerche Oncologiche Mercogliano, Italy Prof. Kazuto Nishio Faculty of Medicine, Kinki University Osaka, Japan Prof. Aldo Scarpa ARC-NET University of Verona, Italy

14 Consortium doelstellingen Ontwerpen van een long fusiegen NGS panel Testen van het panel door verschillende laboratoria (~200 samples) Samples eerder getest met: FISH, IHC, RT-PCR, MassArray Concordantie met andere methodes: Detecteren van bekende translocaties Identificeren van true negatives Reproduceerbaarheid tussen verschillende laboratoria Sensitiviteit (vergelijkbaar of beter dan FISH)

15 Assay Design: Translocatie detectie in RNA EML4 ALK

16 Translocaties met ALK, RET, ROS1, and NTRK 5 gene 3 gene EML4, HIP1, KIF5B, KLC1, TPR, TFG, STRN CD74, EZR, GOPC, LRIG3, SDC4, SLC34A2, TPM3 CCDC6, CUX1, KIF5B, TPM3, NCOA4 CEL, NFASC, IRF2BP2, TFG, SQSTM1, SSBP2, DYNC2H1, CD74, MPRIP ALK ROS1 RET NTRK1

17 Additioneel design Amplificatie van 5 and 3 regios [Ratio = (3-5 reads)/totaal controle reads] 5 - ALK ROS RET NTRK -3 RNA quality control Huishoudgenen: MYC, ITGB7, LMNA, HMBS, TBP

18 Fusion Workflow RNA extractie Reverse transcriptie Multiplex PCR Adapter and barcode ligatie Library quantificatie en pooling Clonale amplificatie (Ion OneTouch) Sequencen (Ion PGM) Data analyse (Ion Reporter Software)

19 Initiële test (ARUP) Cell lines H2228 (ALK+), HCC78 (ROS1+), LC-2/ad (RET+) Cellijn mix en individuele cellijnen (FFPE) FFPE tumorweefsel, microdissected 9 samples positief voor ALK (eerder getest met FISH, IHC, of RT-PCR) 2 samples positief voor ROS1 (eerder getest met IHC) 18 samples negatief (normale lung, getest met FISH/IHC/RT-PCR, of positief voor EGFR/KRAS mutaties) Cellijn verdunningsreeks H2228 RNA verdund in wildtype RNA

20 ALK positieven Sample Reference method Detected fusion(s) Reads Cell line mix cell lines EML4(ex6a)-ALK(ex20) EML4(ex6b)-ALK(ex20) H2228 cell line EML4(ex6a)-ALK(ex20) EML4(ex6b)-ALK(ex20) ARUP-1 FISH EML4(ex6a)-ALK(ex20) EML4(ex6b)-ALK(ex20) ARUP-2 FISH, RT-PCR EML4(ex13)-ALK(ex20) 3219 ARUP-8 RT-PCR EML4(ex6a)-ALK(ex20) EML4(ex6b)-ALK(ex20) ARUP-9 FISH Positive by 3-5 ratio 0 ARUP-10 IHC EML4(ex13)-ALK(ex20) 5439 ARUP-11 IHC EML4(ex6a)-ALK(ex20) EML4(ex6b)-ALK(ex20) ARUP-12 RT-PCR EML4(ex6b)-ALK(ex20) 64 ARUP-19 FISH, IHC EML4(ex13)-ALK(ex20) 2482

21 ROS1 en RET positieven Sample Reference method Detected fusion Reads Cell line mix cell lines SLC34A2(ex4)-ROS1(ex34) SLC34A2(ex4)-ROS1(ex32) HCC78 cell line SLC34A2(ex4)-ROS1(ex34) SLC34A2(ex4)-ROS1(ex32) RET ARUP-4 IHC EZR(ex10)-ROS1(ex34) 8714 ARUP-13 IHC EZR(ex10)-ROS1(ex34) 9019 Sample Reference method Detected fusion Reads Cell line mix cell lines CCDC6(ex1)-RET(ex12) 3673 LC-2/ad cell line CCDC6(ex1)-RET(ex12) 12576

22 Specificiteit Fusion Reads Sample Reference result ALK ROS1 RET NTRK 1 normal lung normal lung normal lung EGFR-mutant EGFR-mutant EGFR-mutant EGFR-mutant EGFR-mutant KRAS-mutant KRAS-mutant ALK-neg 0 n/a n/a n/a 12 ALK-neg 0 n/a n/a n/a 13 ALK-neg 0 n/a n/a n/a 14 ALK-neg 0 n/a n/a n/a 15 ALK-pos ALK-pos ALK-pos ALK-pos ALK-pos ALK-pos ALK-pos ALK-pos ALK-pos ROS1-pos ROS1-pos ROS1-pos RET-pos

23 ALK 3-5 imbalans ALK + samples ALK - samples ALK-positives ALK-negatives

24 ROS1 3-5 imbalans ROS1 + samples ROS1 - samples ROS1-positives ROS1-negatives

25 Sensitiviteit FDA FISH assay eist 15% for positiviteit Verdunningsreeks van H2228 (ALK+ cellijn) RNA in RNA van een ALK-negatief tumor sample 10 ng/rxn Resultaat Gedetecteerd bij 50%, 10%, en 5% verdunning Gedetecteerd in 1 van de 2 bij 1% verdunning

26 Consortium Data: Reproduceerbaarheid tussen labs Cellijn mix (H2228, HCC78, LC-2/ad) Detected Fusions Lab ALK ROS1 RET ARUP Labs Kinki University Queen s University Radboud University Univ. Paris Descartes Univ. of Verona + + +

27 Huidige methoden Huidige methoden Consortium data: Concordantie met andere methodologieën ALK ROS1 AmpliSeq + - AmpliSeq % concordantie 98% concordantie RET, NTRK: geen translocaties gedetecteerd in negatieve samples

28 Conclusies >98% concordantie met andere methodes Reproduceerbaar tussen verschillende laboratoria Detectielimiet van 5%

29 Acknowledgements OncoNetwork Consortia Dr. Nicola Normanno Prof. Kazuto Nishio Dr. Ludovic Lacroix Dr. Henriette Kurth Prof. Ian Cree Prof. Orla Sheils Prof. Harriet Feilotter Prof. Jose Machado Prof. Jose Costa Dr. Marjolijn Ligtenberg Dr. Bastiaan Tops Prof. Aldo Scarpa Dr. Pierre Laurent Puig Life Technologies Rosella Petraroli Kelli Bramlet Jose Cienfuegos Rajesh Gottimukkala Fiona Hyland Chrysanthi Ainali Alain Rico Mary Budagyan ARUP Laboratories Roy Bastien Noah Welker Rebecca Margraf Daniel Baker Jacob Durtschi Danielle Elsberry Philip Bernard Wade Samowitz

30 Dit is de DNA sequentie van mijn tumor