GGO: BEVESTIGING. Versie 04 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap vr de Veiligheid van de Vedselketen FLVVM LAB 24 I-MET-038b GGO: BEVESTIGING Versie 04 Datum van tepassing Opgesteld dr : Kristien Orye, sectieverantwrdelijke GGO, Nazicht dr : Rnny Martens, QAM FLVVM, Gedkeuring vrijgave dr : Tny Vanhve, Labmanager FLVVM a.i., Beheer & lcatie geldende versie : FLVVM, Centrale server FLVVM Bestemmelingen : Sectie GGO Trefwrden : GGO, bevestiging, identificatie en kwantificatie LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 1/15

2 OVERZICHT WIJZIGINGEN (*) Herziening dr/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draag-wijdte van de herziening IDV 13/12/2010 Opmerking interne audit FLVVM2010/09 Punt 8 TVDS 21/11/2011 RM 18/07/2012 KO 07/10/2013 Nieuwe lay-ut Aanpassing referenties Aanpassing gebruik sftware PCR Aanpassing lcatie templates Aanpassen verwijzing dcumenten Aanpassen tepassingsgebied Aanpassen benaming tabblad in excell-dc vlledige tekst en 12.4 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 2/15

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA Prducten Oplssingen Referenties VERBRUIKSMATERIALEN GEBRUIKSGOEDEREN TOESTELLEN WERKWIJZE VOORBEREIDING - ALGEMEEN VOORBEREIDING BEPALEN IDENTIFICATIE EN/OF KWANTIFICATIE, PLAATSCHEMA, VERDUNNINGEN EN MIX Identificatie Kwantificatie UITVOERING AFWERKING KWALITEITSCONTROLE IDENTIFICATIE KWANTIFICATIE BEREKENING EN RAPPORTERING VERLOOP UITVOERING IDENTIFICATIE RAPPORTERING IDENTIFICATIE UITVOERING KWANTIFICATIE RAPPORTERING KWANTIFICATIE VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN PROCEDURES/INSTRUCTIES FORMULIEREN LIJSTEN LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 3/15

4 1 Del Dit werkvrschrift beschrijft de werkwijze vr de bevestiging (identificatie en kwantificatie) van genetische mdificaties in DNA-plssingen van plantaardig materiaal met real-time PCR. 2 Tepassingsgebied De methde is geschikt vr de identificatie en kwantificatie p DNA-extracten verkregen met de CTAB-extractiemethde. Identificatie en kwantificatie gebeuren met real-time PCR met prbes als indicatr. Vr elk van de gezchte mdificaties wrdt een specifieke cmbinatie van primerpaar en prbe gebruikt (zie 3). Identificatie en kwantificatie wrdt enkel tegepast in het nderzek naar EU-geautriseerde GGO s. In het lab wrdt dit tegepast vr maïs-ggo s en sja-ggo (vermeld in punt 3). 3 Wettelijke en nrmatieve dcumenten - ISO 21570: 2005 Fdstuffs Methds f analysis fr the detectin f genetically mdified rganisms and derived prducts Quantitative nucleic acid based methds + bijlagen. - Primers en prbe: MON40-3-2: Le/RR4: ISO21570, Bt176: Zm1/176: ISO21570, Bt11: Adh2/Bt1011: ISO21570, MON810: Zm1/810: CRL Prtcl MON810 / ISO21570, MON863: Adh1/863: CRL Prtcl MON863, TC1507: Mhm/1507: CRL Prtcl TC1507, NK603: Adh1/603: CRL Prtcl NK603, GA21: Adh1/GA21: CRL Prtcl GA21, DAS59122: Mhm/DAS: CRL Prtcl 59122, MIR604: Adh2/604: CRL Prtcl MIR Definities en afkrtingen Definities/afkrting PCR real-time PCR dsdna ssdna genmisch DNA event primer prbe Verklaring Plymerase Chain Reactin, een PCR-reactie waarbij het verlp van de reactie cntinu gevlgd wrdt, dubbelstrengig DNA, enkelstrengig DNA, ttale heveelheid DNA van niet-gemdificeerd rganisme, een GGO met een welbepaalde plaats van invegen van de mdificatie in het genmisch DNA krte sequentie ssdna die zich bindt aan het begin f einde van de gezchte sequentie, krte sequentie ssdna die chemisch gebnden is aan een detectiesysteem (flurchrm + quencher), LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 4/15

5 amplicn epje PC NC CRM het gevrmde DNA tijdens de PCR-reactie, meer bepaald de gezchte sequentie, eppendrfbuisje psitieve cntrle negatieve cntrle gecertificeerd referentiemateriaal 5 Principe PCR is een analysetechniek waarbij geselecteerde DNA-fragmenten vermenigvuldigd wrden zdat de cncentratie ervan hg geneg wrdt vr detectie. De uitvering van PCR bestaat uit de vlgende stappen: - denaturatie ( smelten ) van dsdna tt ssdna dr verwarming, - afkelen van het ssdna waarbij krte specifieke sequenties (primers / prbes) zich kunnen binden aan hun cmplementaire plaatsen p het ssdna en z krte fragmenten dsdna vrmen, - verlengen van de dubbelstrengige primer/dna-fragmenten dr het enzyme Taq- Plymerase met vrming van een nieuwe dubbelstrengige DNA-sequentie. Hierbij wrdt de prbe afgebrken waarbij de flurfr vrijgesteld wrdt, - herhalen van de vrige drie stappen. Er wrden twee primers gebruikt (de frward en reverse primer) die samen een bepaalde DNA-sequentie afbakenen. Na een aantal cycli gebeurt vral vermenigvuldiging van de sequentie tussen de twee primers waardr bij elke cyclus het aantal nieuwe sequenties verdubbelt. Deze expnentiële vermenigvuldiging leidt er te dat zelfs een gering aantal riginele kpijen van een sequentie kan aangreien tt een meetbare cncentratie. De detectie bij real-time PCR gebeurt aan de hand van meting van flurescentie: de flurescentie van de prbes wrdt nderdrukt dr een quenchermlecule zlang de prbe intact is. Bij de afbraak van de prbe tijdens de verlenging kmt de flurfr vrij in plssing terecht en wrdt de flurescentie niet langer nderdrukt. De ttale flurescentie is dan evenredig met het aantal afgebrken prbes en dus met het aantal gevrmde kpijen. De belangrijkste aspecten van real-time PCR zijn: - de gebruikte primers: die bepalen welke DNA-sequentie pgesprd wrdt, - het aantal cycli dat herhaald wrdt. De bevestiging kan bestaan uit 2 stappen: - identificatie van de mdificatie (welke mdificaties zijn aanwezig?) en/f - kwantificatie (bepaling van het gehalte als de cncentratie van het event > 0,1 % m/m). 6 Prestatiekenmerken Identificatie: LOD 0,03% m/m. Kwantificatie: LOQ 0,10% m/m. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 5/15

6 7 Veiligheidsvrschriften en bijzndere maatregelen Vr veiligheidsmaatregelen en bijzndere vrzrgsmaatregelen: zie LAB 24 P 005 I 011 PCR Algemene instructies vr uitvering. 8 Reagentia en hulpstffen 8.1 Reagentia Prducten - Bleekwater, - DNA away, - Fastmix UNG, - primers en prbes vr sja, maïs en het gezchte event (LAB 24 I-MET 038b L 001 Primers en prbes bevestiging GGO) Oplssingen - DNAse/RNAsevrij steriel water OPLOS 107, - verdund bleekwater 1:6 OPLOS 116, - primers OPLOS Referenties - maïs TC1507, - maïs DAS59122, - maïs Bt11, - maïs Bt176, - maïs GA21, - maïs MIR604, - maïs MON810, - maïs MON863, - maïs NK603, - sja RR (MON40-3-2). De riginele referentiemnsters wrden bewaard in de frig; de DNA-extracten wrden in de diepvries bewaard. Vlgens het certificaat zijn de referentiemnsters 1 jaar hudbaar. De pgegeven hudbaarheidsdatum kan verlengd wrden : de referenties zijn bruikbaar zlang de ijklijnen van de events vlden aan de gestelde criteria. 8.2 Verbruiksmaterialen - epjes van 1,5 ml, - gele cntainers vr bilgisch afval, - handschenen, LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 6/15

7 - PCR-buisje van 10 ml, - pipettips met filters van 1-20 µl, µl en μl, - PCR-plaat GGO, - afdekstrips PCR-plaat. 8.3 Gebruiksgederen - Aandrukplaat vr afsluitstrips, - aandrukrl vr aandrukken plaat in thermcycler, - bekers vr afval, - bewaardzen vr epjes, - huder vr micrtiterplaat, - kelblk vr epjes, - regelbare pipetten van 2-20 µl, µl en μl, specifiek gelabeld Mix en DNA, - rekjes vr epjes. 9 Testellen - Micrcentrifuge, - PCR wrkbench, - thermcycler, - vrtexmixer - Plaatcentrifuge 10 Werkwijze Alle stappen van de bevestiging wrden uitgeverd in lkaal Vrbereiding - algemeen - Bewaar de kelblkken in de diepvriezer, - pen de PCR-wrkbench m hem p te starten, - decntamineer de werktafel, de pipetten Mix, de vrtex en de micrcentrifuge, - decntamineer het werkblad van de PCR wrkbench, de pipetten DNA, de vrtex en de micrcentrifuge, - vul 2 bekers met verdund bleekwater (werktafel + wrkbench) Vrbereiding Bepalen identificatie en/f kwantificatie, plaatschema, verdunningen en mix De aanwezigheid van genetische mdificatie wrdt bevestigd indien bij de screening van een mnster vr de parameters p35s en/f tns en/f EPSPS een Ct < 35 (= LOD 0,03%) teruggevnden wrdt. Evalueer de Ct-verhudingen van de merkers bij de screening: Ct p35s / Ct tns en Ct p35s / Ct EPSPS en Ct tns / Ct EPSPS. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 7/15

8 Is er sja aanwezig in het mnster en zijn deze verhudingen allemaal ngeveer 1 (criterium: ), dan betekent dit dat er enkel sja MON (=RRS) aanwezig is en dat er geen andere mdificatie met één van deze merkers aanwezig is bven de LOD. Is er vr minstens 1 van deze 3 merkers geen signaal en/f is er geen sja aanwezig in het mnster, dan met de mgelijke aanwezigheid van andere events nderzcht wrden. Is er vr de 3 merkers een signaal en is er sja aanwezig in het mnster, maar vldet minstens 1 van de verhudingen niet aan het criterium, dan met naast de aanwezigheid van MON k die van andere events nderzcht wrden. Zek de in aanmerking kmende events p in de lijst LAB 24 I-MET 038b L 001 Primers en prbes bevestiging GGO Identificatie Ver de identificatie uit p alle te analyseren events die in het mnster aanwezig kunnen zijn. Is sja MON aanwezig en is het Ct-verschil tussen de merkers en sja (Ct merkers Ct sja) kleiner dan 10,5 ver dan alleen een kwantificatie uit vr sja MON en geen identificatie (cncentratie > 0,1%). Vr (ring)mnsters wrdt de identificatie uitgeverd p 2 DNA-extracten van het GGOpsitief gescreende mnster en elk extract in dupl. Open de gewenste template in M:\Templates\GGO M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO en sla deze p nder de flder M:\Berekeningen\GGO\Resultaten als JJJJMMDD_Tq_identificatie_mnsternummer(s).xlsx. - Open de tab Plaatschema en vervlledig dr de primer/prbe cmbinatie van genmisch DNA en event, de CRM en de mnsternummers met de bijbehrende nummers van de epjes in te vullen. Indien ndig extra mnsters tevegen f de eerste 3 klmmen kpiëren vr meerdere events. Druk de plaatlayut af. Vul naam en datum in. - Open de tab DNAVerdunning vr het berekenen van de verdunningen van de DNAextracten. Vul in: de gewenste eindcncentratie in ng/µl (standaard: 10 ng/µl), het bendigde vlume (aantal te vullen wells met het mnster x 5 µl/well + bendigd vlume vr eventuele verdunningen µl m verliezen te cmpenseren); per vlume een nieuwe tabel gebruiken, de identificatie van de mnsters / cntrles, (1 tabel per gewenst vlume), de vereenstemmende cncentraties van de cntrles en mnsters wrden vergenmen van LAB 24 I-MET 038 F 003 GGO DNA Cncentratie de werkbladen afkmstig van de spectrftmeter (INVAPP398, C:\Jasc Data\DNA cncentratie\werkblad\jjjj\mm: DNA cncentratie_datum.ufwd) en LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM s GGO. OPMERKING: indien de cncentratie van het mnster kleiner is dan 10 μg/ml, dan wrdt het extract nverdund gebruikt en wrdt nverdund ingevuld als cncentratie. In de tabel wrden de vlumes (μl) DNA-extract en water berekend die meten gemengd wrden m het gewenste vlume met de gewenste cncentratie te krijgen. Druk dit blad af. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 8/15

9 Vul naam en datum in. - Open de tab TAQMAN vr het berekenen van de vlumes vr het aanmaken van de mix. Vul het ttaal aantal wells in (aantal te vullen wells met de mix m verliezen te cmpenseren). Per aantal een nieuwe tabel gebruiken en de primer/prbe bven de tabel nteren. In de tabellen wrden de vlumes (μl ) Fastmix UNG, frward en reverse primer, prbe en water berekend vr elke bendigde primer/prbe cmbinatie. Druk dit blad af. - Sla het rekenblad p Kwantificatie Ver de kwantificatie uit p alle geïdentificeerde events (12.2) waarvan de cncentratie > 0,1 % bedraagt en p mnsters znder vrafgaande identificatie indien sja MON aanwezig en het Ct-verschil tussen de merkers p35s, tnos en EPSPS aanwezig (>LOD) zijn in een nderlinge verhuding (gelegen tussen 0.95 en 1.05) en sja (Ct merkers Ct sja) kleiner is dan 10,5 (cncentratie > 0,1 %). Vr (ring)mnsters wrdt de kwantificatie uitgeverd p 2 DNA-extracten van het GGOpsitief gescreende mnster en elk extract in dupl. De criteria vr de identificatie van de GGO-psitieve mnsters zijn: cncentratie > 0,1 %. Open de gewenste template in M:\Templates\GGO en sla deze p nder de flder M:\Berekeningen\GGO\Resultaten als JJJJMMDD_Tq_kwantificatie_mnsternummer(s).xlsx. - Open de tab Plaatschema en vervlledig dr de primer/prbe cmbinatie van genmisch DNA en event, de CRM s van de ijklijn en de mnsternummers met de bijbehrende nummers van de epjes in te vullen. Indien ndig extra mnsters tevegen. Niet gebruikte wells wissen. Druk de plaatlayut af. Vul naam en datum in. - Open de tab DNAVerdunning vr het berekenen van de verdunningen van de DNAextracten. Vul in: de gewenste eindcncentratie in ng/µl (standaard: 10 ng/µl), het bendigde vlume (aantal te vullen wells met het mnster x 5 µl/well + bendigd vlume vr eventuele verdunningen µl m verliezen te cmpenseren); per vlume een nieuwe tabel gebruiken, de identificatie van de mnsters / cntrles, (1 tabel per gewenst vlume), de vereenstemmende cncentraties van de cntrles en mnsters wrden vergenmen van LAB 24 I-MET 038 F 003 GGO DNA Cncentratie werkbladen afkmstig van de spectrftmeter (INVAPP398, C:\Jasc Data\DNA cncentratie\werkblad\jjjj\mm: DNA cncentratie_datum.ufwd) en LAB 24 I- MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM s GGO. OPMERKING: indien de cncentratie van het mnster kleiner is dan 10 μg/ml, dan wrdt het extract nverdund gebruikt en wrdt nverdund ingevuld als cncentratie. In de tabel wrden de vlumes (μl) DNA-extract en water berekend die meten gemengd wrden m het gewenste vlume met de gewenste cncentratie te krijgen. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 9/15

10 Druk dit blad af. Vul naam en datum in. - Open de tab TAQMAN vr het berekenen van de vlumes vr het aanmaken van de mix. Vul het ttaal aantal wells in (aantal te vullen wells met de mix +1-2 m verliezen te cmpenseren). Per aantal een nieuwe tabel gebruiken en de primer/prbe bven de tabel nteren. In de tabellen wrden de vlumes (μl ) Fastmix UNG, frward en reverse primer, prbe en water berekend vr elke bendigde primer/prbe cmbinatie. Druk dit blad af. - Sla het rekenblad p Uitvering - Verdunnen van het DNA-extract (uitveren p de vrziende tafel naast de PCRwrkbench): neem de ndige DNA-extracten (k extractie- en/f maalblanc s blanc s en cntrles), pipetteer in een epje van 1.5 ml vlgens de tabel DNAVerdunning (10.2) de vereiste heveelheden DNAse/RNAsevrij steriel water en DNA-extract. Vrtex en centrifugeer krt. (2x). Bewaar de verdunningen en de blanc s in de kelblk frig tt het pipetteren van de plaat en plaats de riginele extracten terug in de diepvries. - Maken van de mix (uitveren in de PCR-wrkbench): bepaal de ttale heveelheid Fastmix UNG die ndig is p basis van de tabel SYBRGREEN Taqman en neem het vereiste aantal buisjes Fastmix UNG uit de diepvriezer. Laat ntdien. Neem vr elke primer (frward en reverse) en prbe een epje (evt. reserve) uit de diepvriezer en laat ntdien, vul een epje met DNAse/RNAsevrij steriel water, maak vr elke primer/prbecmbinatie een mix dr de berekende vlumes uit de tabel in een epje te pipetteren. Er wrden dus evenveel mixen klaargemaakt als er primer/prbe-cmbinaties zijn, vrtex en centrifugeer krt af. (2x). Plaats de resten van de Fastmix UNG en de primers terug in de diepvriezer. - Verdelen van de mix ver de micrtiterplaat (uitveren in de PCR-wrkbench): plaats de micrtiterplaat, met well A1 linksbven, in de huder, pipetteer vr elke primer/prbe-cmbinatie 20 μl van de mix in de wells vlgens het plaatschema. - Verdelen van de DNA-extracten / blanc s ver de micrtiterplaat (uitveren p de tafel naast de PCR wrkbench): pipetteer 5 μl (verdund) extract / blanc in de wells vlgens het plaatschema. - Sluit de gebruikte klmmen van de plaat af met afdekstrips: niet gebruikte klmmen mgen pen blijven, druk de strips ged aan met de aandrukplaat (rij per rij en klm per klm). LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 10/15

11 - Centrifugeer de plaat gedurende 1 min. bij 4000 rpm in de plaatcentrifuge - Start de PC en de thermcycler p: Wanneer de self-test van de thermcycler ged verlpen is, dubbelklikken p het ikntje BiRad CFX Manager IDE: username: GGO, paswrd: niets inveren, enter. Plaats de plaat in de thermcycler en druk die vast met de aandrukrl, let p de riëntatie: well A1 = linksbven. View / Startup Wizard / OK f klik p het ikntje User-Defined Run Setup Klik p User Defined Tab 1: Prtcl: Express Lad: GGO Prtcl Taqman 02/ Select existing: M:\Berekeningen\GGO\prtcls PCR GGO_PrtclTaqMan_02.prcl/ next Tab 2: Plate: Select existing: My Cmputer M Templates GGO TqCFX.pltd M:\Berekeningen\GGO\ prtcls PCR Quick Plate_96 wells Tq.pltd/ next, Tab 3: Start Run: indien prtcl en plate OK: Start Run rechts nder en pslaan nder de flder M:\Berekeningen\GGO\Ruwe data in het mapje van de huidige maand; indien NOK, tab 1 en/f 2 eerst crrigeren. - Verwijder de bekers met afval (in de gele bak vr bilgisch afval), decntamineer de werktafel, het werkblad van de PCR-wrkbench en de pipetten. - Sluit de PCR wrkbench Afwerking Na aflp van de analyse de plaat uit de thermcycler verwijderen en in een plastic zakje in de gele bak vr bilgisch afval leggen. EEN PLAAT NA PCR-ANALYSE NOOIT OPENEN! 11 Kwaliteitscntrle 11.1 Identificatie Vr de kwaliteitscntrle wrden per plaat de vlgende cntrles meegenmen: - Psitieve cntrles van het te bepalen event. Afhankelijk van het te bepalen event wrdt de CRM gebruikt met de vereenkmstige genetische mdificatie. - Blanc s: DNAse/RNAsevrij steriel water. De criteria vr de cntrlemnsters zijn: - PC s meten psitief zijn vr genmisch DNA en vr het event. - Blanc s meten negatief zijn vr genmisch DNA en vr het event. Indien aan een f meerdere van deze vrwaarden niet is vldaan, dan met de rzaak gezcht wrden en kunnen bv. een f meer van de vlgende acties ndernmen wrden: - herhalen van de analyse, - herhalen van de analyse met een andere CRM als PC, - indien alle resultaten negatief zijn: prbleem pspren en plssen. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 11/15

12 11.2 Kwantificatie Vr de kwaliteitscntrle wrden per plaat de vlgende cntrles meegenmen (zie plaatschema): - Psitieve cntrles van het te kwantificeren event. Afhankelijk van het te kwantificeren event wrden de CRM s gebruikt met de vereenkmstige genetische mdificatie vr het pstellen van de ijklijn. De criteria vr de cntrlemnsters zijn: - PC s meten psitief zijn vr genmisch DNA en vr het event. Indien aan deze vrwaarde niet is vldaan, dan met de rzaak gezcht wrden en kunnen bv. een f meer van de vlgende acties ndernmen wrden: - herhalen van de analyse, - herhalen van de analyse met een andere CRM als PC, - indien alle resultaten negatief zijn: prbleem pspren en plssen. 12 Berekening en rapprtering 12.1 Verlp De berekening van de resultaten mvat de vlgende stappen: - bepalen van de Ct s, - bij kwantificatie: pstellen van de kalibratierechte, - evalueren van de Ct s (cntrles, kalibratie, blanc s, mnsters), - berekenen van het resultaat Uitvering identificatie - Open het rekenblad (10.2) en kpieer het plaatschema van Plaatschema naar Evaluatie. - Open de file met de ruwe data. Linksbven wrden de reactiecurves van alle wells getnd; ga na f het verlp van de curves de typische uitgerkken S-vrm vertnt. Z niet dan kan dit wijzen p een prbleem. Vink het vakje Lg Scale aan. De grafiek wrdt nu getnd met een lgaritmische schaal vr de Y-as. De curves vertnen nu een lineair deel. Hrizntaal lpt er in de grafiek een lijn dr het lineair deel van de curves; deze lijn bepaalt de threshld, de drempelwaarde die gebruikt wrdt m het nummer van de cyclus te bepalen waar de curve die threshld verschrijdt. Deze lijn wrdt vastgelegd dr de sftware, maar kan eventueel manueel verschven wrden. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 12/15

13 Rechtsnder wrdt een tabel getnd met als meest linkse klm de identificatie van de well en de meest rechtse klm de Ct-waarde, de cyclus (de X-waarde) waarbij de curve de threshld snijdt. Linksnder staat de plaatlayut: van de blauwe wells is de Ct terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbvenhek van de plaat (blauw wrdt grijs) en selecteer klm 1 (enter p 1 en grijs wrdt blauw). Cntrleer de vrm van de curves en kpieer de Ct s in klm 1 van de plaatlayut Overzicht alle resultaten Evaluatie p het rekenblad. Selecteer klm 2 (enter p 1 en blauw wrdt grijs en enter p 2 en grijs wrdt blauw), cntrleer de vrm van de curves en kpieer de Ct s in klm 2 van het rekenblad. Herhaal dit vr alle gebruikte klmmen. Wijkt de vrm van de curve af, nteer dit dan in de klm pmerkingen in het rekenblad. Vergelijk de Ct waarden van de wells die negatief meten zijn met die van de psitieve cntrles. De psitieve cntrles meten een duidelijk lagere Ct hebben dan de negatieve wells. Het Ct-verschil tussen CRM 0,1% en CRM 0,03% bedraagt theretisch 1,6. Bereken in het werkblad het verschil Ct event - Ct genmisch vr alle CRM s en mnsters. - Berdeel de resultaten: indien bij een mnster vr een event geen typisch uitgerkken S-vrm aangetrffen wrdt in de curves, dan is het resultaat Event X afwezig. Indien bij een mnster het verschil Ct event - Ct genmisch grter is dan het verschil van de CRM 0,03%, dan is het resultaat Event X aanwezig, maar < LOD. Indien bij een mnster het verschil Ct event - Ct genmisch ligt tussen de verschillen van de CRM 0,03% en de CRM 0,1%, dan is het resultaat Event X aanwezig, maar < LOQ. Indien bij een mnster het verschil Ct event - Ct genmisch kleiner is dan het verschil van de CRM 0,1%, dan is het resultaat Event X aanwezig en dan met er kwantificatie uitgeverd wrden Rapprtering identificatie Vul de resultaten in de LIMS in als aangetnd f niet aangetnd, aangevuld met een eventuele pmerking. Op het beprevingsverslag kmen de vlgende vermeldingen: - indien niet aangetnd ingevuld wrdt: de aanwezigheid is niet aangetnd in cncentraties bven LOD, - indien aangetnd ingevuld wrdt: de aanwezigheid is aangetnd in cncentratie bven LOD, - eventuele pmerkingen. Praktisch: - aangetnd bven referentie LOD en bven LOQ: aangetnd : kwantificatie (10.2.2) ndig, LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 13/15

14 - aangetnd bven referentie LOD en nder LOQ: aangetnd en pmerking parameter gedetecteerd in cncentraties < LOQ, - aangetnd nder referentie LOD: niet aangetnd en pmerking parameter gedetecteerd in cncentraties < LOD, - niet aangetnd: niet aangetnd Uitvering kwantificatie - Open het rekenblad (10.2) en kpieer het plaatschema van Plaatschema naar Evaluatie. - Open de file met de ruwe data. Linksbven wrden de reactiecurves van alle wells getnd; ga na f het verlp van de curves de typische uitgerkken S-vrm vertnt. Z niet dan kan dit wijzen p een prbleem. Vink het vakje Lg Scale aan. De grafiek wrdt nu getnd met een lgaritmische schaal vr de Y-as. De curves vertnen nu een lineair deel. Hrizntaal lpt er in de grafiek een lijn dr het lineair deel van de curves; deze lijn bepaalt de threshld, de drempelwaarde die gebruikt wrdt m het nummer van de cyclus te bepalen waar de curve die threshld verschrijdt. Deze lijn wrdt vastgelegd dr de sftware, maar kan eventueel manueel verschven wrden. Rechtsnder wrdt een tabel getnd met als meest linkse klm de identificatie van de well en de meest rechtse klm de Ct-waarde, de cyclus (de X-waarde) waarbij de curve de threshld snijdt. Linksnder staat de plaatlayut: van de blauwe wells is de Ct terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbvenhek van de plaat (blauw wrdt grijs) en selecteer klm 1 (enter p 1 en grijs wrdt blauw). Cntrleer de vrm van de curves en kpieer de Ct s in klm 1 van de plaatlayut Overzicht alle resultaten Evaluatie p het rekenblad. Selecteer klm 2 (enter p 1 en blauw wrdt grijs en enter p 2 en grijs wrdt blauw), cntrleer de vrm van de curves en kpieer de Ct s in klm 2 van het rekenblad. Herhaal dit vr alle gebruikte klmmen. Wijkt de vrm van de curve af, nteer dit dan in de klm pmerkingen in het rekenblad. Vergelijk de Ct-waarden vr genmisch DNA van de CRM s; deze meten dicht bij elkaar liggen. Vr de bepaling van het gehalte event in het mnster als fractie van het taxn (sja, maïs): in het rekenblad wrden vr de kalibratie met de CRM s de Ct verschillen (Ct event Ct genmisch) berekend evenals de 2lg van de cncentratie. Uit deze twee reeksen waarden wrdt de regressierechte berekend met helling a, snijpunt b en determinatiecëfficiënt r 2. berdeel de berekende waarden vr a en r 2 : a met vallen in het interval 0,9 1,1 r 2 met > 0,98. LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 14/15

15 indien de kalibratierechte niet vldet aan deze eisen, met de analyse herhaald wrden. in het rekenblad wrdt het Ct-verschil van het mnster berekend. Uit de ijklijn wrdt het crrespnderend gehalte (% m/m) van de event p taxnbasis berekend Rapprtering kwantificatie Vul de resultaten in de LIMS in. Wanneer het teruggevnden percentage tussen de gehaltes van de kleinste en de grtste CRM van de ijklijn valt wrdt het gehalte event in % ingeverd. Is het percentage lager dan het gehalte van de kleinste CRM dan wrdt < LOQ ingeverd. Is het percentage hger dan het gehalte van de grtste CRM dan wrdt > % van de hgste CRM ingeverd. 13 Verwijzing naar bijhrende prcedure, instructies, dcumenten, frmulieren f lijsten 13.1 Prcedures/Instructies LAB 24 P 005 I 011 PCR Algemene instructies vr uitvering LAB 24 I-MET 038a GGO: screening 13.2 Frmulieren LAB 24 I-MET 038 F 003 DNA cncentratie LAB 24 I-MET 038 F 005 Werklijst GGO Templates identificatie nder M:\Templates\GGO M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO\ Templates kwantificatie nder M:\Templates\GGO M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO\ 13.3 Lijsten LAB 24 I-MET 038b L 001 Primers en prbes bevestiging GGO LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM s GGO LAB 24 I-MET 038b GGO Bevestiging v.04 15/15