I-MET-FLVVT-016. Versie 05 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-016 I-MET-FLVVT-016 BEPALING VAN VITAMINE E (DL-α-TOCOFEROL) IN DIERENVOEDERS (HPLC) Versie 05 Datum van toepassing Opgesteld door : Jean-Pierre De Lannoy, Laborant Nazicht door : Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens, Laboratoriummanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen, Vitaminen

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening J. Versnick, Opsteller initiële versie 09/2007 QAM, Nummering FoodLIMS geen wijziging versie Blz /2008 M. Vanbrabant, 03/ 2009 Nazicht en aanpassing numerieke verwijzingen Volledige tekst M. Vanbrabant, 09/ 2010 M. Vanbrabant, 06/2013 JP De Lannoy, 09/2014 Aanpassing methode naar aanleiding van klacht TC-10/105 Invoering Verordening 152/2009 Dichloorethaan vervangen door hexaan Update documentbeheer Aanpassing houdbaarheid standaard stockoplossing n.a.v. interne audit Volledige tekst Volledige tekst Paragraaf 8 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 2/11

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN Standaarden TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE HPLC-CONDITIES WERKWIJZE INWEEG HYDROLYSE EXTRACTIE HPLC-BEPALING KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING OPMERKINGEN VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 3/11

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van dl-alfa-tocoferol (vitamine E). Het gehalte aan vitamine E wordt uitgedrukt in milligram dl-alfa-tocoferol per kg (mg/kg). 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van vitamine E in diervoeder en voormengsels. De rapporteringsgrens bedraagt 3 mg/kg 1. Al naargelang het veronderstelde gehalte aan dl-alfa-tocoferol worden de producten verdeeld in twee groepen: - Groep A: gehalten van minder dan 100 mg/kg - Groep B: gehalten gelijk aan of hoger dan 100 mg/kg Deze methode wordt toegepast wanneer in hetzelfde monster eveneens vitamine D 3 wordt bepaald. Is dit niet het geval dan gebruikt men methode I-MET-FLVVT Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. 4 Definities en afkortingen Term HPLC RP Definitie High Performance Liquid Chromatography Reversed phase 5 Principe Een hoeveelheid fijngemalen monster wordt warm gehydrolyseerd onder stikstofatmosfeer met een ethanolische kaliumhydroxide-oplossing in aanwezigheid van een antioxidant. Vitamine E wordt vervolgens geëxtraheerd met n-hexaan. Een bepaald volume van het extract, afhankelijk van de gewenste concentratie, wordt ingedampt tot droog en opgelost in methanol. Het gehalte aan vitamine E wordt bepaald met behulp van RP-HPLC met UVdetectie. 1 1 IE vit E = 1 mg dl-alfa-tocoferolacetaat = 0,9090 mg dl-alfa-tocoferol LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 4/11

5 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de nodige maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht in diffuus daglicht, eventueel in bruin glaswerk of glaswerk dat is beschermd met aluminiumfolie. In het laboratorium wordt gebruik gemaakt van het dimmen van de verlichting. Deze wordt op minimale lichtsterkte gebracht van zodra een vitamineoplossing of suspensie in de werkruimte aanwezig is. Alle werkzaamheden dienen te worden verricht zonder de invloed van zuurstof, vervang zuurstof waar mogelijk door stikstof. Het malen van monsters gebeurt vlak voor het wegen en hydrolyseren om het verlies aan vitamine E zo klein mogelijk te houden. Het monster wordt voorbereid volgens instructie LAB 25-I 23 BEREIDING MONSTERS. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Labonr Ethanol 96% (v/v) (eventueel gedenatureerd met methylethylketon) R n-hexaan, HPLC-kwaliteit R Methanol, HPLC-kwaliteit (CH 3 OH) R Water, HPLC-kwaliteit R Stikstof, zuiver G0001 LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 5/11

6 8.1.6 L-ascorbinezuur R Kaliumhydroxide, zuiver R Natriumsulfide, zuiver R Glycerine, zuiver R Natriumsulfide-oplossing 0,5 M in glycerine 70% (v/v) in water (R1003) W Kaliumhydroxide-oplossing 50% (g/v) p.a. W Kaliumhydroxide-oplossing 1M W Kaliumhydroxide-oplossing 0,5M W Broomthymolblauw (R0091): 1% oplossing in ethanol (R0338) W Mobiele fase: 1% water (R1003) in methanol (R0183) (v/v) W Natriumsulfaat p.a.: watervrij R Natriumchloride R Butylhydroxytolueen zuiver R Butylhydroxytolueen-oplossing in methanol (R0183): 1 mg/ml W Hulpstoffen Standaarden Vitamine E (dl-alfa-tocoferol) standaardstof van gegarandeerde zuiverheid (S0130, olie) Vitamine E (dl-alfa-tocoferol) standaard stockoplossing, 1 mg/ml (W0020) Weeg een druppel alfa-tocoferol (olie) ( 97,0%, S0130) in een getarreerde erlenmeyer (= x mg). Voeg vervolgens een gelijk aantal ml butylhydroxytoleen-oplossing (W0039) toe zodat de concentratie 1 mg/ml bedraagt. Zo bekomt men uiteindelijk ongeveer 50 ml standaard stockoplossing. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 1 jaar 4 maanden bruikbaar Vitamine E (dl-alfa-tocoferol) standaard werkoplossing, 0,02 mg/ml (W0055) Pipetteer 1 ml standaard stockoplossing (W0020) in een maatkolfje van 50 ml en vul aan tot 50 ml met methanol (R0183). De concentratie bedraagt dan 0,02 mg/ml. Bewaard in een koelkast bij 4 ± 4 C is deze oplossing 4 weken houdbaar. De concentratie van de nieuwe standaard werkoplossing uit de (nieuwe) stockoplossing wordt met behulp van HPLC vergeleken met die van de vorige standaard werkoplossing uit de (oude) stockoplossing. Zie LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN en Beheer standaarden.xls. De stabiliteit moet tussen 95% en 105% liggen. LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 6/11

7 De standaard werkoplossing wordt bij gebruik telkens gecontroleerd ten opzichte van de vorige run. Deze controle wordt geregistreerd in de file Controlekaart Vitamine E.xlsx. Algemene richtlijnen met betrekking tot het beheer van standaarden worden weergegeven in LAB 25-I 19 BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN. 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Allihn-condensor met slijpstuk, geschikt voor terugvloeikoeling onder stikstofstroom Scheitrechters van 500 ml met bijhorende stop Spectrofotometer met kwartscuvetten 9.3 HPLC-condities De volgende condities worden als leidraad gegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen. HPLC-kolom : Analytische kolom: LiChrospher 100 RP-18e, 5 µm, 125 x 4 mm of gelijkwaardig eventueel met overeenkomstige voorkolom Detector : UV op 290 nm Eluens : Methanol/H 2 O (99/1) Loopsnelheid : 1,2 ml/min Injectievolume : 20 µl Dataverwerkingsysteem: HPLC System Manager (Lachrom) 10 Werkwijze 10.1 Inweeg Voor de af te wegen hoeveelheid en de verdunningen wordt instructie LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN geraadpleegd. Dit document dient enkel als leidraad. LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 7/11

8 Weeg, afhankelijk van het te verwachten gehalte aan dl-alfa-tocoferol, van het monster een hoeveelheid (g) af als volgt: - Voor producten van groep A 30 (± 0,1) g - Voor producten van groep B: 100 < 1000 mg/kg 10 (± 0,05) g 1000 < 4000 mg/kg 5 (± 0,03) g 4000 < mg/kg 3 (± 0,01) g mg/kg en meer 1 (± 0,005) g - Voor concentraten (olie of adsorbaat 50%) wordt methode I-MET-FLVVT-088 toegepast. Breng de afgewogen hoeveelheid direct over in een kolf met ingeslepen stop. Indien men niet weet tot welke groep het monster behoort, weegt men 10 g af Hydrolyse - Voor producten van groep A: Voeg achtereenvolgens toe: 1 g ascorbinezuur (R0778) 100 ml ethanol (R0338) 20 ml kaliumhydroxide-oplossing 50% (W0002) 4 ml natriumsulfide-oplossing (W0005) - Voor producten van groep B: Voeg achtereenvolgens toe: 1 g ascorbinezuur 50 ml ethanol 10 ml kaliumhydroxide-oplossing 50% 4 ml natriumsulfide-oplossing (R0778) (R0338) (W0002) (W0005) Sluit een condensor aan op de erlenmeyer en verwarm gedurende 30 minuten in een warmwaterbad met magneetroerder bij 70 à 80 C, dit onder terugvloeikoeling en al roerend met toevoer van een trage stikstofstroom boven de vloeistof. Spoel de condensor vervolgens met 100 (groep A) of 50 (groep B) ml ethanol en koel de inhoud van de erlenmeyer af in een waterbad. LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 8/11

9 10.3 Extractie - Voor groep A: Voeg 200 ml n-hexaan (R0134) toe - Voor groep B: Voeg 100 ml n-hexaan (R0134) toe Schud krachtig gedurende 10 seconden, laat bezinken en decanteer de bovenstaande vloeistof in een scheitrechter. Voeg 100 ml kaliumhydroxide-oplossing 1M (W0003) toe en schud krachtig gedurende 10 seconden. Laat na scheiding van de fasen de hexaanfase (bovenste fase) in een scheitrechter af. Voeg 100 ml kaliumhydroxide-oplossing 0,5M (W0004) toe en schud krachtig gedurende 10 seconden. Wacht tot de vloeistoffasen zich gescheiden hebben. Eventuele emulsievorming kan gebroken worden door toevoeging van enkele gram natriumchloride (R0200) of enkele ml ethanol (R0338). Laat de hexaanfase in een scheitrechter af. Was nu 4 tot 8 maal met steeds 100 ml water tot de fase alkalivrij is (kleuromslag van broomthymolblauw naar geel-oranje, W0006). Breng de hexaanfase over in een erlenmeyer en verwijder de laatste sporen water door te schudden na toevoeging van enkele gram natriumsulfaat (R0121). Damp een aantal ml van de hexaan-oplossing in tot droog door middel van een rotatievacuümverdamper bij gereduceerde druk en een badtemperatuur van 40 C. Koel af door kortstondig dompelen in een waterbad op kampertemperatuur. Los het residu onmiddellijk op in een aantal ml methanol zodat de concentratie dl-alfa-tocoferol 5 tot 40 µg per ml bedraagt. Document LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN dient hier weer als leidraad. Voor de recovery van vitamine E wordt LAB 25-I 59 RECOVERY VITAMINEN gevolgd HPLC-bepaling Algemene richtlijnen m.b.t. het gebruik van het HPLC-systeem (opstart, injectieschema, ) en toegestane afwijkingen worden weergegeven in LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN. 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 9/11

10 12 Berekening en rapportering Het gehalte aan dl-alfa-tocoferol van het monster wordt berekend op basis van de hoeveelheid afgewogen materiaal en van de verdunningen die in de loop van de analyse zijn uitgevoerd. Document LAB 25-I 27 VERDUNNINGEN VITAMINEN dient hier weer als leidraad. De concentratie aan dl-alfa-tocoferol wordt berekend door de HPLC System Manager software. Het resultaat wordt gerapporteerd in mg dl-alfa-tocoferol per kg. De berekening van de hoeveelheid vitamine E wordt uitgevoerd door de software aan de hand van een standaardcurve (zie ook LAB 25-P 04). Het gehalte aan vitamine E in mg/kg in het monster kan ook bepaald worden met behulp van formule: = / waarbij : A = piekoppervlakte of -hoogte van de monsteroplossing B = piekoppervlakte of -hoogte van de standaardoplossing V = volume van het monsterextract in ml (rekening houdend met eventueel uitgevoerde verdunningen) m = massa van het monster in g C = concentratie van de standaardoplossing in µg/ml De rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 04 RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN. Enkel resultaten 3 mg/kg worden gerapporteerd. 13 Opmerkingen Van monsters met de benaming kunstmelkpoeder, aanvullend kunstmelkpoeder en vetkern, wordt vooraf het vetgehalte bepaald. Indien het vetgehalte van het monster groter is dan 12%, wordt de hoeveelheid KOH verhoogd zodat bij de verzeping minstens 2,5 g KOH per gram vet aanwezig is. Deze verhoging gebeurt door toevoeging van vast KOH. Bijvoorbeeld: Het monster bevat 20% vet (6 g in 30 g monster). Dan is er 6 x 2,5 = 15 g KOH nodig Volgens Fout! Verwijzingsbron niet gevonden. wordt er 10 g toegevoegd (20 ml 50% KOH). Er moet dan nog = 5 g KOH (vast) worden toegevoegd. Voor monsters met een waarborg hoger dan mg/kg alfa-tocoferol (vitamine E), wordt standaard 10 g vast KOH toegevoegd aan de verzepingsoplossing. LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 10/11

11 14 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-F 25 LAB 25-F 62 LAB 25-I 19 LAB 25-I 23 LAB 25-I 27 LAB 25-I 59 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 04 LAB 25-P 07 AANVRAAG ONTLENING MONSTERS VITAMINEN REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN BEREIDING MONSTERS VERDUNNINGEN VITAMINEN RECOVERY VITAMINEN OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT RESULTAATVALIDATIE VITAMINEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT Bepaling van Vitamine E in dierenvoeders v.05 11/11