GGO: SCREENING. 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM. Versie 03. In toepassing vanaf 01/11/2016. Verantwoordelijke dienst. Naam functie / dienst Datum 1

Transcriptie

1 Federaal Agentschap vr de Veiligheid van de Vedselketen Bestuur Labratria 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM GGO: SCREENING Versie 03 In tepassing vanaf 01/11/2016 Verantwrdelijke administratie Verantwrdelijke dienst Bestemmelingen FLVVM Sectie GGO Medewerkers Sectie GGO Naam functie / dienst Datum 1 Opmaak / revisie dr: Kristien Orye Sectieverantwrdelijke GGO 10/10/2016 Nazicht dr: Rnny Martens QAM 13/10/2016 Gedkeuring dr: Tny Vanhve Labmanager FLVVM 13/10/ Elektrnische gedkeuring 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 1/16

2 Overzicht van de revisies Revisie Van tepassing vanaf Reden en mvang van de revisie 01 24/03/2016 Overzetten naar nieuwe template. Aanpassen referenties 02 28/06/2016 Crrectie psitieve cntrles screening 03 01/11/2016 Tevegen merkers t35s-pcambia en CaMV (CRT en CAP) Trefwrden GGO Screening PCR 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 2/16

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN Prducten Oplssingen Referenties VERBRUIKSMATERIALEN GEBRUIKSGOEDEREN TOESTELLEN WERKWIJZE VOORBEREIDING - ALGEMEEN VOORBEREIDING BEPALEN PLAATSCHEMA, VERDUNNINGEN EN MIX UITVOERING AFWERKING KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERLOOP UITVOERING RAPPORTERING BIJLAGEN EN AANVERWANTE DOCUMENTEN /I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 3/16

4 1 Del Dit werkvrschrift beschrijft de werkwijze vr de screening van DNA-plssingen van plantaardig materiaal p - de aanwezigheid van plantaardig materiaal, - de aanwezigheid van bepaalde plantentaxa, - de aanwezigheid van smmige merkers vr genetische mdificatie met real-time PCR. 2 Tepassingsgebied De methde is geschikt vr de screening van DNA-extracten verkregen met de CTABextractiemethde. De screening gebeurt met real-time PCR met als indicatr de kleurstf SybrGreen I. Vr elk van de gezchte kenmerken wrdt een specifiek primerpaar gebruikt (zie 3). Beperking: de screening sprt alleen genetische mdificaties p die één f meerdere van de vlgende merkers kunnen bevatten: p35s, tnos, EPSPS, Cry1Ab, pat, bar, pfmv, pnos, ntpii en t35s-pcambia. 3 Wettelijke en nrmatieve dcumenten - ISO 21569:2005 Fdstuffs Methds f analysis fr the detectin f genetically mdified rganisms and derived prducts Qualitative nucleic acid based methds (algemeen). - ISO 21570:2005 Fdstuffs Methds f analysis fr the detectin f genetically mdified rganisms and derived prducts Quantitative nucleic acid based methds + bijlagen. - Primers: plant: WRb: WIV patent, sja: WLe: WIV patent, maïs: WZm: WIV patent, rijst: WOr: WIV patent, klzaad: WBn: WIV patent, lijnzaad: SAD: EURL p35s: Wp35: WIV patent, tns: WNs: WIV patent, EPSPS: ISO 21570, Cry1Ab: WCry1Ab: WIV patent. Papaya: Pap: Literatuur: Detectin f genetically mdified papaya with PCR, Bavarian Health and Fd Safety Authrity, Germany, Pat: Pat/pat: WIV patent, Bar: Pat/bar: WIV patent, pfmv: pfmv: Literatuur: "Develpment f 10 new screening PCR assays fr GMO detectin targeting prmters (pfmv, pnos, pssuara, pta29, pubi, price actin) and terminatrs (t35s, te9, tocs, tg7)" Frederic Debde, Eric Janssen, Gilbert Berben Eur. Fd Res. Technl. pnos: pnos: Literatuur (cfr. pfmv) nptii: APH2: ISO21569 p.38 t35s-pcambia: pcambia: WIV-patent, CaMV: WCRT (WIV) en CAP (CRA) 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 4/16

5 4 Definities en afkrtingen PCR real-time PCR dsdna ssdna primer amplicn Tm epje PC NC CRM CaMV Plymerase Chain Reactin, een PCR-reactie waarbij het verlp van de reactie cntinu gevlgd wrdt, dubbelstrengig DNA, enkelsstrengig DNA, krte sequentie ssdna die zich bindt aan het begin f einde van de gezchte sequentie, het gevrmde DNA tijdens de PCR-reactie, meer bepaald de gezchte sequentie, smelttemperatuur van een amplicn, eppendrfbuisje psitieve cntrle negatieve cntrle gecertificeerd referentiemateriaal Cauliflwer Msaic Virus / Blemklmzaïekvirus 5 Principe PCR is een analysetechniek waarbij geselecteerde DNA-fragmenten vermenigvuldigd wrden zdat de cncentratie ervan hg geneg wrdt vr detectie. De uitvering van PCR vr de screening bestaat uit de vlgende stappen: - denaturatie ( smelten ) van dsdna tt ssdna dr verwarming, - afkelen van het ssdna waarbij krte specifieke sequenties (primers) zich kunnen binden aan hun cmplementaire plaatsen p het ssdna en z krte fragmenten dsdna vrmen, - verlengen van de dubbelstrengige primer/dna-fragmenten dr het enzym Taq- Plymerase met vrming van een nieuwe dubbelstrengige DNA-sequentie. Hierbij kunnen intercalerende kleurstffen zich binden met dsdna waarbij die dan fluresceren bij belichting, - herhalen van de vrige drie stappen. Er wrden twee primers gebruikt (de frward en reverse primer) die samen een bepaalde DNA-sequentie afbakenen. Na een aantal cycli gebeurt vral vermenigvuldiging van de sequentie tussen de twee primers waardr bij elke cyclus het aantal van deze sequenties verdubbelt. Deze expnentiële vermenigvuldiging leidt er te dat zelfs een gering aantal riginele kpijen van een sequentie kan aangreien tt een meetbare cncentratie. De detectie bij real-time PCR gebeurt aan de hand van meting van flurescentie: bij het gebruik van de intercalerende flurescerende kleurstf SybrGreen I treedt er alleen flurescentie p bij binding van de kleurstf met dsdna. De flurescentie is een maat van de heveelheid aanwezige dsdna. Deze reactie is niet-specifiek en reversibel: bij smelten van het dsdna tt ssdna verdwijnt de flurescentie m bij afkelen terug te verschijnen. De belangrijkste aspecten van real-time PCR vr screening zijn: 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 5/16

6 - de gebruikte primers: die bepalen welke DNA-sequentie pgesprd wrdt, - het aantal cycli dat herhaald wrdt. 6 Prestatiekenmerken De LOD met lager zijn dan 1/20 van de wettelijke limiet (0,9%) f 0,045%. De LOD (bepaald p de referentiecncentratie DNA = 10 ng/µl van zuiver parameter DNA (100%)) vr de verschillende parameters wrdt weergegeven in het dcument 2016/I- MET038-D002/LAB/FLVVM Lijst LOD-LOQ. Vr de parameter plant werd er geen LOD bepaald. Deze parameter wrdt in de screening enkel gebruikt m na te gaan f er plantmateriaal aanwezig is in het mnster, maar wrdt niet gebruikt bij de verder interpretatie van de screeningsresultaten. 7 Veiligheidsvrschriften en bijzndere maatregelen Vr veiligheidsmaatregelen en bijzndere vrzrgsmaatregelen: zie 2015/P001- I004/LAB/FLVVM PCR GGO Algemene instructies vr uitvering. 8 Reagentia en hulpstffen Prducten - Bleekwater, - DNA away, - Sybr Fastmix, - primers vr plant, sja, maïs, klzaad, rijst, papaya, lijnzaad, p35s, tns, Cry1Ab, EPSPS, pat, bar, pfmv, pnos, ntpii, t35s-pcambia, CaMV (2016/I-MET038a-L001/LAB/FLVVM Primers screening GGO) Oplssingen - DNAse/RNAsevrij steriel water OPLOS 107, - verdund bleekwater 1:6 OPLOS 116, - primers OPLOS Referenties - Maïs Bt11, MON810, Bt176 - Sja RR, MON Katen GHB119 - Aardappel EH PC CRT, PC CAP - PC t35s-pcambia 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 6/16

7 8.2 Verbruiksmaterialen - epjes van 1,5 ml, - gele cntainers vr bilgisch afval, - handschenen, - PCR-buisje van 10 ml, - pipettips van 1-20 µl, µl en µl met filters, - PCR-plaat GGO, - afdekstrips PCR-plaat. 8.3 Gebruiksgederen - Aandrukplaat vr afsluitstrips, - aandrukrl vr aandrukken plaat in thermcycler, - bekers vr afval, - bewaardzen vr epjes, - huder vr micrtiterplaat, - regelbare pipetten van 2-20 µl, µl en µl, - rekjes vr epjes. 9 Testellen - Micrcentrifuge, - PCR wrkbench, - thermcycler, - vrtexmixer - Plaatcentrifuge - frig 10 Werkwijze Alle stappen van de screening wrden uitgeverd in lkaal Vrbereiding - algemeen - pen de PCR-wrkbench m hem p te starten, - decntamineer de werktafel, de pipetten, de vrtex en de micrcentrifuge met DNA away, - decntamineer het werkblad van de PCR wrkbench,de pipetten, de vrtex en de micrcentrifuge met DNA away, - vul 2 bekers met verdund bleekwater (werktafel + wrkbench) Vrbereiding bepalen plaatschema, verdunningen en mix Zek de te analyseren parameters p vlgens de technische fiche van het mnster in 2016/I- MET038a-F001/LAB/FLVVM Analyses screening GGO. 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 7/16

8 Selecteer aan de hand van de te bepalen parameters en het aantal mnsters het gewenste plaatschema nder de flder M:\Nieuwe prcedures kwaliteit\i-met\\i-met 038 GGO. Vr (ring)mnsters wrdt de screening uitgeverd p 2 van de 3 DNA-extracten van het mnster en elk extract in dupl. De richtlijnen vr de extracten zijn: pbrengst >10 µg/ml, een zuiverheid tussen 1,6 2,0 en vr de trebeling een psitieve waarde (2016/I- MET038/LAB/FLVVM GGO DNA-extractie). Vr de screening wrden 2 epjes meegenmen. Vrkeur gaat naar de epjes waarvan de DNA-cncentratie en de DNA-zuiverheid vlden aan de hierbven vermelde richtlijnen. Indien de cncentratie van de verschillende extracten kleiner is dan 10 µg/ml, dan wrdt het extract nverdund gebruikt: de screening wrdt wel uitgeverd. Indien de zuiverheid en/f de trebeling niet vlden vr de verschillende extracten wrdt de screening uitgeverd p deze extracten. Mgelijke inhibitie wrdt altijd gecntrleerd met de inhibitietest. Open de gewenste template en sla deze p nder de flder M:\Berekeningen\GGO\ Resultaten\Jaartal\Maand als JJJJMMDD_SG_ mnsternummer(s)_matrix.xlsx. - Open de tab Plaatschema en vervlledig dr de psitieve en negatieve cntrle, blanc en de mnsternummers met de bijbehrende nummers van de epjes in te vullen. Druk de plaatlayut af. Vul naam en datum in. - Open de tab DNAVerdunning vr het berekenen van de verdunningen van de gebruikte DNA-extracten. Vul de identificatie van de cntrles in de linkertabel en van de mnsters in de rechtertabel in, de vereenstemmende cncentraties van de cntrles en mnsters wrden vergenmen van de werkbladen afkmstig van de spectrftmeter (INVAPP398, C:\Jasc Data\DNA cncentratie\werkblad\jjjj\mm: DNA cncentratie_datum.ufwd) en 2016/I-MET038-L001/LAB/FLVVM Overzichtslijst CRM s GGO (M:\Nieuwe prcedures Kwaliteit\I-MET\I-MET 038). OPMERKING: indien de cncentratie van het mnster kleiner is dan 10 µg/ml, dan wrdt het extract nverdund gebruikt en wrdt nverdund ingevuld als cncentratie. In de tabel wrden de vlumes (µl) DNA-extract en water berekend die meten gemengd wrden m het gewenste vlume met de gewenste cncentratie te krijgen (standaard: 10 ng/µl). Druk dit blad af. Vul naam en datum in. - Open de tab SYBGREEN met de berekende vlumes vr het aanmaken van de mix. In de tabellen zijn de vlumes (µl) Sybr Fastmix, frward en reverse primer en water berekend vr elke bendigde primercmbinatie. Druk dit blad af. - Sla het rekenblad p. Is het niet mgelijk m een vrgeprgrammeerde template te gebruiken, pen dan 2016/I- MET038a-F002/LAB/FLVVM Template SG algemeen en sla deze p nder de flder M:\Berekeningen\GGO\Resultaten\Jaartal\Maand als JJJJMMDD_SG_ mnsternummer(s)_matrix.xlsx. - Open de tab Plaatschema. 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 8/16

9 Vul alle gegevens vr de rijen en de klmmen in (primers, blanc s, mnsters, cntrles, ). Druk de plaatlayut af. Vul naam en datum in. - Open de tab DNAVerdunning vr het berekenen van de verdunningen van de DNAextracten. Vul in: de gewenste eindcncentratie in ng/µl (standaard: 10 ng/µl), het bendigde vlume (aantal te vullen wells met het mnster x 5 µl/well + bendigd vlume vr eventuele verdunningen µl m verliezen te cmpenseren); per vlume een nieuwe tabel gebruiken, de identificatie van de mnsters / cntrles, (1 tabel per gewenst vlume), de vereenstemmende cncentraties van de cntrles en mnsters wrden vergenmen van de werkbladen afkmstig van de spectrftmeter (INVAPP398, C:\Jasc Data\DNA cncentratie\werkblad\jjjj\mm: DNA cncentratie_datum.ufwd) en 2016/I-MET038-L001/LAB/FLVVM Overzichtslijst CRM s GGO (M:\Nieuwe prcedures Kwaliteit\I-MET\I-MET 038 GGO). OPMERKING: indien de cncentratie van het mnster kleiner is dan 10 µg/ml, dan wrdt het extract nverdund gebruikt en wrdt nverdund ingevuld als cncentratie. In de tabel wrden de vlumes (µl) DNA-extract en water berekend die meten gemengd wrden m het gewenste vlume met de gewenste cncentratie te krijgen. Druk dit blad af. Vul naam en datum in. - Open de tab SYBGREEN vr het berekenen van de vlumes vr het aanmaken van de mix. Vul het ttaal aantal wells in (aantal te vullen wells met de mix +1-2 m verliezen te cmpenseren). Per aantal een nieuwe tabel gebruiken en de primer bven de tabel nteren. In de tabellen wrden de vlumes (µl ) Master Mix, frward en reverse primer en water berekend vr elke bendigde primercmbinatie. Druk dit blad af. - Sla het rekenblad p Uitvering - Verdunnen van het DNA-extract (uitveren p de vrziene tafel tegenver de PCRwrkbench): neem de ndige DNA-extracten (k extractieblanc en cntrles), pipetteer in een epje van 1.5 ml vlgens de tabel DNAVerdunning (10.2) de vereiste heveelheden DNAse/RNAsevrij steriel water en DNA-extract. Vrtex en centrifugeer krt. (2x). Bewaar de verdunningen en de blanc in de frig tt het pipetteren van de plaat en plaats de riginele extracten terug in de diepvries (tenzij de extracten nverdund p plaat meten gezet wrden). - Maken van de mix (uitveren in de PCR-wrkbench): bepaal de ttale heveelheid Sybr Fastmix die ndig is p basis van de tabel SYBRGREEN en neem het vereiste aantal buisjes Sybr Fastmix uit de diepvriezer. Laat ntdien. 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 9/16

10 Neem vr elke primer (frward en reverse) een epje (evt. reserve) uit de diepvriezer en laat ntdien, vul een epje met DNAse/RNAsevrij steriel water, maak vr elke primercmbinatie een mix dr de berekende vlumes uit de tabel in een epje te pipetteren. Er wrden dus evenveel mixen klaargemaakt als er primercmbinaties zijn, vrtex en centrifugeer krt af (2x). Plaats de resten van de Sybr Fastmix en de primers terug in de diepvriezer. - Verdelen van de mix ver de micrtiterplaat (uitveren in de PCR-wrkbench): plaats de micrtiterplaat, met well A1 linksbven, in de huder, pipetteer vr elke primercmbinatie 20 µl van de mix in de wells vlgens het plaatschema. - Verdelen van de DNA-extracten / blanc / cntrles ver de micrtiterplaat (uitveren p de tafel tegenver de PCR wrkbench): pipetteer 5 µl (verdund) extract / blanc / cntrles in de wells vlgens het plaatschema. - Sluit de gebruikte klmmen van de plaat af met afdekstrips: niet gebruikte klmmen mgen pen blijven, druk de strips ged aan met de aandrukplaat (rij per rij en klm per klm). - Centrifugeer de plaat gedurende 1 min. bij 4000 rpm in de plaatcentrifuge - Start de PC en de thermcycler p: Wanneer de self-test van de thermcycler ged verlpen is, dubbelklikken p het ikn BiRad CFX Manager IDE: username: GGO, paswrd: niets inveren, enter. Plaats de plaat in de thermcycler en druk die vast met de aandrukrl, let p de riëntatie: well A1 = linksbven. View / Startup Wizard f klik p het icn User-Defined Run Setup. Tab 1: Prtcl: Selecteer nder Express Lad :GGO_PrtclSybrgreen_ WIV_05.prcl/ en klik p Next Tab 2: Plate: Selecteer nder Express Lad : Quick Plate_96 wells_sybr Only.pltd/ en klik p Next, Tab 3: Start Run: indien prtcl en plate OK: klik p Start Run rechts nder en pslaan nder de flder M:\Berekeningen\GGO\Ruwe data in het mapje van het huidige jaar en de huidige maand; indien NOK, tab 1 en/f 2 eerst crrigeren. - Verwijder de bekers met afval (in de gele bak vr bilgisch afval), decntamineer de werktafel, het werkblad van de PCR-wrkbench en de pipetten met DNA away. - Sluit de PCR wrkbench Afwerking Na aflp van de analyse de plaat uit de thermcycler verwijderen en in een plastic zakje in de gele bak vr bilgisch afval leggen. 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 10/16

11 11 Kwaliteitscntrle Vr de kwaliteitscntrle wrden per plaat de vlgende cntrles meegenmen: - Psitieve cntrle van sja en/f maïs en/f klzaad en/f rijst en/f papaya en/f lijnzaad (afhankelijk van de technische fiche van het/de mnster(s)). Psitieve cntrle sja: CRM sja, RRSja, bevat genetisch gemdificeerde sja en is psitief vr plant, sja, p35s, tns en EPSPS. Als psitieve cntrle vr pat en Cry1Ab wrdt CRM maïs Bt11 gebruikt; vr pfmv (PC pfmv) wrdt er gewerkt met een verdunning van de CRM MON Psitieve cntrle maïs: CRM maïs Bt11 bevat genetische gemdificeerde maïs en is psitief vr plant, maïs, p35s, tns, Cry1Ab en pat. Psitieve cntrle klzaad: vr klzaad wrdt als psitieve cntrle een DNA-extract van klzaad gebruikt, waarvan de DNA-cncentratie >10 µg/ml en de DNA-zuiverheid gelegen is tussen 1.6 en 2.0. Dit extract is psitief vr de parameters plant en klzaad. Psitieve cntrle rijst: vr rijst wrdt als psitieve cntrle een DNA-extract van rijst gespiked met de maïs CRM s Bt11 en MON810 gebruikt (300mg rijst + 100mg 2% Bt mg 2% MON810, geëxtraheerd vlgens 2016/I-MET038/LAB/FLVVM). Dit extract is psitief vr de parameters plant, rijst, p35s, tnos en Cry. Daarnaast wrdt als psitieve cntrle vr de merker Bar (PC bar) een verdunning van de CRM GHB119 gebruikt. Vr de merker t35s-pcambia wrdt als psitieve cntrle een plasmide (afkmstig van het WIV) gebruikt, dat verdund is tt p het niveau van x cpijen. Vr papaya wrdt als psitieve cntrle een DNA-extract van papaya gebruikt dat gespiked werd met CRM Bt11 (500mg papaya + 100mg 1% Bt11, geëxtraheerd vlgens 2016/I-MET038/LAB/FLVVM). Dit extract is psitief vr de parameters plant, papaya, p35s en tnos. Psitieve cntrle lijnzaad: vr lijnzaad wrdt als psitieve cntrle een DNA-extract van lijnzaad gebruikt dat gespiked werd met de aardappel CRM EH (200mg lijnzaad + 100mg 100% EH , geëxtraheerd vlgens 2016/I-MET038/LAB/- FLVVM). Dit extract is psitief vr plant, lijnzaad, pnos en nptii. Vr CaMV wrden twee psitieve cntrles gebruikt : PC CRT en PC CAP. - Negatieve cntrle: een mnster plantaardig materiaal dat geen sja, maïs, klzaad, papaya, lijnzaad f rijst bevat en niet genetisch gemdificeerd is en dus alleen een psitieve reactie geeft p de parameter plant. - een extractieblanc: een epje dat de vlledige extractieprcedure drlpen heeft, maar waarbij het mnster vervangen werd dr water, - van elk te nderzeken mnster wrden 2 DNA-extracten (2 epjes) elk in dupl ingezet vr screening, 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 11/16

12 - van elk mnster wrdt een 10-vudige verdunning in dupl ingezet als cntrle p inhibitie. De criteria vr de cntrlemnsters zijn: - PC sja met psitief zijn vr plant, sja, p35s, tns en EPSPS - PC pfmv met psitief zijn vr pfmv - PC maïs met psitief zijn vr plant, maïs, p35s, tns, pat en Cry1Ab, - PC klzaad met psitief zijn vr plant en klzaad, - PC rijst met psitief zijn vr plant en rijst, p35s, tnos en Cry1Ab, - PC Bar met psitief zijn vr bar, - PC papaya met psitief zijn vr plant, papaya, p35s en tnos, - PC lijnzaad met psitief zijn vr plant, lijnzaad, pnos en nptii - PC t35s-pcambia met pstief zijn vr t35s-pcambia - PC CRT en PC CAP met respectievelijk psitief zijn vr CRT en vr CAP - NC mag alleen psitief zijn vr plant, - de blanc s (extractieblanc) meten negatief zijn p alle parameters (Ct plant > 29), - inhibitietest: Ct-verschil > 2,5. Indien aan een f meerdere van deze vrwaarden niet is vldaan, dan met de rzaak gezcht wrden en kunnen bv. een f meer van de vlgende acties ndernmen wrden: - herhalen van de analyse (extractie en/f screening), - herhalen van de analyse met een ander extract van CRM f van materiaal gespiked met CRM als PC, - bij psitieve blanc s: bevestigen en indien bevestigd (= cntaminatie) de DNA-extractie herhalen, - indien alle resultaten negatief: prbleem pspren en plssen. Indien het Ct-verschil vr de inhibitietest <2,5, dan met een uitgebreide inhibitietest ingezet wrden van de extracten: - Maak van ieder extract vanuit de werkplssing (10 µg/ml f nverdund) de vlgende verdunningen 1/4, 1/8, 1/16 en 1/32. - Zet iedere verdunning in tweevud p PCR-plaat en screen vr de verschillende merkers getest in de eerste analyse. - Bereken nadien de gemiddelde Ct-waarde (van het geteste species) van de verdunde extracten en zet deze uit in grafiek ten pzichte van de 2lg (lgaritme met basis 2) van de verdunningen - Bereken de lineaire regressierechte. - De rechte met vlden aan de vlgende criteria: Helling van de regressierechte: tussen -0,9 en -1,1 (theretische waarde : -1,0), Crrelatiefactr R² > 0,98 - Indien niet vldaan is aan de vrpgestelde criteria, wrdt een nieuwe regressierechte pgemaakt waarbij de eerste verdunning (de laagste) buiten beschuwing genmen werd. (Er wrdt verndersteld dat er ng inhibitie is in die verdunning). Indien er echter wel vldaan is aan de vrwaarden, kan verndersteld wrden dat er geen inhibitie meer is in de eerste verdunning. - De screeningsresultaten van de laagste verdunning waarin geen inhibitie wrdt waargenmen wrden vervlgens berdeeld (zie punt 12). 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 12/16

13 12 Berekening en rapprtering 12.1 Verlp De berekening van de resultaten mvat de vlgende stappen: - bepalen van de Ct s, - selectie van psitieve wells aan de hand van de smeltcurves, - evalueren van de Ct s (cntrles, blanc s, mnsters), - interpreteren van het resultaat Uitvering - Open het rekenblad (10.2) en kpieer het plaatschema van Plaatschema naar Evaluatie. - Open de file met de ruwe data (M:\Berekeningen\GGO\Ruwe data). Linksbven wrden de reactiecurves van alle wells getnd; ga na f het verlp van de curves de typische uitgerkken S-vrm vertnt. Z niet dan kan dit wijzen p een prbleem. Vink het vakje Lg Scale aan. De grafiek wrdt nu getnd met een lgaritmische schaal vr de Y-as. De curves vertnen nu een lineair deel. Hrizntaal lpt er in de grafiek een lijn dr het lineair deel van de curves; deze lijn bepaalt de threshld, de drempelwaarde die gebruikt wrdt m het nummer van de cyclus te bepalen waar de curve die threshld verschrijdt. Deze lijn wrdt vastgelegd dr de sftware, maar kan eventueel manueel verschven wrden. Rechtsnder wrdt een tabel getnd met als meest linkse klm de identificatie van de well en de meest rechtse klm de Ct-waarde, de cyclus (de X-waarde) waarbij de curve de threshld snijdt. Linksnder staat de plaatlayut: van de blauwe wells is de Ct terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbvenhek van de plaat (blauw wrdt grijs) en selecteer klm 1 (enter p 1 en grijs wrdt blauw). Cntrleer de vrm van de curves en kpieer de Ct s in klm 1 van de plaatlayut Overzicht alle resultaten p het rekenblad. Selecteer klm 2 (enter p 1 en blauw wrdt pnieuw grijs en enter p 2 en grijs wrdt blauw), cntrleer de vrm van de curves en kpieer de Ct s in klm 2 van het rekenblad. Herhaal dit vr alle gebruikte klmmen. Wijkt de vrm van de curve af, nteer dit dan in de klm pmerkingen in het rekenblad. Vergelijk de Ct waarden van de wells die negatief meten zijn met die van de psitieve cntrles. De psitieve cntrles meten een duidelijk lagere Ct hebben dan de negatieve wells. Ga na f de Ct van de mnsters significant kleiner is dan de waarden vr de negatieve wells. Z niet, dan is het mnster negatief vr die parameter. 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 13/16

14 Ga na f de wells een signaal bevatten dat afkmstig kan zijn van het amplicn dat kenmerkend is vr de betreffende parameter. Dit gebeurt als vlgt: klik p de tab Melt Curve. De grafieken met de smeltcurves (links bven) en hun afgeleide (rechts bven) wrden getnd, hrizntaal lpt er een lijn dr de afgeleiden. Trek deze lijn eventueel naar beneden m k het smeltpunt van de kleinere pieken te zien. Linksnder staat de plaatlayut: van de blauwe wells is het smeltpunt terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbvenhek van de plaat (blauw wrdt grijs) en selecteer de psitieve cntrle van primer 1 (enter p de well en grijs wrdt blauw). Berdeel nu alle andere wells vr dezelfde primercmbinatie/parameter dr ze 1 vr 1 aan te klikken en na te gaan f ze een piek vertnen met een maximum bij dezelfde temperatuur als de psitieve cntrle met maximale afwijking van 1 C (Tm plant: 76,5-77,5 C; Tm sja: 81,0-81,5 C, Tm maïs: 76,5 C, Tm klzaad: 79,5-80,0 C, Tm Rijst: 76,5-77,0 C, Tm p35s: 76,5-77,0 C, Tm tns: 72,0-72,5 C, Tm EPSPS: 76,0-76,5 C, Tm Cry1Ab: 78,5-80,5 C, Tm Pap: 78,0-78,5 C, Tm SAD: 78,5-79,5 C, Tm pnos: C; Tm nptii: 84,5-85,5 C, Tm bar: C, Tm pat: C, Tm pfmv: 76,5-77,5 C, Tm t35s-pcambia: C, Tm CRT: C, Tm CAP: C). Indien er geen crrespnderende piek aanwezig is, is het mnster vr die parameter negatief en klik je de well weer weg. Kpieer in het rekenblad de tabel Overzicht alle resultaten naar Overzicht resultaten na selectie p basis van de Tm en verwijder in deze laatste tabel de Ct waarden van de negatieve mnsters. - Berdeel de resultaten: Per mnster wrdt iedere well vr iedere parameter eerst afznderlijk bekeken: indien bij een well vr een parameter (plant, sja, maïs, klzaad, rijst, papaya, lijnzaad, p35s, tns, EPSPS, Cry1Ab, pat, bar, pfmv, pns, nptii, t35spcambia f CaMV (CRT f CAP) ) in de smeltcurve geen piek aangetrffen wrdt waarvan de smelttemperatuur Tm vereenstemt met die van de psitieve cntrle (zie hger), dan is het resultaat vr die parameter in die well negatief. Indien bij een well vr een parameter (plant, sja, maïs, klzaad, rijst, papaya, lijnzaad, p35s, tns, EPSPS, Cry1Ab, pat, bar, pfmv, pns, nptii, pcambia f CaMV (CRT f CAP)) in de smeltcurve een duidelijke piek aangetrffen wrdt waarvan de smelttemperatuur Tm vereenstemt met die van de psitieve cntrle (zie hger), dan is het resultaat vr die parameter in die well psitief. Vr de berdeling van een parameter van een mnster wrden de resultaten van alle wells samen bekeken: Indien bij het mnster 3 f 4 van de 4 wells negatief zijn vr een parameter, dan is het mnster negatief vr die parameter. Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij Cnclusie naast de parameter Afwezig. Indien bij het mnster 3 f 4 van de 4 wells psitief zijn vr een parameter, dan is het mnster psitief vr die parameter. Hu bij de berdeling rekening met de LOD van de parameter: Indien de gemiddelde Ct vr deze parameter < Ct (LOD): Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij Cnclusie naast de parameter Aanwezig, 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 14/16

15 Indien de gemiddelde Ct vr deze parameter > Ct (LOD): Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij Cnclusie naast de parameter <LOD alsk de gemiddelde Ct-waarde. Indien bij het mnster van het ene extract de beide wells psitief zijn vr de parameter en vr het andere extract de beide wells negatief zijn vr de parameter, wrden vlgende gevallen nderscheiden: Indien de Ct-waarden van de psitieve wells > Ct (LOD): Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij Cnclusie naast de parameter: <LOD, Indien de Ct-waarden van de psitieve wells < Ct (LOD): ver dan een heranalyse (screening) uit waarbij het derde extract van het mnster meegenmen wrdt. Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij pmerkingen. Indien bij het mnster van ieder extract 1 well psitief is vr de parameter, wrden vlgende gevallen nderscheiden: Indien de Ct-waarden van de psitieve wells > Ct (LOD): Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij Cnclusie naast de parameter: <LOD, Indien de Ct-waarden van de psitieve wells < Ct (LOD): ver een heranalyse (screening) uit en Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij pmerkingen, Vr een rijstmnster genmen vlgens de technische fiches IEC 223 en IEC 389 wrdt in beide gevallen de screening herhaald (er wrdt geen rekening gehuden met de LOD). Nteer p het p het tabblad Evaluatie bij pmerkingen. Indien bij een mnster, dat maïs, sja en/f klzaad bevat, vr de parameters p35s en/f tns en/f EPSPS en/f Cry1Ab en/f pat en/f in de smeltcurve een duidelijke piek aangetrffen wrdt met dezelfde Tm als de psitieve cntrle (zie hger), dan bestaat het vermeden dat dit mnster psitief is vr genetische mdificatie. Bij Ct < Ct LOD met de aanwezigheid van mdificatie bevestigd wrden (2016/I-MET038b/LAB/FLVVM GGO Bevestiging). Indien in een mnster p35s en klzaad gevnden wrdt en p35s kan niet verklaard wrden dr de aanwezigheid van tegelaten maïs, sja- en klzaad GGO s, is het aangeraden het mnster te testen p de aan- f afwezigheid van CaMV (het blemklmzaïekvirus dat k kan vrkmen p klzaad). Bij rijst, papaya en lijnzaad wrdt er geen verdere bevestiging uitgeverd aangezien het nietgeautriseerde GGO s betreft en deze enkel getest wrden dr het NRL mits akkrd van het hfdbestuur van DG Labratria Rapprtering Vul de resultaten in de LIMS in als aangetnd f niet aangetnd, aangevuld met een eventuele pmerking. Op het beprevingsverslag kmen de vlgende vermeldingen: - indien niet aangetnd ingevuld wrdt: de aanwezigheid is niet aangetnd in cncentraties bven LOD, - indien aangetnd ingevuld wrdt: de aanwezigheid is aangetnd in cncentratie bven LOD, 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 15/16

16 - eventuele pmerkingen. Indien de DNA-cncentratie van het mnster 10 µg/ml is: - aangetnd bven referentie LOD: aangetnd, - aangetnd nder referentie LOD: niet aangetnd en pmerking parameter gedetecteerd in cncentraties < LOD, - niet aangetnd: niet aangetnd. Indien de DNA-cncentratie van het mnster < 10 µg/ml: - aangetnd bven referentie LOD: aangetnd, - aangetnd nder referentie LOD: niet aangetnd en pmerking parameter gedetecteerd in cncentraties < LOD, - niet aangetnd: niet aangetnd en pmerking DNA-cncentratie na extractie te laag vr de bepaling van GGO screening elementen. Opmerking: Vr mnsters genmen in het kader van de technische fiches IEC 223 en IEC 389 (mnsters Chinese rijst en rijstprducten genmen in het kader van het uitveringsbesluit 884/2011) wrdt vr de interpretatie van de resultaten geen rekening gehuden met de LOD van de parameters p35s, tnos en Cry1Ab. Zals vermeld in 2016/I-MET038/LAB/FLVVM wrden vr de mnsters rijst vier submnsters genmen van het ntvangen mnster, wrden per submnster twee extracten p PCR gezet. Indien bij een van de extracten vr de bvengenemde merkers een signaal geregistreerd wrdt met een Ct<40, wrdt vr deze parameter als resultaat aangetnd ingevuld. 13 Bijlagen en aanverwante dcumenten 2015/P001-I004/LAB/FLVVM PCR GGO Algemene instructies vr uitvering 2016/I-MET038/LAB/FLVVM GGO DNA-extractie 2016/I-MET038-F002/LAB/FLVVM Verlp DNA-extractie 2016/I-MET038-F005/LAB/FLVVM Werklijst GGO 2016/I-MET038-L001/LAB/FLVVM Overzichtslijst CRM s GGO 2016/I-MET038-D001/LAB/FLVVM Analyseschema DNA-extractie GGO 2016/I-MET038-D002/LAB/FLVVM Lijst LOD-LOQ 2016/I-MET038a-F001/LAB/FLVVM Analyses screening GGO 2016/I-MET038a-F002/LAB/FLVVM Template SG algemeen 2016/I-MET038a-L001/LAB/FLVVM Primers screening GGO 2016/I-MET038b/LAB/FLVVM GGO: bevestiging Templates screening (M:\Nieuwe prcedures Kwaliteit\I-MET\I-MET038 GGO) 2016/I-MET038a/LAB/FLVVM v.03 16/16