BEPALING VAN NICARBAZINE IN DIERENVOEDERS (HPLC)

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-035 I-MET-FLVVT-035 BEPALING VAN NICARBAZINE IN DIERENVOEDERS (HPLC) Versie 03 Datum van toepassing Opgesteld door : Nele Maris; Laborant Nazicht door : Mieke Vanbrabant; Sectieverantwoordelijke; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening R. Van Sandt, 17/09/2007 Opsteller van initiële versie 01 Volledige tekst R. Van Sandt, 22/01/2008 QAM, 2008 oktober R. van Sandt 16/10/2008 N. Maris, november 2013 Aanleiding : NC-B interne audit (2007/01B op ) vermelden berekening aan de hand van standaarcurve Bestandsnaam (methodenummer 052 wordt methodenummer 035) opnieuw versie 01 Opname methode voor premixen >1 % Update documentbeheer + update van historiek overzicht wijzigingen Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie Berekening en rapportering Volledige tekst Volledige tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document.

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN Standaarden TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE WERKWIJZE EXTRACTIE Diervoeders 0,5 5 mg/kg Diervoeders en voormengsels tot 1 % Voormengsels > 1 % OPZUIVERING Dierenvoeders 0,5 5 mg/kg Overige monsters tot 1 % HPLC-BEPALING KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN... 9

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van nicarbazine in dierenvoeders. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de controle van de dosering van nicarbazine in gemedicineerde diervoeders en premixen. De rapporteringsgrens van de methode bedraagt 2 mg/kg. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. 4 Definities en afkortingen Term HPLC Definitie High performance liquid chromatography 5 Principe Nicarbazine wordt uit het monster geëxtraheerd met een acetonitril/methanol-oplossing. Monsters met een verwacht gehalte van meer dan 5 mg/kg nicarbazine worden vooraf bevochtigd met water. Het extract wordt opgezuiverd over een aluminiumoxidekolom en indien nodig verdund. Voor monsters met een nicarbazinegehalte tot 5 mg/kg wordt een deel van het opgezuiverde extract drooggedampt en opgenomen in een klein volume eluens. Voor voormengsels vanaf 1 % wordt nicarbazine geëxtraheerd met dimethylformamide en het bekomen extract wordt verdund. Het extract wordt vervolgens geanalyseerd d.m.v. "reversedphase" hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) met behulp van een PDA detector. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx.

5 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel gevaarlijke stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. Nicarbazine is lichtgevoelig, dus moeten alle handelingen zo veel mogelijk bij beperkt daglicht uitgevoerd worden (bruin glaswerk). 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Labonr Methanol, HPLC-kwaliteit (CH 3 OH) R Water, HPLC-kwaliteit R Acetonitril, HPLC-kwaliteit (CH 3 CN) R Dimethylformamide (DMF) R Aluminiumoxide N AKT I R Extractieoplossing: ACN/CH 3 OH (50/50, v/v): Meng 500 ml acetonitril (R0026) met 500 ml methanol (R0183) ACN/CH 3OH/H 2 O (35/35/30, v/v/v): Meng 350 ml acetonitril (R0026) met 350 ml methanol (R0183) en 300 ml water (R1003) Mobiele fase: CH 3 OH/H 2 O (70/30): Meng 700 ml methanol (R0183) met 300 ml water (R1003) en plaats gedurende 10 minuten in een ultrasoonbad. Naargelang de gebruikte kolom kan de verhouding aangepast worden. W0566 W0943 W0060

6 8.2 Hulpstoffen Standaarden Nicarbazine standaardstof van gegarandeerde zuiverheid (S0523) Nicarbazine standaard stockoplossing, 100 µg/ml (W0523) Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, 10 mg nicarbazine (S0523) tot op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 100 ml en los op in extractieoplossing (W0566). Deze oplossing is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C Nicarbazine standaard werkoplossing, 10 µg/ml Pipetteer 5 ml van de standaard stockoplossing (W0523) in een maatkolf van 50 ml. Leng aan tot de maatstreep met ACN/CH 3 OH/H 2 O (35/35/30) (W0943). Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse Nicarbazine standaard werkoplossing, 2 µg/ml Pipetteer 1 ml van standaard stockoplossing (W0523) in een maatkolf van 50 ml. Leng aan tot de maatstreep met ACN/CH 3 OH/H 2 O (35/35/30) (W0943). Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse. 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT.

7 9.2 Specificaties voor deze methode De volgende condities worden als leidraad gegeven; andere parameters mogen worden gebruikt op voorwaarde dat vergelijkbare resultaten worden verkregen. HPLC-kolom: o Analytische kolom: NovaPak C18 (150 x 3,9 mm), 5 µm (Waters) of gelijkwaardig o Guard-kolom: overeenkomstig met analytische kolom (eventueel) Detector: PDA op 344 nm Loopsnelheid: 1 ml/min Injectievolume: 20 µl 10 Werkwijze 10.1 Extractie Diervoeders 0,5 5 mg/kg Weeg 10 g (± 0,1 g) van het monster af in een erlenmeyer van 200 ml. Voeg 50 ml extractieoplossing (W0566) toe, sluit de erlenmeyer en verwarm gedurende 15 minuten in een waterbad van 50 C (al schuddend). Filtreer de oplossing over een glasvezelfilter (minimaal 0,45 µm) en zuiver het filtraat op volgens Diervoeders en voormengsels tot 1 % Weeg 1 tot 10 g (± 0,1 g) van het monster af in een erlenmeyer van 200 ml. Voeg 15 ml water toe en laat 5 minuten staan op kamertemperatuur. Voeg 35 ml extractieoplossing (W0566) toe, sluit de erlenmeyer en verwarm gedurende 15 minuten in een waterbad van 50 C (al schuddend). Filtreer de oplossing over een glasvezelfilter (minimaal 0,45 µm) en zuiver het filtraat op volgens Voormengsels > 1 % Weeg 1,0 g (± 0,01 g) van het monster af in een fles van 250 ml en voeg 100 ml DMF (R0114) toe. Schud gedurende 2 uur op een schudapparaat en laat bezinken. Filtreer de oplossing over een glasvezelfilter (minimaal 0,45 µm ). Neem 0,5 ml helder filtraat en breng in een maatkolf van 50 ml. Leng aan tot de maatstreep met eluens (W0060). Deze oplossing is klaar voor HPLC-injectie.

8 10.2 Opzuivering Maak voor elk monsterextract (verwacht gehalte < 1 %) een chromatografiekolom met 4 g aluminiumoxide Dierenvoeders 0,5 5 mg/kg Breng circa 15 ml extract op een chromatografiekolom met 4 g aluminiumoxide. Verwerp de eerste 4 ml en vang vervolgens ongeveer 6 ml op. Neem hiervan 4 ml, damp droog en los op in 2 ml eluens (W0060). Deze oplossing is klaar voor HPLC-injectie Overige monsters tot 1 % Breng circa 15 ml extract op een chromatografiekolom met 4 g aluminiumoxide. Verwerp de eerste 4 ml en vang vervolgens ongeveer 8 ml op. Van monsters met meer dan 50 mg/kg wordt dit eluaat verdund met eluens (W0060) tot een concentratie van 10 µg/ml. Deze oplossing is klaar voor HPLC-injectie HPLC-bepaling Algemene richtlijnen m.b.t. het gebruik van het HPLC-systeem (opstart, injectieschema, ) worden weergegeven in LAB 25-P Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 02 RESULTAATVALIDATIE HPLC-METHODEN COCCIDIOSTATICA EN GROEIBEVORDERENDE STOFFEN 12 Berekening en rapportering De berekening van de hoeveelheid nicarbazine wordt uitgevoerd door de software aan de hand van een standaardcurve (zie ook LAB 25-P 02).

9 Het gehalte aan nicarbazine in mg/kg in het monster kan ook bepaald worden met behulp van onderstaande formule : waarbij : A = piekoppervlakte of -hoogte van de monsteroplossing B = piekoppervlakte of -hoogte van de standaardoplossing V = volume van het monsterextract in ml (rekening houdend met eventueel uitgevoerde verdunningen) m = massa van het monster in g C = concentratie van de standaardoplossing in µg/ml De rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 66 LAB 25-F 62 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-P 02 LAB 25-P 07 WERKWIJZE NICARBAZINE (HPLC) REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT RESULTAATVALIDATIE HPLC-METHODEN COCCIDIOSTATICA EN GROEIBEVORDERENDE STOFFEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT