Moleculaire diagnostiek van bot- en wekedelentumoren

Transcriptie

1 Moleculaire diagnostiek van bot- en wekedelentumoren Molecular diagnostics of bone and soft tissue tumors Auteur Trefwoorden Key words J.V.M.G. Bovée bottumoren, moleculaire diagnostiek, pathologie, sarcomen, wekedelentumoren bone tumors, molecular diagnostics, pathology, sarcomas, soft tissue tumors Samenvatting Bot- en wekedelentumoren zijn relatief zeldzaam en de classificatie hiervan wordt door de patholoog vaak lastig gevonden. Een accurate diagnose is echter essentieel om het biologische gedrag te voorspellen en de therapie hierop af te kunnen stemmen. De laatste decennia is veel bekend geworden over de genetische achtergrond van verschillende mesenchymale tumoren, wat heeft geleid tot de WHO-classificatie 2002, waarbij pathologie en genetica zijn geïntegreerd. Circa 15-20% van de bot- en wekedelentumoren heeft een specifieke translocatie, die gebruikt kan worden in de diagnostiek. De detectie van specifieke translocaties is niet alleen van belang ter bevestiging van de diagnose, zoals gesuggereerd wordt op basis van klassieke morfologie en immunohistochemie, maar is met name belangrijk in die gevallen waarbij de morfologie, het immunohistochemische profiel of het klinische beeld ongewoon zijn. Translocaties kunnen worden aangetoond door middel van reversetranscriptase-pcr op RNA uit vriesmateriaal of fluorescentie-in-situhybridisatie op niet-ontkalkt paraffinemateriaal. Daarnaast kenmerkt een beperkte groep bot- en wekedelentumoren zich door specifieke somatische genmutaties, zoals KIT- en PDGFRA-mutaties in gastro-intestinale stromaceltumoren (GIST), en GNAS1-mutaties in fibreuze dysplasie en myxoom. Mutatieanalyse kan gebruikt worden bij het stellen van de diagnose, en daarnaast voor het voorspellen van de respons op de tyrosinekinaseremmer imatinib (Glivec ) bij GIST. (Ned Tijdschr Oncol 2007;4:238-47) Summary Bone and soft tissue tumors are relatively rare and their classification by the pathologist is often found to be difficult. An accurate diagnosis is essential to predict biological behaviour and to make the therapeutic decision. The last decades the knowledge of the genetic background of the different mesenchymal tumors has evolved, which has led to the WHO classification 2002, integrating pathology and genetics. Approximately 15-20% of bone- and soft tissue tumors has a specific translocation which can be used for diagnosis. The detection of specific translocations is not only important to confirm the diagnosis as was suggested by classical morphology and immunohistochemistry, but is especially useful in those cases with an unusual morphology, immunohistochemical profile or clinical presentation. Translocations can be demonstrated using reverse transcriptase-pcr on RNA isolated from frozen tumor tissue, or FISH on nondecalcified paraffin embedded material. In addition, a small subset of bone and soft tissue tumors is characterized by specific somatic gene mutations, e.g. KIT and PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors (GIST), and GNAS1 mutations in fibrous dysplasia and myxoma. Mutation analysis can be useful for diagnosis, and in case of GIST for predicting the response to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (Glivec ). N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E VOL. 4 NR

2 Tabel 1. Specifieke translocaties en bijbehorende genen in bot- en wekedelentumoren. Tumor Translocatie Genen alveolair rabdomyosarcoom t(2;13)(q35;q14) PAX3-FKHR (FOXO1A) t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR t(2;2)(q35;p23) PAX3-NCOA1 alveolair wekedelensarcoom der(17)t(x;17)(p11.2;q25) ASPL-TFE3 aneurysmatische beencyste t(16;17)(q22;p13) CDH11-USP6 (Tre2) t(1;17)(p ;p13) TRAP150-USP6 t(3;17)(q21;p13) ZNF9-USP6 t(9;17)(q22;p13) OMD-USP6 t(17;17)(q12;p13) COL1A1-USP6 angiomatoïd fibreus histiocytoom t(12;16)(q13;p11) FUS-ATF1 t(12;22)(q13;q12) EWSR1-ATF1 bizarre parosteale osteochondromateuze t(1;17)(q32;q21) RDC1? proliferatie (Noralaesie) clear-cellsarcoom t(12;22)(q13;q12) ATF1-EWSR1 t(2;22)(q32;q12) EWSR1-CREB1 congenitaal fibrosarcoom en t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 mesoblastisch nefroom dermatofibrosarcoma protuberans der(22)t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB (en reuscelfibroblastoom) desmoplastische rondceltumor t(11;22)(p13;q12) WT1-EWSR1 Ewingsarcoom en perifere primitieve t(11;22)(q24;q12) EWSR1-FLI1 neuro-ectodermale tumor (PNET) t(21;22)(q22;q12) EWSR1-ERG t(7;22)(p22;q12) EWSR1-ETV1 t(17;22)(q12;q12) EWSR1-ETV4 t(2;22)(q33;q12) EWSR1-FEV t(16;21)(p11;q22) FUS-ERG endometriaal stromasarcoom t(7;17)(p15;q11) JAZF1-JJAZ1 (SUZ12) t(6;7)(p?;p15) JAZF1-PHF1 inflammatoire myofibroblastaire tumor t(2;19)(p23;p13.1) ALK-TPM4 t(1;2)(q22-23;p23) TPM3-ALK t(2;17)(p23;q23) CLTC-ALK extraskeletaal myxoïd chondrosarcoom t(9;22)(q22;q12) EWSR1- NR4A3 (NOR1, CHN) t(9;17)(q22;q11.) RBP56-NR4A3 t(9;15)(q22;q21) TCF12-NR4A3 lipoblastoom verschillende her- HAS2-PLAG1 schikkingen chromosoom 8 lipoom t(3;12)(q27-28;q14-15) HMGA2 (HMGIC)-LPP 239 VOL. 4 NR N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

3 Tabel 1. Vervolg. Tumor Translocatie Genen vele andere translocaties betreffende 12q14 HMGA2-? laaggradig fibromyxoïd sarcoom t(7;16)(q33;p11) FUS-CREB3L2 FUS-CREB3L1 myxoïd/rondcelliposarcoom t(12;16)(q13;p11) TLS (FUS) - GADD153 (CHOP, DDIT3) t(12;22)(q13;q12) EWSR1-GADD153 mesenchymaal chondrosarcoom der(13;21)(q10;q10) pulmonaal chondroïd hamartoom t(6;14)(p21;q24) HMGA1-RAD51L1 t(3;12)(q27-28;q14-15) HMGA2 (HMGIC)-LPP pericytoom t(7;12)(p22;q13) ACTB-GLI1 synoviosarcoom t(x;18)(p11;q11) SYT (SS18)-SSX1 SYT-SSX2 SYT-SSX4 subunguale exostose t(x;6)(q24-q26;q15-21) COL12A1-COL4A5 reusceltumor van de peesschede t(1;2)(p13;q35) COL6A3-CSF1 (gelokaliseerde type) Inleiding Bot- en wekedelensarcomen zijn relatief zeldzaam en vormen minder dan 1% van alle maligniteiten bij volwassenen. Deze groep tumoren wordt vaak lastig gevonden door pathologen, omdat zij zeer heterogeen zijn en relatief weinig voorkomen, met alleen in de weke delen al meer dan 40 verschillende entiteiten. Bovendien is er een aanzienlijke overlap tussen de entiteiten. 1 Het onderscheid is echter essentieel, aangezien de verschillende entiteiten een verschillende behandeling behoeven en een verschillende prognose hebben. De afgelopen decennia is veel bekend geworden over de genetische achtergrond van kanker. Neoplasie ontstaat doordat genetische veranderingen, bijvoorbeeld chromosomale translocaties of genmutaties, een groeivoordeel geven aan de cellen waarin deze genetische veranderingen optreden. Voor de verschillende bot- en wekedelentumoren zijn ook steeds meer genetische data beschikbaar. Mogelijkheden op het gebied van de moleculaire diagnostiek hebben zich daardoor het laatste decennium sterk kunnen ontwikkelen, waardoor tumorspecifieke translocaties en mutaties kunnen worden aangetoond. 2 Deze ontwikkeling heeft geleid tot een nieuwe WHO-classificatie voor bot- en wekedelentumoren, die gebaseerd is op een combinatie van pathologie en genetica. 1 Agressiviteit van wekedelensarcomen wordt ingedeeld in 3 categorieën. Het gemodificeerde Franse graderingssysteem wordt internationaal gebruikt en geaccepteerd. 1,3 Deze graderingsschema s zijn ontwikkeld voor wekedelensarcomen als groep. Het wordt echter steeds duidelijker dat hierop voor een aantal tumortypen een uitzondering moet worden gemaakt. 4-6 Een adequate histologische diagnose is daarom essentieel. Zowel de immunohistochemie als de moleculaire diagnostiek kunnen de patholoog richting geven bij de diagnostiek van bot- en wekedelentumoren. Met behulp van immunohistochemie kan de lijn van differentiatie worden aangetoond. Maar ook de moleculaire diagnostiek is een steeds belangrijkere rol gaan spelen als aanvullende techniek. Hoewel de traditionele morfologische en immunohistochemische beoordeling aan de basis van de diagnostiek blijven staan, kan de moleculaire diagnostiek de accuratesse van de diagnose en met name de subtypering van bot- en wekedelentumoren vergroten. N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E VOL. 4 NR

4 Tabel 2. Verschillende fusiepartners van EWSR1 en FUS in verschillende tumortypen. Fusie gen Tumor EWSR1 FLI1 ERG ETV1 ETV4 FEV WT1 desmoplastic-small round-celltumor NR4A3 extraskeletaal myxoïd chondrosarcoom ATF1 clear-cellsarcoom angiomatoïd fibreus histiocytoom CREB1 clear-cellsarcoom GADD153 myxoïd/rondcelliposarcoom FUS ATF1 angiomatoïd fibreus histiocytoom ERG acute myeloïde leukemie CREB3L1 laaggradig fibromyxoïd sarcoom CREB3L2 laaggradig fibromyxoïd sarcoom GADD153 myxoïd/rondcelliposarcoom PNET=primitieve neuro-ectodermale tumor. Chromosomale translocaties Translocaties komen voor bij alle soorten kanker en liggen aan de basis van circa 20% van alle maligniteiten. 7 Ze zijn geassocieerd met bepaalde tumortypes, en het ontstaan van de translocatie is een zeer vroege stap in de tumorgenese. 7 Vergeleken met de hematologische maligniteiten is de kennis van cytogenetische afwijkingen in solide tumoren beperkt. In sarcomen blijken translocaties, met name in bepaalde typen tumoren, voor te komen (zie Tabel 1, pagina 239). 2,7 Terwijl bijna 100% van de Ewingsarcomen/primitieve neuro-ectodermale tumoren (PNET s), myxoïd liposarcomen en synoviosarcomen een translocatie heeft waarin respectievelijk het EWSR1-, het DDIT3-, en een van de SSX-genen betrokken is, zijn translocaties afwezig in de veel vaker voorkomende osteo-, chondroen leiomyosarcomen. 7 Het percentage bot- en wekedelentumoren met een translocatie wordt geschat op circa 15-20%. 7 Van carcinomen werd altijd gedacht dat translocaties niet belangrijk waren in de pathogenese, omdat deze cytogenetisch niet konden worden aangetoond. Bij het prostaatcarcinoom is echter gebleken dat de hoge expressie van 2 genen bij microarrayanalyse bleek te berusten op een genfusie, die kon worden aangetoond in 79% van de tumoren. 8 Het is dus mogelijk dat ook in de sarcomen nog meer van dergelijke cryptische chromosomale afwijkingen gevonden zullen worden. Bij veel van de translocaties in sarcomen is het EWSR1- of het FUS-gen betrokken (zie Tabel 2). Deze promiscue genen zijn sterk homoloog en coderen voor RNA-bindende eiwitten. Waarschijnlijk hebben EWSR1 en FUS hetzelfde effect wanneer zij betrokken raken bij een chromosomale translocatie. De aard van het DNA-bindende domein afkomstig van de fusiepartner is vermoedelijk bepalend voor het tumortype dat door de translocatie wordt geïnduceerd (zie Tabel 2). Translocatiedetectie Het aantonen van deze translocaties gebeurt inmiddels routinematig in centra waar veel sarcomen worden behandeld. De belangrijkste technieken die hiervoor worden gebruikt zijn reversetranscriptase-pcr (RT- PCR), fluorescentie-in-situhybridisatie (FISH) en klassieke banderingscytogenetica. 2 RT-PCR Aangezien van de meeste translocaties ook de genfusies bekend zijn (zie Tabel 1, pagina 239), is de RT- PCR een zeer geschikte methode voor het detecteren van deze translocaties. Bij deze techniek wordt RNA geïsoleerd, dat vervolgens wordt teruggeschreven naar 241 VOL. 4 NR N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

5 complementair-dna (c-dna; reverse transcriptie). Dit c-dna kan vervolgens worden geamplificeerd met PCR, waarbij 2 specifieke primers gekozen worden aan weerszijden van het breekpunt. Alleen indien een fusietranscript aanwezig is, ontstaan door de translocatie, zal de PCR-reactie een product geven. Voor deze techniek is dus RNA nodig, dat kan worden geïsoleerd uit bevroren tumorweefsel. RNA-isolatie uit formalinegefixeerd paraffinemateriaal kan lastig en soms onmogelijk zijn. De PCR-techniek is zeer gevoelig voor contaminatie, waardoor dit alleen in gespecialiseerde laboratoria dient plaats te vinden. FISH Met behulp van FISH kunnen ook specifieke translocaties worden aangetoond, indien er probes beschikbaar zijn die het breekpunt overlappen (zie Figuur 1). Het EWSR1- en het FUS-gen zijn in meerdere tumoren betrokken bij de translocatie. Hierdoor kunnen deze worden gebruikt in de differentiaaldiagnose van zowel de rondceltumoren als het extraskeletaal myxoïd chondrosarcoom, of om het clear-cellsarcoom te onderscheiden van het gemetastaseerde melanoom. Men moet zich echter wel realiseren dat niet wordt aangetoond bij welke translocatie het EWSR1- of het FUS-gen betrokken is. Dit betekent dat de klassieke morfologie en de immunohistochemie in de eerste plaats richting moeten geven aan de differentiaaldiagnose. FISH kan goed op niet-ontkalkt formalinegefixeerd paraffine-ingebed materiaal worden verricht. Klassieke banderingscytogenetica Met cytogenetische analyse worden de verschillende chromosomen bestudeerd. Cytogenetisch onderzoek kan helpen bij het stellen of bevestigen van een diagnose, bijvoorbeeld door middel van het aantonen van ringchromosomen in dermatofibrosarcoma protuberans (DFSP) of lipomateuze tumoren. Cytogenetisch onderzoek vereist echter vers vitaal tumorweefsel. Het succes van deze techniek is variabel en hangt af van het al dan niet groeien van de tumorcellen in celkweek. Bovendien is het een arbeidsintensieve, bewerkelijke techniek, waardoor resultaten vaak lang op zich laten wachten. Translocaties en pathogenese Gebalanceerde translocaties leiden tot de vorming van fusiegenen. Een dergelijk hybridegen draagt vervolgens bij aan het ontstaan van kanker, zoals bijvoorbeeld het EWSR1-FLI1-fusiegen in Ewingsarcoom/ normaal t(11;22) der11 der22 22 A Figuur 1. Principe van translocatiedetectie met behulp van fluorescentie-in-situhybridisatie (FISH) bij Ewingsarcoom/primitieve neuro-ectodermale tumor met t(11;22). Twee individuele aansluitende DNA-probes, die gelegen zijn op het EWSR1-gen op chromosoom 22, worden verschillend gelabeld (meestal groen en rood). In de normale situatie zullen deze probes dicht bij elkaar liggen wanneer FISH op interfase kernen wordt verricht (A). In het geval van een translocatie zullen de individuele probes uit elkaar gaan en gedetecteerd worden als 2 aparte signalen (B). PNET. Een andere mogelijkheid is dat 1 van de genen betrokken bij de translocatie onder controle komt te staan van het andere gen dat betrokken is bij de translocatie, wat meestal leidt tot overexpressie, zoals bijvoorbeeld USP6-overexpressie bij aneurysmatische beencyste. Circa de helft van de genen die betrokken zijn bij translocaties, betreft transcriptiefactoren en tyrosinekinases. Het was een van de eerste solide tumoren waarin een karakteristieke translocatie werd gevonden. 9 Alle chromosomale translocaties die tot nu toe beschreven zijn in Ewingsarcoom/ PNET, leiden tot de fusie van een ETS-DNAbindend domein aan een EWSR1 (of, zelden, FUS) transactiveringsdomein. 10 Deze oncoproteïnen werken vervolgens als afwijkende transcriptiefactoren, waarbij zij genexpressiepatronen dereguleren, leidend tot de initiatie van de vorming van het Ewingsarcoom/ PNET. De targetgenen die door deze aberrante transcriptiefactoren worden aangezet, zijn betrokken B N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E VOL. 4 NR

6 Tabel 3. Moleculaire classificatie van gastro-intestinale stromaceltumoren. 21 Gen Domein Aandeel Type mutatie Respons op imatinib KIT exon 9 extracellulair ~10% AY duplicatie/ intermediaire insertie respons exon 11 juxtamembraan ~80% inserties en deleties, zelden beste respons puntmutaties exon 13 kinase I 0,8-4,1% K642E (V654A bij secundaire in vitro sensitief, resistentie) ook klinische respons exon 17 activeringsloop 0,6% N822K en N822H in vitro sensitief, ook klinische respons PDGFRA exon 12 juxtamembraan samen puntmutaties in vitro sensitief, 4,7-7% ook klinische respons exon 18 activeringsloop puntmutaties D842 (62%) slechte respons, overige mutaties sensitief Wildtype - ~5% geen mutaties slechte respons bij het stimuleren van de celproliferatie (upregulatie van PDGF-C, CCDN1, c-myc), de escape van groei-inhibitie (downregulatie van cycline-afhankelijke kinaseremmers en TGF-β-receptor type II), de escape van veroudering (upregulatie van htert), de escape van apoptose (repressie van IGFBP-3-promoter), en de inductie van angiogenese (VEGF), invasie en metastasering (metastasebevorderende proteïnes). 10 Aneurysmatische beencyste Primaire aneurysmatische beencyste (ABC) is een cysteuze laesie van het bot, opgebouwd uit met bloed gevulde holten die van elkaar worden gescheiden door bindweefselsepta, waarin fibroblasten, osteoclastaire reuscellen en reactief weefbeen voorkomen. ABCachtige gebieden kunnen ook worden gevonden in andere beentumoren, zoals reusceltumor of chondroblastoom (secundair ABC). In 1999 werd een karakteristieke translocatie t(16;17) aangetoond in verschillende gevallen van primair ABC. 11 Later werd van de t(16;17)-translocatie aangetoond dat deze de promoter van CDH11, een gen dat sterk tot expressie komt in bot, voor het USP6- gen (TRE2, TRE17) plaatst. 12 De afgelopen jaren werden nog enkele verschillende translocaties beschreven in ABC (zie Tabel 1, pagina 239), die alle de oncogene activering van het USP6-gen op chromosoom 17p13 tot gevolg hebben. 12,13 De pathogenese van de meeste primaire ABC s betreft dus de upregulatie van USP6-transcriptie door andere sterk actieve promoters. 14 Het exacte mechanisme waarmee USP6- upregulatie de vorming van ABC veroorzaakt, is nog onduidelijk. Het USP6-genproduct is betrokken bij actineremodelering. 15 USP6-herschikkingen worden alleen gezien in de spoelcellen, niet in de multinucleaire reuscellen, ontstekingscellen, endotheelcellen of osteoblasten. 16 Dit suggereert dat de neoplastische spoelcellen een uitbundige reactieve hostrespons induceren, lijkend op granulatieweefsel. Dit zou kunnen verklaren waarom de laesies in eerste instantie als reactief werden beschouwd. 16 In 17 secundaire ABC s konden geen USP6- of CDH1-herschikkingen worden aangetoond. 16 Dit suggereert dat ondanks de morfologische gelijkenis met primair ABC, secundair ABC een niet-specifiek morfologisch patroon betreft, dat in andere beentumoren kan optreden. Gebruik van specifieke translocaties in de diagnostiek De detectie van specifieke translocaties is niet alleen 243 VOL. 4 NR N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

7 van belang ter bevestiging van de diagnose, zoals vermoed wordt op basis van klassieke morfologie en immunohistochemie, maar is met name belangrijk in die gevallen waarbij de morfologie, het immunohistochemische profiel of het klinische beeld ongewoon zijn. Small-blue-round-celltumoren De term small-blue-round-celltumor beschrijft een heterogene groep van tumoren, die met elkaar gemeen hebben dat zij histologisch worden gekenmerkt door de aanwezigheid van kleine ongedifferentieerde ronde cellen met weinig cytoplasma. De differentiaaldiagnose van een small-blue-round-celltumor betreft, neuroblastoom, non-hodgkinlymfoom, slecht gedifferentieerd (rondcellig) synoviosarcoom, rabdomyosarcoom, kleincellig osteosarcoom en mesenchymaal chondrosarcoom. De differentiële diagnostiek van deze tumoren is lastig vanwege de afwezigheid van karakteristieke morfologische kenmerken. Met immunohistochemie en conventionele histochemische kleuringen kunnen vele van deze entiteiten reeds onderscheiden worden. Hoewel het transmembraan glycoproteïne MIC2/CD99 sterk tot expressie komt in, wordt CD99-immunoreactiviteit ook in verschillende andere small-blue-round-celltumoren gevonden. Op kleine botbiopten kan het onderscheid tussen, mesenchymaal chondrosarcoom en kleincellig osteosarcoom onmogelijk zijn, aangezien de karakteristieke kraakbeenmatrix respectievelijk het fijnmazige osteoïd in het biopt kunnen ontbreken, en alle positief zijn voor CD Het kan uitkomst bieden om, door middel van RT- PCR op RNA geïsoleerd uit vriesmateriaal, de t(11;22) (q24;q12) of de t(21;22)(q22;q12), die karakteristiek zijn voor het, aan te tonen. 18 Wanneer alleen paraffinemateriaal beschikbaar is, kan FISH worden gebruikt om aan te tonen dat het EWSR1-gen, op chromosoom 22, betrokken is bij een translocatie. Bij lokalisatie in de weke delen doen zich problemen voor in het onderscheid tussen slecht gedifferentieerd synoviosarcoom en, aangezien de morfologie en het immunohistochemische profiel identiek kunnen zijn (CD99-positief, EMA-positief). Het aantonen van een EWSR1- of SYT-herschikking is essentieel om tot de juiste diagnose en dus tot de juiste therapie te komen. Translocatiedetectie wordt niet alleen toegepast voor classificatie, maar wordt ook gebruikt voor de detectie van minimal residual disease (MRD) van in beenmergbiopten. Dit gebeurt momenteel nog in studieverband. Terwijl het met een HE-kleuring vaak onmogelijk is om hematopoëse (met name de erytropoëse) van tumorcellen te onderscheiden, kan met de zeer sensitieve PCRtechniek de aan- of afwezigheid van een bekend translocatietype worden aangetoond. Somatische genmutaties Naast de grote groep bot- en wekedelentumoren die zich kenmerkt door chromosomale translocaties, is er ook een beperkte groep waarin specifieke genmutaties kunnen worden aangetoond. Specifieke somatische mutaties kunnen vaak gebruikt worden in de diagnostiek, maar zullen ook steeds meer een rol spelen als therapeutisch target. Gastro-intestinale stromaceltumoren en KIT De gastro-intestinale stromaceltumor (GIST) is de meest voorkomende mesenchymale tumor van de tractus digestivus en is met name in de maag en het duodenum gelokaliseerd. De incidentie in Nederland wordt geschat op 12 per miljoen inwoners. 19 Het histologische beeld is karakteristiek, waarbij zowel een spoelcellig fenotype (~70%), een epitheloïd fenotype (~20%), als een combinatie van beide kan worden gezien. Het klinische beloop van GIST s is moeilijk te voorspellen. De belangrijkste parameters bleken de afmeting van de tumor en het aantal mitosen. Wereldwijd heeft men daarom afgesproken om op basis van deze kenmerken een risicoinschatting te geven bij de diagnose van GIST. 20 De meeste GIST s (85-90%) hebben een activerende mutatie in het KIT-gen, die gelokaliseerd is op chromosoom 4q Het gen codeert voor een type III-receptor tyrosinekinase-eiwit. Mutaties in het KIT-gen worden voornamelijk gevonden in het juxtamembraandomein (exon 11), en in mindere mate in de exonen 9, 13 en 17 (zie Tabel 3). De mutaties leiden tot ligandonafhankelijke signaaltransductie, die de cel aanzet tot delen. GIST was een van de eerste solide tumoren waarbij therapie specifiek gericht tegen de moleculaire afwijking effectief bleek. De activiteit van KIT kan worden geremd door imatinib (Glivec ), een klein molecuul kinaseremmer, toe te dienen. De overexpressie van KIT als gevolg van de activerende N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E VOL. 4 NR

8 mutatie kan worden aangetoond door middel van immunohistochemie met CD117. Circa 95% van de GIST s is positief voor CD117, wanneer conform de internationale consensus geen antigeenretrieval wordt gebruikt. Van de GIST s zonder KIT-mutatie heeft 35% een mutatie in de receptor voor plateletderived groeifactor type A (PDGFRA), een tyrosinekinasereceptor uit dezelfde familie als KIT. In deze gevallen is de immunohistochemie voor CD117 vaak zwak of zelfs negatief. Ook wordt vaker een epitheloïd fenotype gezien bij histologie. Een subset van de GIST s met mutaties in PDGFRA is gevoelig voor imatinib (zie Tabel 3, pagina 243). 21,22 Naast immunohistochemie voor CD117 wordt bij de diagnostiek van GIST s mutatieanalyse gebruikt. Dit is geïndiceerd bij verdenking op een CD117- negatieve GIST, aangezien een subset hiervan gevoelig is voor imatinib. Mutatieanalyse kan worden verricht door middel van sequentieanalyse op DNA dat geïsoleerd is uit paraffine-ingebed materiaal. Daarnaast kunnen het type en vooral de locatie van de mutatie, de respons op imatinib voorspellen. Circa 80% van de mutaties bevindt zich in exon 11. Deze zijn geassocieerd met een goede respons op imatinib. Circa 10% van de mutaties wordt gevonden in exon 9. Dit betreft vaak agressievere tumoren, met name gelokaliseerd in de dunne darm. 23 GIST s met exon 9-mutaties reageren minder goed op imatinib dan GIST s met exon 11-mutaties. Mutaties in exon 13 en exon 17 zijn zeldzaam en betreffen vaak specifieke puntmutaties. Daarnaast kan mutatieanalyse van belang zijn bij secundaire resistentie. Een deel van de tumoren wordt na een aanvankelijk goede respons uiteindelijk ongevoelig voor imatinib. Dit wordt veroorzaakt door additionele puntmutaties, met name in de kinasedomeinen van KIT (exon 13 en exon 17) of PDGFRA (D842V), door amplificatie van KIT of PDGFRA, of door verlies van KIT-expressie (KITonafhankelijke resistentie). 24 Deze tumoren kunnen vervolgens behandeld worden met sunitinib (Sutent ). 25 Momenteel worden alternatieve therapieën ontwikkeld die elders in de KIT-cascade aangrijpen. Expressie van CD117 wordt ook wel in andere wekedelentumoren beschreven. Dit aantal is echter beperkt wanneer conform de consensus wordt afgezien van antigeen retrieval. 26 Bovendien bleek dit niet geassocieerd te zijn met mutaties in KIT, noch met een respons op imatinib. Er is wel een rol weggelegd voor imatinib in de behandeling van DFSP. Dit betreft een oppervlakkig gelokaliseerd laaggradig sarcoom met vaak een langdurig beloop. DFSP heeft een specifieke chromosomale afwijking, vaak een ringchromosoom, die leidt tot de amplificatie van PDGFB (zie Tabel 1, pagina 239). De activiteit hiervan kan worden geremd met imatinib. Fibreuze dysplasie, myxomen en GNAS1 Fibreuze dysplasie is een benigne fibro-osseuze laesie in de medulla van een of meerdere botten. De mono-ostotische vorm komt 6 keer vaker voor dan de poly-ostotische fibreuze dysplasie. Deze laatste kan geassocieerd zijn met endocrinopathieën (inclusief pubertas praecox, thyreotoxicose, acromegalie en Cushingsyndroom) en café-au-laitpigmentatie in het niet-erfelijke McCune-Albrightsyndroom (MIM ). Fibreuze dysplasie werd geruime tijd als een niet-neoplastisch proces beschouwd. De aanwezigheid van chromosomale afwijkingen suggereren echter een neoplastische origine. 27 Fibreuze dysplasie wordt gekenmerkt door activerende mutaties in het Gs-α (GNAS1)-gen dat gelokaliseerd is op chromosoom 20q12-q13.3. Het codeert voor de α-subunit van het stimulerende guanine nucleotidebindende (G)-proteïne. 28 G-proteïnen koppelen extracellulaire receptoren aan intracellulaire effectorenzymen en ionkanalen, waarmee zij de cellulaire respons op een externe stimulus mediëren. Bij patiënten met McCune-Albrightsyndroom wordt een postzygotische somatische activerende GNAS1-mutatie gevonden. Fibreuze dysplasie, McCune-Albrightsyndroom en non-skeletale geïsoleerde endocriene laesies zijn dus alle geassocieerd met GNAS1- mutaties. Zij vertegenwoordigen een spectrum van fenotypische expressie van dezelfde onderliggende aandoening, als verschillende patronen van een somatisch mozaïcisme. 28 Daarnaast worden GNAS1- mutaties gevonden in (intramusculaire en celrijke) myxomen. 29 Wanneer fibreuze dysplasie en intramusculaire myxomen samen voorkomen, is sprake van het Mazabraudsyndroom. 30 In een diagnostische setting kan het aantonen van GNAS1-mutaties soms behulpzaam zijn. Fibroblastair (of fibreuze dysplasie-achtig) laaggradig osteosarcoom is de belangrijkste differentiële diagnose van fibreuze dysplasie, vanwege zijn laaggradig maligne gedrag. Terwijl de R201-mutatie bij vrijwel alle gevallen van fibreuze dysplasie wordt gevonden, lijkt er een lage prevalentie van GNAS1-mutaties in fibroblastair laaggradig osteosarcoom te zijn. 31 In de tibia en fibula hoort osteofibreuze dysplasie ook in de differentiaaldiagnose van fibreuze dysplasie, GNAS1-mutaties zijn hierbij echter afwezig VOL. 4 NR N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E

9 Aanwijzingen voor de praktijk 1. De detectie van specifieke chromosomale translocaties kan bruikbaar en in bepaalde gevallen zelfs onmisbaar zijn bij de differentiële diagnostiek, bijvoorbeeld bij de small-blue-roundcelltumoren. 2. Translocatiedetectie kan worden verricht met reversetranscriptase-pcr op RNA dat geïsoleerd is uit vriesmateriaal, of met FISH-analyse op niet-ontkalkt formalinegefixeerd paraffineingebed materiaal. 3. KIT- en PDGFRA-mutatieanalyse zijn geïndiceerd bij CD117-negatieve gastro-intestinale stromacel tumoren. 4. Het type mutatie in KIT kan de respons op imatinib voorspellen. Conclusie De laatste decennia is de genetische achtergrond steeds belangrijker geworden voor de classificatie van bot- en wekedelentumoren. Om tot een accurate diagnose te komen, wordt in centra waar veel sarcomen worden behandeld dan ook regelmatig een beroep gedaan op aanvullende moleculaire diagnostiek. Het aantonen van specifieke translocaties of genmutaties is niet alleen behulpzaam bij het bevestigen van de diagnose, zoals die werd gesuggereerd op basis van de klassieke morfologie en immunohistochemie, maar is met name behulpzaam in die gevallen waar de morfologie, het immunohistochemische profiel of de klinische presentatie ongewoon is. Daarnaast is de laatste jaren duidelijk geworden dat mutatieanalyse essentieel kan zijn om in te schatten of bepaalde gerichte therapie zinvol zal zijn. Het prototype hiervan is tyrosinekinaseremming door middel van imatinib bij GIST, waarbij het type mutatie de respons kan voorspellen. De immer voortgaande opheldering van de genetische achtergrond van de verschillende mesenchymale tumortypen zal dus niet alleen bijdragen aan een betere classificatie van tumoren, waarbij morfologie en genetica kunnen worden geïntegreerd. Het zal in de toekomst wellicht ook leiden tot de identificatie van mogelijke targets voor therapie, en een moleculaire subclassificatie van tumortypen, waarbij therapie individueel moleculair kan worden afgestemd. Referenties 1. World Health Organization Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of Soft Tissue and Bone. IARCPress, Lazar A, Abruzzo LV, Pollock RE, Lee S, Czerniak B. Molecular diagnosis of sarcomas: chromosomal translocations in sarcomas. Arch Pathol Lab Med 2006;130: Guillou L, Coindre JM, Bonichon F, Nguyen BB, Terrier P, Collin F, et al. Comparative study of the National Cancer Institute and French Federation of Cancer Centers Sarcoma Group grading systems in a population of 410 adult patients with soft tissue sarcoma. J Clin Oncol 1997;15: Graadt van Roggen JF. The histopathological grading of soft tissue tumours: current concepts. Curr Diagn Pathol 2001;7: Recommendations for the reporting of soft tissue sarcomas. Association of Directors of Anatomic and Surgical Pathology. Hum Pathol 1999;30: Deyrup AT, Weiss SW. Grading of soft tissue sarcomas: the challenge of providing precise information in an imprecise world. Histopathology 2006;48: Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer 2007;7: Tomlins SA, Rhodes DR, Perner S, Dhanasekaran SM, Mehra R, Sun XW, et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer. Science 2005;310: Sandberg AA, Turc-Carel C, Gemmill RM. Chromosomes in solid tumors and beyond. Cancer Res 1988;48: Janknecht R. EWS-ETS oncoproteins: the linchpins of Ewing tumors. Gene 2005;363: Panoutsakopoulos G, Pandis N, Kyriazoglou I, Gustafson P, Mertens F, Mandahl N. Recurrent t(16;17)(q22;p13) in aneurysmal bone cysts. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Oliveira AM, Hsi BL, Weremowicz S, Rosenberg AE, Dal Cin P, Joseph N, et al. USP6 (Tre2) fusion oncogenes in aneurysmal bone cyst. Cancer Res 2004;64: N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E VOL. 4 NR

10 13. Oliveira AM, Perez-Atayde AR, Dal Cin P, Gebhardt MC, Chen CJ, Neff JR, et al. Aneurysmal bone cyst variant translocations upregulate USP6 transcription by promoter swapping with the ZNF9, COL1A1, TRAP150, and OMD genes. Oncogene 2005;24: Oliveira AM, Chou MM, Perez-Atayde A, Rosenberg AE. Aneurysmal bone cyst: a neoplasm driven by upregulation of the USP6 oncogene. J Clin Oncol 2006;24:e Masuda-Robens JM, Kutney SN, Qi H, Chou MM. The TRE17 oncogene encodes a component of a novel effector pathway for Rho GTPases Cdc42 and Rac1 and stimulates actin remodeling. Mol Cell Biol 2003;23: Oliveira AM, Perez-Atayde AR, Inwards CY, Medeiros F, Derr V, Hsi BL, et al. USP6 and CDH11 oncogenes identify the neoplastic cell in primary aneurysmal bone cysts and are absent in so-called secondary aneurysmal bone cysts. Am J Pathol 2004;165: Granter SR, Renshaw AA, Fletcher CDM, Bhan AK, Rosenberg AE. CD99 reactivity in mesenchymal chondrosarcoma. Hum Pathol 1996;27: Peter M, Gilbert E, Delattre O. A multiplex real-time pcr assay for the detection of gene fusions observed in solid tumors. Lab Invest 2001;81: Goettsch WG, Bos SD, Breekveldt-Postma N, Casparie M, Herings RM, Hogendoorn PC. Incidence of gastrointestinal stromal tumours (GIST) is underestimated: results of a nation-wide study. Eur J Cancer 2005;41; Fletcher CD, Berman JJ, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley BJ, et al. Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors: A consensus approach. Hum Pathol 2002;33: Corless CL, Fletcher JA, Heinrich MC. Biology of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Oncol 2004;22: Corless CL, Schroeder A, Griffith D, Town A, McGreevey L, Harrell P, et al. PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumors: frequency, spectrum and in vitro sensitivity to imatinib. J Clin Oncol 2005;23: Heinrich MC, Corless CL, Demetri GD, Blanke CD, Von Mehren M, Joensuu H, et al. Kinase mutations and imatinib response in patients with metastatic gastrointestinal stromal tumor. J Clin Oncol 2003;21: Debiec-Rychter M, Cools J, Dumez H, Sciot R, Stul M, Mentens N, et al. Mechanisms of resistance to imatinib mesylate in gastrointestinal stromal tumors and activity of the PKC412 inhibitor against imatinib-resistant mutants. Gastroenterology 2005;128: Demetri GD, Van Oosterom AT, Garrett CR, Blackstein ME, Shah MH, Verweij J, et al. Efficacy and safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumour after failure of imatinib: a randomised controlled trial. Lancet 2006;368: Hornick JL, Fletcher CD. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Clin Pathol 2002;117: Dal Cin P, Sciot R, Brys P, De Wever I, Dorfman H, Fletcher CD, et al. Recurrent chromosome aberrations in fibrous dysplasia of the bone: a report of the CHAMP study group. CHromosomes And MorPhology. Cancer Genet Cytogenet 2000;122: Bianco P, Riminucci M, Majolagbe A, Kuznetsov SA, Collins MT, Mankani MH, et al. Mutations of the GNAS1 gene, stromal cell dysfunction, and osteomalacic changes in non- McCune-Albright fibrous dysplasia of bone. J Bone Miner Res 2000;15: Okamoto S, Hisaoka M, Ushijima M, Nakahara S, Toyoshima S, Hashimoto H. Activating Gs(alpha) mutation in intramuscular myxomas with and without fibrous dysplasia of bone. Virchows Arch 2000;437: Faivre L, Nivelon-Chevallier A, Kottler ML, Robinet C, Khau Van Kien P, Lorcerie B, et al. Mazabraud syndrome in two patients: clinical overlap with McCune-Albright syndrome. Am J Med Genet 2001;99: Pollandt K, Engels C, Kaiser E, Werner M, Delling G. Gsalpha gene mutations in monostotic fibrous dysplasia of bone and fibrous dysplasia-like low-grade central osteosarcoma. Virchows Arch 2001;439: Sakamoto A, Oda Y, Iwamoto Y, Tsuneyoshi M. A comparative study of fibrous dysplasia and osteofibrous dysplasia with regard to Gsalpha mutation at the Arg201 codon: polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism analysis of paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn 2000;2: Ontvangen 1 juni 2007, geaccepteerd 21 augustus Correspondentieadres Mw. dr. J.V.M.G. Bovée, patholoog/associate professor Leids Universitair Medisch Centrum Afdeling Pathologie Postbus 9600, L1-Q 2300 RC Leiden Tel.: adres: j.v.m.g.bovee@lumc.nl Belangenconflict: geen gemeld. Financiële ondersteuning: geen gemeld. 247 VOL. 4 NR N E D E R L A N D S T I J D S C H R I F T V O O R O N C O L O G I E