Gearchiveerde versie

Transcriptie

1 I-MET-FLVVT-011 Federaal Agentschap vr de Veiligheid van de Vedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-011 Versie 04 Datum van tepassing Opgesteld dr : Jeren Vancutsem, Sectieverantwrdelijke Nazicht dr : Sphie De Vlder; QAM; Gedkeuring vrijgave dr : Mandy Lekens; Labmanager; Beheer & lcatie geldende versie : Bestemmelingen : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Trefwrden : Medewerkers FLVVT Myctxines

2 Herziening dr/datum* J. Vancutsem, februari 2008 J. Vancutsem, juli 2008 QAM, ktber 2008 J. Vancutsem, september 2010 J. Vancutsem, nvember 2012 Overzicht herziening van het dcument Reden van herziening Opsteller initiële versie (methdenummer 308) Opmerkingen gemaakt tijdens BELAC-audit dd 03/03/2008 (B-NC UIT ) + wijziging methdenummer versienummer 01 wrdt behuden Tekstdeel / draagwijdte van de herziening Bestandsnaam Blz Algemene herziening Algemene herziening Hele tekst Hele tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten pzichte van de vrige versie wrden gemarkeerd in rd. Indien mwille van de mvang van de wijzigingen, de tekst dr gebruik van markeringen niet meer leesbaar wrdt, wrdt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wrdt vermeld in de histriek van het dcument. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-2/12

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN TOESTELLEN WERKWIJZE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-3/12

4 1 Del Kwantitatief bepalen van T-2 en HT-2 txine. 2 Tepassingsgebied Deze analyse-instructie beschrijft de methde vr het bepalen van T-2 en HT-2 txine in granen en bier met behulp van HPLC. De rapprteringsgrens is: Rapprteringsgrens Matrix T-2 txine HT-2 txine Granen (B) 25 µg/kg 25 µg/kg Bier (NB) 2,5 µg/kg 2,5 µg/kg 3 Wettelijke en nrmatieve dcumenten Een verzicht van de wettelijke en nrmatieve dcumenten wrdt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Wijzigingen ten pzichte van de referentiemethde: geen 4 Definities en afkrtingen Term HPLC B NB FLVVT 1-AN DMAP Definitie High Perfrmance Liquid Chrmatgraphy Belac accreditatie Niet Belac accreditatie Federaal labratrium vr vedselveiligheid Tervuren 1-Antrylnitrile 4-Dimethylaminpyridine 5 Principe T-2 en HT-2 txine wrden uit het mnster geëxtraheerd met methanl/water (90/10 v/v). Het extract wrdt gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wrdt na verdunning met een immunaffiniteitsklm gezuiverd. De uiteindelijke scheiding en bepaling wrden uitgeverd met hge drukvleistfchrmatgrafie (HPLC) met een reversed phase C18-klm en flurescentiedetectie na derivatisatie met 1-AN en DMAP. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-4/12

5 6 Prestatiekenmerken De relevante meetnzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25- L22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden vr de reprduceerbaaheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Berdeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvrschriften en bijzndere maatregelen De scheikundige prducten die bij deze analysemethde gebruikt wrden, zijn ndergebracht bij de ptentieel giftige en kankerverwekkende stffen. Dit maakt het ndzakelijk de vrziene maatregelen in het labratrium te te passen m bltstelling aan f cntact met deze prducten tt een minimum te herleiden. Algemene en specifieke veiligheidsvrschriften zijn pgenmen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. Myctxines zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen dienen in een zuurkast te wrden uitgeverd. Speciale vrzrgsmaatregelen dienen te wrden genmen wanneer myctxines in vaste vrm zijn, vanwege hun elektrstatische karakter waardr zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden. Decntaminatie van het glaswerk en txinehudende plssingen wrdt uitgeverd dr gebruik van een javeltablet in de vaatwasser. 8 Reagentia en hulpstffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetnitril, HPLC-kwaliteit Methanl Natriumchlride Tlueen, pesticide analyse Water, HPLC kwaliteit 1-Antrylnitrile peder 4-Dimethylaminpyridine peder Gedemineraliseerd water Water, UHPLC kwaliteit Natriumchlrideplssing 4% Labnr. R0026 R0183 R0200 R0273 R1003 R2013 R2012 R1004 R2023 W0219 LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-5/12

6 Ls 40 g (± 1g) natriumchlride p in 1000 ml gedemineraliseerd water. Standaardverdunningsplssing T2-HT2: Acetnitril/water (70/30, v/v): W0220 Meng 700 ml acetnitril met 300 ml HPLC-water. Extractieplssing Methanl/water (90/10, v/v) : Meng 900 ml methanl met 100 ml gedemineraliseerd water. 1-Antrylnitrile (1-AN) 1 mg/ml: Ls 100 mg (± 10 mg) 1-AN (R2013) p in tlueen in een maatklf van 100 ml. Deze plssing is 1 jaar hudbaar. 1-Antrylnitrile (1-AN) 0,3 mg/ml : Verdun 15 ml van W1061 met tlueen in een maatklf van 50 ml. Deze plssing is 6 maanden hudbaar. 4-Dimethylaminpyridine (DMAP) 10 mg/ml: Ls 1000 mg (± 100 mg) DMAP (R2017) p in tlueen in een maatklf van 100 ml. Deze plssing is 1 jaar hudbaar. 4-Dimethylaminpyridine (DMAP) 0,325 mg/ml : Verdun 3,25 ml van W1063 met tlueen in een maatklf van 100 ml. Deze plssing is 6 maanden hudbaar. 8.2 Hulpstffen Standaarden R2021: Immunaffiniteitsklmmen Easi-extract T-2 and HT-2; (R-Bipharm) Vuwfilters: S&S 595 ½ Ø 240 mm Micrfilter: Ø 125 mm; 1,5 µm T-2 en HT-2 standaardplssingen W1057 W1061 W1060 W1063 W1062 Cmmerciële standaarden van 100 µg/ml in acetnitril. De hudbaarheid is vermeld p het certificaat. Bewaar deze plssingen in de kelkast bij 4 ± 4 C. Cncentratie Nummer standaard T-2 txine 100 µg/ml S0058 HT-2 txine 100 µg/ml S W1058: T-2 en HT-2 kalibratie-plssing Laat vr gebruik de standaardplssingen (S0058 en S0059) p kamertemperatuur kmen Breng 50 µl T-2 standaardplssing (S0058) en 50 µl HT-2 standaardplssing (S0059) in een prefbuis Verdamp het slvent bij ngeveer 60 C nder een lichte stikstfstrm. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-6/12

7 Veg 50 µl DMAP-plssing 0,325 mg/ml (W1062) te Veg daarna 50 µl 1-AN 0,3 mg/ml (W1060) te. Vrtex gedurende ngeveer 1 minuut Laat het mengsel gedurende 15 minuten reageren bij 60 C. Kel het mengel daarna af gedurende 10 minuten in ijs f equivalent Blaas daarna drg met behulp van stikstf in de sample cncentratr bij ngeveer 60 C Ls p in standaardverdunningsplssing (W0220), breng kwantitatief ver in een maatklf van 50 ml en vul aan tt aan de maatstreep zdat een plssing van 100 ng/ml bekmen wrdt. Bewaar deze plssing ged afgeslten in het dnker in de kelkast bij 4 ± 4 C en gebruik deze niet langer dan 1 maand en niet langer dan de bewaardatum p het certificaat. De piekppervlakte van de nieuwe kalibratie-plssing mag maximaal 20% afwijken van de vrige kalibratie-plssing die meegenmen wrdt binnen dezelfde analysereeks. Indien de waarde niet vldet wrdt de meetreeks verwrpen en een nieuwe kalibratie-plssing bereid. Indien het prbleem zich ngmaals vrdet met getracht wrden de rzaak p te spren m het prbleem te verhelpen. De gegevens wrden genteerd in LAB 25 F45 BEHEER VAN STANDAARDEN MYCOTOXINES W1059: T2-HT2 spike-plssing 10 µg/ml Laat vr gebruik de standaardplssingen (S0058 en S0059) p kamertemperatuur kmen. Breng 500 µl T2-standaardplssing (S0058) en 500 µl HT2-standaardplssing (S0059) in een maatklf van 5 ml. Leng aan met standaardverdunningsplssing (W0220) zdat een plssing van 10 µg/ml bekmen wrdt. De hudbaarheid bedraagt 2 maanden en niet langer dan de bewaardatum p het certificaat. 9 Testellen 9.1 Algemeen Een verzicht van de gebruikte apparatuur wrdt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties vr deze methde Chrmatgrafische mstandigheden HPLC Klm: Chrmlith RP-18e (4,6 x 100 mm) + guard-klm Klmven: 30 C LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-7/12

8 UHPLC Detectrparameters Detectr: flurescentie Glflengte: excitatie: 381 nm, emissie: 470 nm Pmpparameters Lpsnelheid : 1,0 ml/min Gradiëntelutie Elutieschema: Tijd (min) water (%) Acetnitril (%) De gradiënt mag aangepast wrden teneinde een betere reslutie te bekmen. Autsampler parameters: Injectievlume 100 µl Klm: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 µm + guard klm Klmven: 30 C Detectrparameters Pmpparameters Detectr: flurescentie Glflengte: excitatie: 381 nm, emissie: 470 nm Lpsnelheid : 0,2 ml/min Gradiëntelutie Elutieschema: Tijd (min) Water (%) Acetnitril (%) , , LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-8/12

9 17, , , De gradiënt mag aangepast wrden ten einde een betere reslutie te bekmen Autsampler parameters: Injectievlume 20 µl Vrdat een analysereeks gestart wrdt, met vldende stabilisatietijd vr het systeem in acht genmen wrden. De tijd m het systeem te laten stabiliseren bedraagt ngeveer 30 minuten f tt een cnstante basislijn bekmen wrdt. Vervlgens wrden de kalibratie plssingen geïnjecteerd. De piekppervlakken van de eerste injectie van de kalibratie plssing van 50 ng/ml wrdt genteerd p LAB 25-F 62 REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART. Hierbij met een reprduceerbaar piekppervlak (maximaal 20% afwijking t.a.v. vrige ntatie in LAB 25-F 62) verkregen wrden. De standaardpiek met znder schuder f gelijksrtige chrmatgrafische tekrtkming zijn. Dit wrdt visueel gecntrleerd. Indien niet vldaan aan deze vrwaarden, wrden eerst andere parameters zals druk, lekkages, temperatuur gecntrleerd en verhlpen alvrens ver te gaan naar bereiding van nieuwe standaarden Cntrle p de lineariteit Bij elke reeks van analyses wrden 4 standaardplssingen geïnjecteerd. Met deze punten wrdt een kalibratielijn pgesteld. Deze wrden geïnjecteerd uit de kalibratie-plssing (W1058) in vlgende vlumes (met bijhrende cncentraties) : cncentratie Na elke 6 mnsters wrdt telkens de referentieplssing van 50 ng/ml geïnjecteerd ter cntrle van het verlp in piekrespns. De piekuitslagen van de referentiestandaard mgen niet meer dan 10% verschil geven in een analysereeks. Indien het verschil grter is, wrden de resultaten na de laatst gede standaard verwrpen. injectievlume HPLC injectievlume UPLC cncentratie in de matrix (µg/kg) 10 ng/ml 10 µl 2 µl ng/ml 25 µl 5 µl ng/ml 50 µl 10 µl ng/ml 100 µl 20 µl 100 De kalibratielijn met recht zijn. De crrelatiecëfficiënt met minimaal 0,99 bedragen. Als aan deze eisen is vldaan, wrdt dadelijk verdergegaan. Zniet, wrden eerst de rzaken van de prblemen pgesprd en verhlpen. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-9/12

10 9.2.3 Verlp van de metingen De metingen wrden p vlgende wijze uitgeverd: Kalibratie-plssing 10 ng/ml Kalibratie-plssing 25 ng/ml (1) Kalibratie-plssing 50 ng/ml Kalibratie-plssing 100 ng/ml Blancmnster Blancmnster + spike 25 µg/kg 10 Werkwijze 10.1 Extractie Referentieplssing 50 ng/ml (± 10 % afwijking p (1)). Zniet herhaalset. Maximum 6 mnsters Referentieplssing 50 ng/ml (± 10 % afwijking p (1)). Zniet herhaalset. Maximum 6 mnsters Referentieplssing 50 ng/ml (± 10 % afwijking p (1)) Zniet herhaalset tt vrige referentieplssing, indien die niet in rde is. Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemnster af in een Schttfles met 5g (± 0,5 g) NaCl. Veg 250 ml extractieplssing (W1057) te. Hmgeniseer in een ultraturrax gedurende 3 minuten f laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm Filtreer het mengsel ver een vuwfilter en verzamel het filtraat Verdunning van het extract Pipetteer 10 ml van het extract in een Schttfles Verdun het extract met 40 ml natriumchlrideplssing 4% (W0219) en wacht 5 minuten. Schud 3 minuten en wacht vervlgens weer 5 minuten. Filtreer ver een micrfilter en verzamel het filtraat. Let er p dat de filter niet beschadigd wrdt bij het vuwen. Zrg dat het bekmen extract vrijwel helder is Opzuivering Laat 25 ml verdund extract vlledig dr de immunaffiniteitsklm lpen met behulp van de zwaartekracht (25 ml is equivalent met 1 g staal) f stel de vacuüm manifld z in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per secnde drlpt. Kppel hiervr een glazen spuit aan p de immunaffiniteitsklm. Laat 20 ml water dr de klm lpen m.b.v. de zwaartekracht f gebruik de vacuüm manifld. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-10/12

11 Drg de klm dr er lucht dr te persen met de spuit m de laatste druppels water te verwijderen. Elueer met 750 µl methanl. Verzamel het eluaat in een prefbuis en spel de klm 3 keer na via backflushing. Zuig hiervr het eluaat p en laat het pnieuw dr de klm lpen. Elueer ngmaals met 750 µl methanl Blaas lucht dr de klm m de laatste druppels methanl te verzamelen. Blaas met behulp van stikstf het eluaat drg in de sample cncentratr bij ngeveer 60 C Derivatisering Veg 50 µl DMAP 0,325 mg/ml (W1062) te aan het gedrgde residu Veg daarna 50 µl 1-AN reagens 0,3 mg/ml (W1060) te Vrtex gedurende ngeveer 1 minuut Laat het mengsel gedurende 15 minuten reageren bij ngeveer 60 C Kel het mengel daarna af gedurende 10 minuten in ijs f equivalent Blaas daarna drg met behulp van stikstf in de sample cncentratr bij ngeveer 60 C Ls het eluaat p in 1 ml standaardverdunningsplssing (W0220), vrtex gedurende ngeveer 30 secnden en breng de inhud in een vial. Injecteer 100 µl in de HPLC f 20 µl in de UHPLC 11 Kwaliteitscntrle Bij iedere set analysen wrdt een blancmnster meegenmen vlgens de methde. Het resultaat van het blancmnster mag niet hger zijn dan de rapprteringsgrens. Indien er een piek waargenmen wrdt, wrdt de gehele meetreeks verwrpen. Bij iedere set analysen wrdt een blancmnster gespiked met 25 µg/kg T-2 txine en 25 µg/kg HT2-txine. Het terugvindingspercentage met meer dan 60 % en minder dan 130 % van de werkelijke waarde zijn. Dit wrdt genteerd p een cntrlekaart waarbij met vldaan zijn aan LAB 25-I 22 Cntrlekaarten. Indien het terugvindingspercentage niet vldet wrdt de reeks verwrpen. De spiking gebeurt dr teveging van 125 µl van spikeplssing (W1059) aan 50,0 g blanc mnster. Laat het slvent uitdampen gedurende ten minste 30 minuten. De piekidentificatie gebeurt bij iedere reeks van analyses dr vergelijking van de retentietijden van het mnster met deze van de referentieplssing. De retentietijd van T2 en HT-2 in elk chrmatgram mag 5 % afwijken t..v. de retentietijd van de referentieplssing. Indien de retentietijd niet vldet, wrden de resultaten na de laatste gede standaard verwrpen. De retentietijd staat vermeld p het chrmatgram. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-11/12

12 Naast de piekidentificatie is de identiteit van het mlecule gegarandeerd dr de specificiteit van de methde. De flurescentiedetectie gebeurt p een vr het mlecule specifieke excitatieglflengte en een emissieglflengte. Daarnaast zijn de antilichamen van de immunaffiniteitsklmmen specifiek. 12 Berekening en rapprtering De berekening van de cncentratie wrdt uitgeverd p de kalibratiecurve. Een psitieve vaststelling dient dr het sectiehfd f plaatsvervanger aantnbaar geparafeerd te wrden p de ruwe data. Het analytische resultaat wrdt geregistreerd met crrectie p basis van de terugvinding. Het terugvindingspercentage met wrden vermeld. Vr mnsters met een cncentratie > LOQ met de meetnzekerheid vermeld wrden bij het analyseresultaat. Indien bij dierveders de waarde > 50% van de nrm, dient de analyse pnieuw uitgeverd te wrden. Het in het analyserapprt vermelde resultaat is de gemiddelde waarde uit ten minste twee, p aparte prties van het mnster uitgeverde bepalingen. Neem als resultaat het gemiddelde van de 2 resultaten, die vlden aan de reprduceerbaarheid (= 2,8 s R ) van de methde. Indien geen enkel resultaat vldet aan de reprduceerbaarheid van de methde, vermeld het gemiddelde van de 3 resultaten, gevlgd dr de 3 resultaten. 13 Verwijzing naar bijhrende prcedures, instructies, dcumenten, frmulieren f lijsten. LAB 25-F 45 LAB 25-I 22 LAB 25-L 21 LAB 25-F 62 LAB 25-L 18 LAB 25-L 22 LAB 25-P 07 BEHEER STANDAARDEN MYCOTOXINES CONTROLEKAARTEN APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART OVERZICHT WETGEVING FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 txine in granen (HPLC) v.04-12/12