BEPALING VAN TYLOSINE IN DIERENVOEDERS (AGARDIFFUSIE)

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-048 I-MET-FLVVT-048 BEPALING VAN TYLOSINE IN DIERENVOEDERS (AGARDIFFUSIE) Versie 03 Datum van toepassing Opgesteld door : Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Laboratoriummanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 1/11

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening V. Cloet, 06/2007 Opsteller van initiële versie QAM, 12/2008 M. Vanbrabant, 03/2013 Nummering FoodLIMS Blz Opmerkingen tijdens externe BELAC audit 12/ algemene update. Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 03. Volledige tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 2/11

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN Standaarden Micro-organisme Voedingsbodem TOESTELLEN ALGEMEEN WERKWIJZE EXTRACTIE Verdunning van het monsterextract ENTEN VAN DE VOEDINGSBODEM KLAARMAKEN VAN DE PLATEN INCUBATIE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 3/11

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van tylosine in dierenvoeders. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de controle van versleping en dosering van tylosine in gemedicineerde diervoeders en premixen. De rapporteringsgrens van de methode bedraagt 2 mg/kg. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Overzicht van de belangrijkste afwijkingen ten opzichte van de referentiemethode: Overenting van de stam Bereiding van de entsuspensie Concentratie en houdbaarheid van standaard stockoplossing Extractie dierenvoeders Aflezing met behulp van vergrotingsapparatuur en digitale schuifpasser Dataverwerking via softwareprogramma 4 Definities en afkortingen Term Definitie 5 Principe Een monster wordt geëxtraheerd en vervolgens verder verdund met een mengsel van fosfaatbuffer ph 8 en methanol. LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 4/11

5 De antibiotische activiteit wordt bepaald door het meten van de diffusie (inhibitie- of remmingszones) van tylosine in een agarvoedingsbodem geënt met Micrococcus luteus (ATCC 9341). De diameters van de bekomen remmingszones zijn rechtevenredig met het logaritme van de antibioticumconcentratie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel gevaarlijke stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Richtlijnen in verband met werken in het microbiologisch labo worden beschreven in LAB 25-I 15 HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO. De risicoklasse waartoe de gebruikte stam behoort, is terug te vinden in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Labonr Water, gedemineraliseerd (demi) R Methanol, HPLC-kwaliteit (CH 3 OH) R Natriumhydroxide pellets (NaOH) R Natriumhydroxide (NaOH) 1N: los 40 g NaOH pellets (R0206) op in 1 l H 2 O W0110 LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 5/11

6 8.1.5 Zoutzuur, 37% (HCl) R Zoutzuur (HCl) 1N W Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4 ) R Di-kaliumwaterstoffosfaat (K 2 HPO 4 ) R Fosfaatbuffer (ph 8,0): Weeg 0,523 g kaliumdiwaterstoffosfaat (R0719) en 16,73 g di-kaliumwaterstoffosfaat (R0120) af in een 1 liter kolf. Leng aan tot de W0174 maatstreep met water (R1004). Breng op ph 8,0 ± 0,1 met 1N NaOH of 1N HCl Fosfaatbuffer ph 8,0/Methanol (W0174/R0183) (80/20, v/v) W Fosfaatbuffer ph 8,0/Methanol (W0174/R0183) (50/50, v/v) W Fosfaatbuffer ph 7,0: Weeg 5,5 g kaliumdiwaterstoffosfaat (R0719) en 13,6 g dikaliumwaterstoffosfaat (R0120) af in een 1 liter kolf. Leng aan tot de W0161 maatstreep met water (R1004). Breng op ph 7,0 ± 0,1 met 1N NaOH of 1N HCl Methanol 40% (v/v) W Natriumchloride (NaCl) R Steriele fysiologische zoutoplossing (0,85 %) (m/v): Los 8,5 g natriumchloride (R0200) op in water (R1004) en verdun tot W ml en autoclaveer Oxoid Antibiotic Medium nr. 1 (CM0327) of gelijkwaardig R Entsuspensie Micrococcus luteus (sarcina) (ATCC 9341) W Hulpstoffen Standaarden Tylosine standaardstof met gegarandeerde zuiverheid (S0109) Tylosine standaard stockoplossing, 200 µg/ml (W0129) Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, X mg tylosine (S0109) tot op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 50 ml en registreer de afgewogen hoeveelheid X op LAB 25-F 04 ANTIBIOTICA REGISTRATIE STOCKSTANDAARDOPLOSSING. Los op in 5 ml methanol (R0183) en leng vervolgens aan tot de maatstreep met fosfaatbuffer ph 7,0 (W0161) zodat de concentratie 200 µg/ml bedraagt. Deze oplossing is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C. LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 6/11

7 Tylosine standaard werkoplossing, 2 μg/ml Pipetteer 0,5 ml van de standaard stockoplossing (W0129) in een maatkolf van 50 ml. Leng aan tot de maatstreep met fosfaatbuffer ph 8,0/methanol (80/20) (W0080) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse en komt overeen met standaardoplossing S 8. Door opeenvolgende verdunningen met fosfaatbuffer ph 8,0/methanol (80/20) (W0080) worden de volgende standaardoplossingen bereid: S 8 2 µg/ml (onverdund) S 4 S 2 S 1 1 µg/ml 0,5 µg/ml 0,25 µg/ml Algemene richtlijnen met betrekking tot aanmaak en beheer van standaarden worden weergegeven in LAB 25-D 40 ANTIBIOTICA OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN en LAB 25-I 19 BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN Micro-organisme Micrococcus luteus (sarcina) (ATCC 9341), risicoklasse 1 (M0102) Algemene richtlijnen met betrekking tot de overenting en het gebruik van stamculturen worden weergegeven in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA Bewaren van de stam Micrococcus luteus wordt geënt in een buis met schuin gestolde agarvoedingsbodem ( ). Na uur incubatie bij 37 ± 2 C wordt deze cultuur in de koelkast bewaard bij een temperatuur van 4 ± 4 C en maandelijks overgeënt Bereiding van de entsuspensie (W0186) Een vers bereide cultuur op schuin gestolde agarvoedingsbodem ( ) wordt gesuspendeerd in 5 à 10 ml steriele fysiologische zoutoplossing (W0115). Deze entsuspensie is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C. LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 7/11

8 8.2.3 Voedingsbodem In de handel verkrijgbare kant-en-klare voedingsbodems van gelijke of nagenoeg gelijke samenstelling, mogen worden gebruikt mits ze dezelfde resultaten geven. Tenzij anders vermeld worden oplossingen van NaOH (1N) en HCl (1N) gebruikt om de ph op punt te stellen Voedingsbodem voor het bewaren van de stam en bepaling Glucose Pepton (Trypton) Vleesextract Gistextract Agar Water (demi) 1 g 10 g 1,5 g 3 g 15 g 1000 ml Voor het bewaren van de stam: Breng ph op 7,0 ± 0,2 na autoclaveren (20 minuten bij 121 ± 1 C). Laat de buizen voor het bewaren van de stam schuin stollen. Voor de bepaling: Breng ph op 8,0 ± 0,2 na autoclaveren (20 minuten bij 121 ± 1 C). Kant-en-klare alternatieven: Antibiotic Medium nr. 1 CM327 (R0072) 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 10 Werkwijze De af te wegen hoeveelheid en de uit te voeren verdunningen variëren naargelang het verwachte gehalte. De relatie gehalte - af te wegen hoeveelheid verdunning(en) wordt weergegeven in LAB 25-D 41 ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN. LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 8/11

9 10.1 Extractie Weeg een hoeveelheid monster (2-20 g ± 0,1 g) af in een fles van 250 ml en voeg 100 ml fosfaatbuffer ph 8,0 /methanol (80/20) (W0080) toe Schud gedurende 30 minuten Centrifugeer (default 10 minuten@3500 rpm) Verdun met fosfaatbuffer ph 8,0 /methanol (80/20) (W0080) tot een verondersteld tylosine gehalte van 2 µg/ml (= U 8 ) Bij gehalten lager dan 10 mg/kg wordt het extract in een rotatieverdamper ingedampt bij 35 C en in oplossing W0080 opgenomen zodat een verondersteld tylosine gehalte van 2 µg/ml (= U 8 ) bekomen wordt Verdunning van het monsterextract Bereid onmiddellijk de volgende monsteroplossingen met onderstaande verwachte gehalten door opeenvolgende 1 op 1 verdunningen met fosfaatbuffer ph 8,0 /methanol (80/20) (W0080): U 8 2 µg/ml (onverdund) U 4 U 2 U 1 1 µg/ml 0,5 µg/ml 0,25 µg/ml 10.2 Enten van de voedingsbodem De voedingsbodem voor de bepaling ( ) wordt bij ongeveer 50 C met entsuspensie ( ) geënt als volgt: 0,1 ml entsuspensie (W0186) per 100 ml voedingsbodem. Indien de remmingszones na incubatie niet optimaal zijn, wordt de hoeveelheid toegevoegde entsuspensie aangepast volgens LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA Klaarmaken van de platen De agardiffusie gebeurt in platen waarop de vier standaardconcentraties (S 8, S 4, S 2 en S 1 ) en de vier extractenconcentraties (U 8, U 4, U 2 en U 1 ) elk 2 maal voorkomen. Elke plaat moet beslist alle vier concentraties van standaard en extract bevatten. Daarom moet de afmeting van de platen zo gekozen worden dat men in de agarvoedingsbodem tenminste 8 gaatjes kan ponsen van 13 mm diameter, waarvan de middelpunten niet minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 9/11

10 In dit geval worden 2 platen met 16 ponsgaatjes gebruikt, dus 32 remmingszones in totaal als grondslag voor de berekening (elke standaard- en monsterconcentratie in viervoud). Giet in de platen een hoeveelheid geënte voedingsbodem (10.2), zodat een laagdikte van ca. 2 mm bekomen wordt Laat de voedingsbodem stollen en pons er de gaatjes in met het ponstoestel Pipetteer exact 100 µl van de 4 standaard- en extractoplossingen in de ponsgaatjes van beide platen volgens onderstaand schema: U 1 U 2 S 2 S 1 U 2 U 1 S 1 S 2 S4 S 8 U 8 U 4 S 8 U 8 S 4 U Incubatie Incubeer de platen gedurende 16 tot 24 uur in een broedstoof bij 37 ± 2 C. 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 10/11

11 12 Berekening en rapportering De diameter van de waargenomen remmingszones wordt met behulp van vergrotingsapparatuur en een elektronische schuifpasser gemeten tot op 0,1 mm nauwkeurig. De gegevens worden automatisch ingelezen, waarna een softwareprogramma zorgt voor de dataverwerking. De formules die gebruikt worden in het softwareprogramma, de rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 29 LAB 25-D 40 LAB 25-D 41 LAB 25-D 53 LAB 25-F 04 LAB 25-F 62 LAB 25-I 15 LAB 25-I 19 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-L 23 LAB 25-P 01 LAB 25-P 07 AANMAAK CONTROLEMONSTERS ANTIBIOTICA ANTIBIOTICA: OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN WERKWIJZE TYLOSINE ANTIBIOTICA REGISTRATIE STOCKSTANDAARDOPLOSSING REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT LIJSTEN ANTIBIOTICA RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-048 Bepaling van Tylosine in dierenvoeders (Agardiffusie) v.03 11/11