VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION

Transcriptie

1 VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique IMETFLVVT058 Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders Screening pour des substances antibactériennes dans les aliments pour animaux Agardiffusie 7 platen (Bioautografisch systeem) Diffusion en gélose 7 plaques (Système bioautographique) Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Dierenvoeders Aliments pour animaux Totaal Totale Secundair Secondaire Minivalidatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie Fonction: Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Datum Date: Nvt Naam Nom: Mandy Lekens Functie Fonction: Labomanager Datum Date: Handtekeningen Signatures: (get.) Handtekeningen Signatures: (get.) LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v /40

2 Stap Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied Déterminer le champs d application De methode moet geschikt zijn voor de kwalitatieve screening op antibacteriële activiteit in dierenvoeders (aanvullende diervoeders, volledige diervoeders en voormengsels). Stap Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode Le but et status de la méthode d analyse Kwalitatieve screeningsmethode, interne (inhouse) methode gebaseerd op Bepaling van antimicrobiële activiteit met behulp van een 5platen bioautografisch systeem (CCL, Veghel, 1993). Stap Phase 3: Keuze validatieparameters Choisir les paramètres à valider Voor deze methode dienen minimaal de volgende prestatiekenmerken te worden bepaald: specificiteit / selectiviteit, toepasbaarheid / robuustheid / stabiliteit en detectievermogen CCβ. Daarnaast wordt ook de uitbreiding van de referentiemethode van 5 platen naar 7 platen toegelicht. Stap Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters Des exigences externes pour les paramètres à valider Nvt. Stap Phase 5: Keuze van de monsters Le choix d échantillons De geschiktheid van de methode zal getest worden op (gedopeerde) routinemonsters die een grote gelijkenis met de meest voorkomende praktijkmonsters vertonen. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v /40

3 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption IMETFLVVT058 Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders Screening pour des substances antibactériennes dans les aliments pour animaux Agardiffusie 7 platen (Bioautografisch systeem) Diffusion en gélose 7 plaques (Système bioautographique) Dierenvoeders Aliments pour animaux 2013/11/20 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

4 Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie paragraaf 4 De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Zie paragraaf 4 Historiek validatie Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen 01 09/2002, M. Lekens Opsteller initiële versie Volledige tekst 02 11/2013, M. Vanbrabant Voorbereiding publicatie + NC s BELAC audit (incubatietemperatuur, activiteit van enzymen en toelichting CCβ) Toevoeging validatieplan en overzicht validatierapport + historiek + extra validatiegegevens LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

5 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique IMETFLVVT058 Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders Screening pour des substances antibactériennes dans les aliments pour animaux Agardiffusie 7 platen (Bioautografisch systeem) Diffusion en gélose 7 plaques (Système bioautographique) Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Dierenvoeders Aliments pour animaux Totaal Totale Secundair Secondaire Minivalidatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie Fonction: Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Datum Date: Veerle Cloet: laborant Annemie Voets: laborant Martine Bral: laborant Nele Maris: laborant Start Début: Einde Fin: Naam Nom: Mandy Lekens Functie Fonction: Labomanager Datum Date: Handtekeningen Signatures: (get.) Handtekeningen Signatures: (get.) Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

6 Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation Doel en toepassingsgebied Analisten Toelichting uitbreiding aantal platen bioautografisch systeem (sept. 2002) ATCC B. cereus LMG Prestatiekenmerken Toepasbaarheid / robuustheid / stabiliteit (2002) Bereiding en controle entsuspensies Micrococcus luteus ATCC Micrococcus luteus ATCC Bacillus cereus LMG (tetracycline resistent) Bacillus subtilis BGA sporensuspensie Vergelijking entsuspensies IMETFLVVT058 met referentiemethode Concentratie en houdbaarheid trimethoprimoplossing Hoeveelheid TMP per ml voedingsbodem Houdbaarheid TMP oplossing Controlestandaarden Remzones controlestandaarden per plaat Overzicht gemiddelde remzones tylosine en tetracycline Overentingstermijn stamculturen en houdbaarheid entsuspensies Kwaliteitscontrole Solventblanco Controlestandaarden Resultaatinterpretatie en weergave Reproduceerbaarheid (Inter) Selectiviteit / specificiteit ( ) Rempatronen (2002) Rempatronen van enkele zuivere antibacteriële stoffen in methanol/water (70/30) Rempatronen van enkele monsterextracten met gekend gehalte antibacteriële stof Rempatronen van enkele gedopeerde voederextracten met gekend gehalte antibacteriële stof (op detectieniveau) Effect van sporenelementen (2002) Temperatuur broedstoof tijdens incubatie (juni 2013, NM) CCβ (juni 2013) Definitie CCβ Vergelijking MICs IMETFLVVT058 met referentiemethode Detectielimieten IMETFLVVT Werking enzymen screening antibiotica (βlactamase en penicillinase) Test werking enzymen (nov. 2013, AV) Interpretatie resultaten Overzicht grootte remzones met/zonder enzymen Overzicht foto s 7 platen met/zonder enzymen LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

7 Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1 Doel en toepassingsgebied Kwalitatieve screening van de aanwezigheid van stoffen met antibacteriële activiteit in dierenvoeders met behulp van een agardiffusiemethode bestaande uit een 7 platen bioautografisch systeem (CCL, Veghel). Voor bacterieel sterk verontreinigde monsters is deze methode niet bruikbaar. 2 Analisten Het validatieonderzoek wordt uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijken Mandy Lekens (2002) / Mieke Vanbrabant (2013) door de volgende analisten: Veerle Cloet (VC) (2002) Annemie Voets (AV) ( ) Martine Bral (MB) (2002) Nele Maris (NM) (2013) 3 Toelichting uitbreiding aantal platen bioautografisch systeem (sept. 2002) Referentiemethode IMETFLVVT058 B. subtilis BGA ph 6 B. subtilis BGA ph 6 B. subtilis BGA ph 8 B. subtilis BGA ph 8 B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP ATCC 9341 ph 6 ATCC 9341 ph 6 ATCC 9341 ph 8 ATCC 9341 ph 8 ATCC ph 6,5 B. cereus LMG ph 6,5 (tetracycline resistent) 5 platen 7 platen Conventie: De grootte van remmingszones of remzones wordt in de regel weergegeven door een absoluut getal, variërend van 120 tot meer dan 260. Dit getal is het resultaat van een 7,5 maal vergroting van de remzone in mm om een ponsgat met een diameter van 13,3 mm. Een andere manier om de grootte van remzones weer te geven is het gebruik van volgende notatie: remzone < 120 remzone remzone remzone remzone remzone remzone > 260 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

8 3.1 ATCC Het microorganisme ATCC wordt in het FLVVT gebruikt bij de kwantitatieve bepaling van zinkbacitracine (IMETFLVVT047). Uit vooronderzoek van gedopeerde stalen bleek dat het gebruik van deze plaat, naast de opsporing van bacitracine, ook de detectie van avilamycine vergemakkelijkt. Door gebruik van deze plaat bij de screeningsmethode vergroot bijgevolg de kans op detectie van deze producten. Bacitracine Bacitracine Bacitracine Avilamycine Avilamycine Conc (mg/kg) Staal nr / / / / /01 B. subtilis BGA ph B. subtilis BGA ph B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP ATCC 9341 ph ATCC 9341 ph ATCC ph 6, B. cereus LMG Het microorganisme B. cereus LMG is resistent voor antibiotica van de groep tetracyclines. Het gebruik van een plaat beënt met dit microorganisme bij de routinescreening laat toe om eventueel aanwezige tetracyclines op te sporen. Verdwijnen of verkleinen van remzones, wel aanwezig op de plaat beënt met B. subtilis BGA ph 6 (gevoeligste testplaat voor tetracyclines), op de plaat B. cereus LMG kan een indicatie zijn voor de aanwezigheid van antibiotica van de groep tetracyclines. Analyse van een tetracyclinestandaard (1µg/ml, bereid zoals beschreven in IMETFLVVT058) levert de volgende gegevens op (zie ook 4.1.3): Diameter remzone tetracyclinestandaard (1 µg/ml) Plaat B. subtilis BGA ph 6 B. cereus LMG Uitvoerder 1 Uitvoerder 2 Uitvoerder 1 Uitvoerder Gemiddelde Stdev 8,0 4,2 RSD (%) 4,1 2,1 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

9 4 Prestatiekenmerken 4.1 Toepasbaarheid / robuustheid / stabiliteit (2002) Bereiding en controle entsuspensies Validatie van de bereiding en controle van de entsuspensies met als doelstelling: a. Aantonen dat met de werkwijze vermeld in de methode een reproduceerbaar aantal kve (kolonievormende eenheden) per ml voedingsbodem bekomen wordt. b. Door middel van absorptiemetingen bij 650 nm en kiemtellingen van de verschillende entsuspensies een verband leggen tussen gemeten absorptie en aantal kiemen zodat in de praktijk een snelle controle van de verschillende entsuspensies mogelijk wordt. Om een zo uitgebreid mogelijke gegevensreeks te krijgen, werden de verschillende entsuspensies ¼ serieel verdund met fysiologische zoutoplossing. Van elk van de bekomen verdunningen werd vervolgens een decimale verdunningsreeks gemaakt door telkens 1 ml in 9 ml fysiologische zoutoplossing te brengen. Van al de bekomen oplossingen werd de absorptie t.o.v. fysiologische zoutoplossing gemeten bij 650 nm. Vervolgens werd 1 ml van de verdunningsreeksen in duplo in steriele petriplaten gebracht, waarna ca. 15 ml tot 45 C afgekoelde plate count agar (PCA, R0580) werd toegevoegd. Na mengen en stollen van de agar werden de platen 1824 uur bebroed bij 37 ± 1 C. Daarna werden de kolonies van de bebroede duploplaten van de laagste verdunning, die 30 tot 300 kolonies bevatten, geteld. Het aantal kve/ml van de suspensie kan dan berekend worden door het gemiddelde van het aantal kolonies op de twee platen te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor. De beschreven test werd uitgevoerd door twee personen. Drie afzonderlijke slants van de stamculturen (bekomen zoals beschreven in IMETFLVVT058) van ATCC 9341, ATCC en B. cereus LMG werden door dezelfde persoon gesuspendeerd in 3 x 4 ml fysiologische zoutoplossing. Vervolgens werd de test uitgevoerd zoals hoger beschreven (resultaten kiemtelling entsuspensie in tabel weergegeven). De relatie tussen het aantal kiemen in deze suspensies en de gemeten absorpties bij 650 nm wordt weergegeven in bijlage. Voor B. subtilis BGA werd nagegaan of het gemiddeld aantal kve/ml van de sporensuspensie voldeed aan de gegevens vermeld op het bijgevoegde attest. Het attest is tevens terug te vinden in bijlage. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

10 Micrococcus luteus ATCC 9341 Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV (meting 1) 64 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 VC (meting 2) 42 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat indien bij 1/10 verdunning van de entsuspensie een absorptie wordt gemeten tussen 0,30 en 0,60, de entsuspensie zelf kiemen per ml bevat. Bij bereiding van nieuwe entsuspensie kan dus via absorptiemetingen het aantal kiemen gecontroleerd worden Micrococcus luteus ATCC Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV (meting 1) 296 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 VC (meting 2) 40 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat indien bij 1/10 verdunning van de entsuspensie een absorptie wordt gemeten tussen 0,25 en 0,50, de entsuspensie zelf kiemen per ml bevat. Bij bereiding van nieuwe entsuspensie kan dus via absorptiemetingen het aantal kiemen gecontroleerd worden Bacillus cereus LMG (tetracycline resistent) Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV (meting 1) 243 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 VC (meting 2) 47 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

11 Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat indien bij 1/10 verdunning van de entsuspensie een absorptie wordt gemeten tussen 0,25 en 0,50, de entsuspensie zelf kiemen per ml bevat. Bij bereiding van nieuwe entsuspensie kan dus via absorptiemetingen het aantal kiemen gecontroleerd worden Bacillus subtilis BGA sporensuspensie Deze sporensuspensie bevat volgens het bijgevoegde attest kve/ml (met als grenzen tot kve/ml). Van deze suspensie werd een decimale verdunningsreeks uitgeplaat. Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV 30 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 MB 46 x x x x x x x x x /01/ /01/ /01/2002 Gezien de inhoud van een ampul (volume 2 ml) wordt toegevoegd aan 4 ml fysiologische zoutoplossing, bedraagt het totale volume 6 ml met daarin, volgens het attest, kve wat overeenkomt met kve/ml (theoretische grenzen 2, tot 1, kve/ml, zie tabel). Rekening houdend met de verdunningsfactor voldoet de sporensuspensie aan het attest gezien het gemiddeld aantal kve/ml tot bedraagt. Minimum Gemiddelde Maximum Attest (kve/ml) Attest (kve/2 ml) Na verdunning (kve/6 ml) Na verdunning (kve/ml) 2, , Vergelijking entsuspensies IMETFLVVT058 met referentiemethode ATCC 9341: KDLL: kve per ml voedingsbodem IMETFLVVT058: 0,1 ml toevoegen van kve/ml per 100 ml bodem geeft kve per ml bodem. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

12 M.luteus ATCC 10240; B. cereus TC resistent: IMETFLVVT058: 0,1 ml toevoegen van kve/ml per 100 ml bodem geeft kve per ml bodem. B. subtilis BGA sporensuspensie: KDLL: kve per ml voedingsbodem IMETFLVVT058: 0,3 ml toevoegen van kve/ ml per 100 ml bodem geeft kve per ml bodem Indien men onder de omstandigheden zoals vermeld in IMETFLVVT058 de entsuspensies maakt, bekomt men een reproduceerbare maat voor het gehalte aan kiemen. Controle van het aantal kiemen in de entsuspensie kan gebeuren door het maken van een 1/10 verdunning van de entsuspensie en meting van absorptie van deze verdunning (t.o.v. fysiologische zoutoplossing) bij 650 nm. Bij afwijkende absorptiemetingen moet de entsuspensie hetzij verdund (bij te hoge absorptie), hetzij opnieuw bereid worden (beschreven in IMETFLVVT058). Toevoegen van 0,3 ml B. subtilis BGA entsuspensie en 0,1 ml en B. cereus entsuspensie per 100 ml voedingsbodem levert een reproduceerbaar aantal kiemen per ml voedingsbodem op. Mogelijke schommelingen hierop worden opgevolgd via de controlestandaarden tylosine en tetracycline (zie 4.1.3) Concentratie en houdbaarheid trimethoprimoplossing Van de gebruikte trimethoprimoplossing werden de houdbaarheid en de optimale toe te voegen hoeveelheid per 100 ml voedingsbodem bepaald Hoeveelheid TMP per ml voedingsbodem Om zo groot en zo scherp mogelijke remmingszones op de plaat met TMP toevoeging te verkrijgen, werden verschillende hoeveelheden TMP toegevoegd per ml bodem van de plaat beënt met B. subtilis BGA ph 7,2 (0,07 µg; 0,14 µg; 0,28 µg en 0,56 µg.) Vervolgens werden 6 maal de controlestandaarden tylosine (2 µg/ml) en tetracycline (1 µg/ml) en een sulfadimidinestandaard (0,3 µg/ml) opgebracht. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

13 Aantal µg TMP per ml voedingsbodem Tylosine Tetracycline Sulfadimidine Opmerkingen 0, Gemiddelde Stdev 2,6 1,9 RSD (%) 1,3 1,2 0, Gemiddelde Stdev 3,4 2,0 3,1 RSD (%) 1,6 1,3 2,4 0, Gemiddelde Stdev 2,7 2,4 3,9 RSD (%) 1,3 1,5 2,7 0, Gemiddelde Stdev 2, 2,2 2,9 RSD (%) 1,1 1,3 2,0 controle: kleine, wazige zones sulfa: niet altijd te detecteren controle: zones groter, redelijk scherp sulfa: zones niet duidelijk controle: zones even groot, scherper sulfa: duidelijke zones geen verbetering zonegrootte of scherpte Gezien door toevoeging van meer dan 0,28 µg TMP per ml voedingsbodem geen aanzienlijke verbetering van de remmingszones optrad en de zones bekomen bij 0,14 µg/ml minder scherp waren, wordt geopteerd voor toevoeging van 0,28 µg TMP per ml voedingsbodem LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

14 Houdbaarheid TMP oplossing. De houdbaarheid van de TMP oplossing werd bij 4±4 C vastgesteld op 1 maand. Hiertoe werd de analyse uitgevoerd met een 1 maand oude TMP oplossing en met een vers bereide TMP oplossing (gegevens cf. validatie controlestandaarden A. Voets). De bekomen resultaten worden hieronder weergegeven en geven aan dat er geen significante verschillen bestaan tussen de bekomen remzones met de oude en de nieuwe oplossing. Validatiegegevens van de gebruikte controlestandaarden worden weergegeven in Plaat Tylosine Tetracycline nieuwe TMP TMP 1 maand oud nieuwe TMP TMP 1 maand oud B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP Gemiddelde Stdev 7,1 4,1 4,8 2,5 RSD (%) 3,4 2,0 2,9 1,5 ttest 0,96 0,71 Ftest 0,25 0, Controlestandaarden In de referentiemethode wordt gebruikgemaakt van de controlestandaarden tylosine (5,0 ± 0,2 µg/ml) en natriumsulfadimidine (5,0 ± 0,2 µg/ml). In IMETFLVVT058 wordt de natriumsulfadimidinestandaard vervangen door een tetracyclinestandaard om zo antibiotica van de groep tetracyclines te kunnen opsporen. Van de gebruikte concentraties van de controlestandaarden (tylosine 2 µg/ml en tetracycline 1 µg/ml) werd aangetoond dat ze voldoende grote remzones geven Remzones controlestandaarden per plaat De validatie van het gebruik van de controlestandaarden werd uitgevoerd op 14/01/2002 en 15/01/2002 door AV en VC. De controlestandaarden worden bereid volgens IMETFLVVT058 Op elk van de 7 platen (beënt met vers bereide entsuspensie) worden 6 maal de controlestandaarden aangebracht (100 µl per ponsgat) Voor de plaat waaraan TMP wordt toegevoegd, wordt vers bereide TMP oplossing gebruikt LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

15 Plaat M. Luteus ATCC 9341 ph 6 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 5,4 6,7 3,1 4,5 RSD (%) 3,1 3,8 2,1 3, Plaat M. Luteus ATCC 9341 ph 8 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 7,5 9,2 RSD (%) 3,1 3,7 Plaat M. Luteus ATCC ph 6,5 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 8,5 7,9 5,5 5,2 RSD (%) 3,6 3,4 3,4 3, LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

16 Plaat Bacillus subtilis BGA ph 6 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 3,9 3,9 8,0 4,2 RSD (%) 3,0 3,0 4,1 2, Plaat Bacillus subtilis BGA ph 8 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 6,6 7,7 RSD (%) 3,4 3,9 Plaat Bacillus subtilis BGA ph 7,2 + TMP Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 7,1 7,5 4,8 7,6 RSD (%) 3,4 3,5 2,9 4, LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

17 Plaat Bacillus cereus TC resistent ph 6,5 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C Gemiddelde Stdev 3,7 4,8 RSD (%) 2,8 3, Overzicht gemiddelde remzones tylosine en tetracycline Uitgaande van bovenstaande gegevens kunnen per plaat voor beide controlestandaarden gemiddelde remzones en bijhorende standaarddeviaties worden berekend: Plaat/Kiem Bacillus subtilis BGA ph 6 Bacillus subtilis BGA ph 8 Bacillus subtilis BGA ph 7,2 M. Luteus ATCC 9341 ph 6 M. Luteus ATCC 9341 ph 8 M. Luteus ATCC ph 6,5 B. cereus TC resistent ph 6,5 Remzone Tylosine (2 µg/ml) Stdev 128 3, , , , , , ,18 Remzone Tetracycline (1 µg/ml) Stdev 198 6, , , ,08 De tylosine referentiestandaard zal op alle platen worden aangebracht (beschreven in IMETFLVVT 058). De tetracycline referentiestandaard wordt in methode IMETFLVVT058 enkel op de platen beënt met Bacillus cereus TC resistent en met Bacillus subtilis BGA ph 6 (gevoeligste testorganisme) aangebracht, dit ter indicatie van mogelijk aanwezige tetracyclines. De bekomen gemiddelde remzones en de bijhorende standaardafwijkingen kunnen gebruikt worden voor de kwaliteitscontrole van de methode (zie 4.1.5) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

18 4.1.4 Overentingstermijn stamculturen en houdbaarheid entsuspensies Volgens de officiële EU agardiffusiemethoden bedraagt de overentingstermijn van stamculturen 4 weken. Gezien zowel ATCC 9341 als ATCC gebruikt worden voor respectievelijk de kwantitatieve bepaling van tylosine en bacitracine (beide geaccrediteerde agardiffusiemethoden) ligt hun overentingstermijn vast op 4 weken. De overentingstermijn van B. cereus LMG werd vastgelegd op 4 weken aangezien werd aangetoond dat met een kiem van een maand oud vergelijkbare resultaten werden verkregen als met een nieuwe pas overgeënte kiem (resultaten in tabel weergegeven). Ook van de enstuspensies werd de houdbaarheidstermijn bepaald. Hiertoe werd de stamcultuur (bereid zoals beschreven in IMETFLVVT058) afgespoeld in 4 ml fysiologische zoutoplossing. Vervolgens werden de controlestandaarden geanalyseerd met deze vers bereide entsuspensie (gegevens cf. validatie controlestandaarden, AV). De entsuspensie werd vervolgens een maand bewaard bij 4±4 C, waarna de analyse werd herhaald en de bekomen remzones met elkaar werden vergeleken. ATCC 9341 ATCC Tylosine nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud ph Gemiddelde Stdev RSD(%) 172 5,4 3,1 ph Gemiddelde Stdev RSD(%) Gemiddelde Stdev RSD(%) 244 7,5 3, ,5 3, ,1 1, ,4 2, ,1 3,1 Tetracycline nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud ,1 2, ,5 3, ,9 2, ,3 2,1 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

19 B. cereus LMG Gemiddelde Stdev RSD(%) nieuwe entsuspensie van verse stam ,7 2,8 Tylosine Entsuspensie 1 maand oud ,0 2,3 nieuwe entsuspensie van stam 1 maand oud ,9 2,9 Tetracycline alle platen Hoewel sommige entsuspensies eventueel een langere houdbaarheidstermijn kunnen hebben, wordt per definitie de houdbaarheid van de bereide entsuspensies beperkt tot 1 maand. B. subtilis BGA ph Gemiddelde Stdev RSD(%) Tylosine nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud ,9 3,0 ph Gemiddelde Stdev RSD(%) ph 7,2 + TMP Gemiddelde Stdev RSD(%) 195 6,6 3, ,1 3, ,5 1, ,4 2, ,3 3,4 Tetracycline nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud ,0 4, ,8 2, ,1 3, ,2 2,6 De aangekochte ampul entsuspensie van Bacillus subtilis BGA heeft volgens het bijgevoegde attest een houdbaarheid van 1 jaar. De gebruikte entsuspensie voor IMETFLVVT058 wordt bereid door LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

20 aan deze ampul 4 ml fysiologische zoutoplossing toe te voegen. Voor deze bereide suspensie werd tevens een houdbaarheid van 1 maand bij 4±4 C aangetoond Kwaliteitscontrole Solventblanco De solventblanco wordt meegenomen bij elke analyse en bestaat erin dat 100 µl methanol/water (70/30) in een ponsgaatje wordt gebracht. In de referentiemethode moet een analyse herhaald worden indien voor de blanco een remzone > 11 mm diameter wordt bekomen voor een ponsgat met diameter 9 mm. In methode IMETFLVVT058 geeft het toepassen van het criterium op een ponsgat van 13,3 mm een maximale remzone van 15,3 mm, of rekening houdend met de afleesapparatuur (x 7,5) een waarde van 114,75. In de methode wordt de maximale zonegrootte voor de blanco vastgelegd op Controlestandaarden Door bereiding van de entsuspensie volgens IMETFLVVT058 en het toevoegen van steeds dezelfde hoeveelheid entsuspensie per 100 ml voedingsbodem, wordt er gestreefd naar een reproduceerbaar aantal kiemen per ml voedingsbodem, wat onder andere kan opgevolgd worden aan de hand van de grootte van de remzones van de controlestandaarden. In de referentiemethode moet de analyse herhaald worden wanneer de voor de controleoplossingen gevonden remzone buiten het gebied valt, gevormd door de gemiddelde remzone ± 3x de standaarddeviatie voor de betreffende controleoplossing en plaat. Toepassing van dit criterium op de waarden bekomen bij validatie van de controlestandaarden levert de volgende gegevens op: Maximale afwijking controlestandaarden, rekening houdend met de standaarddeviatie Tylosine (2 µg/ml) Tetracycline (1 µg/ml) Plaat/Kiem min gem max min gem max Bacillus subtilis BGA ph 6 Bacillus subtilis BGA ph 8 Bacillus subtilis BGA ph 7,2 M. Luteus ATCC 9341 ph 6 M. Luteus ATCC 9341 ph 8 M. Luteus ATCC ph 6,5 B. cereus TC resistent ph 6, LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

21 De bekomen maximale afwijkingen blijken goed benaderd te kunnen worden door te stellen dat de gemeten remzone van de controlestandaarden maximaal 10 % mag afwijken van de gemiddelde waarde. Maximale afwijking controlestandaarden, berekend als 10 % van gemiddelde waarde Tylosine (2 µg/ml) Tetracycline (1 µg/ml) Plaat/Kiem min gem max min gem max Bacillus subtilis BGA ph 6 Bacillus subtilis BGA ph 8 Bacillus subtilis BGA ph 7,2 M. Luteus ATCC 9341 ph 6 M. Luteus ATCC 9341 ph 8 M. Luteus ATCC ph 6,5 B. cereus TC resistent ph 6, Resultaatinterpretatie en weergave Referentie: Een resultaat wordt als positief beschouwd wanneer er een remzone 15 mm voor een ponsgat van 9 mm wordt bekomen. IMETFLVVT058: Toepassen van dit criterium op methode IMETFLVVT058 levert een positief resultaat wanneer er een remzone 13,3 + 6 = 19,3 mm wordt bekomen of (x 7,5) een waarde van 144,75. Het criterium vermeld in IMETFLVVT058 beschouwd een resultaat als positief als de remzone > 140 of de remrand 15 en dit omwille van de zeer kleine remzones die soms worden verkregen bij lage concentraties van remmende stoffen (zie ook 0). Details van resultaatweergave worden vermeld in IMETFLVVT Reproduceerbaarheid (Inter) Er werd nog niet deelgenomen aan ringtesten. In afwachting hiervan wordt er intern een tweedelijnscontrole uitgevoerd, welke moet voldoen aan de aanvaardingscriteria. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

22 4.2 Selectiviteit / specificiteit ( ) Rempatronen (2002) De rempatronen, zichtbaar op de platen van het bioautografisch systeem, verschillen al naargelang het zuivere standaarden in oplossing of reële antibioticumbevattende monsters betreft. Bovendien kunnen omwille van matrixeffecten de waargenomen rempatronen bij reële monsters licht wijzigen. Bij poging tot identificatie van een bepaald antibioticum, moet dus de nodige voorzichtigheid in acht genomen worden. Ter illustratie zijn hier rempatronen van enkele standaarden opgelost in methanol/water (70/30), alsook van enkele reële monsters weergegeven. Ook gegevens van op detectieniveau gedopeerde voeder en vleesextracten worden weergegeven Rempatronen van enkele zuivere antibacteriële stoffen in methanol/water (70/30) B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC B. cereus LMG ph 7,2 + µg/ml ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Tylosine ± ± Virginiamycine ± Oxytetracycline Avoparcine Penicilline Lincomycine Flavofosfolipol Salinomycine Bacitracine Monensin 5 ++/ Lasalocid 5 ++ / LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

23 Rempatronen van enkele monsterextracten met gekend gehalte antibacteriële stof B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC B. cereus LMG mg/kg ph 6 ph 8 ph 7,2 + TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Lincomycine / Flavofosfolipol Salinomycine Bacitracine 70 + ± / Monensin ± + +/ Avilamycine Tylosine Tetracycline Lasalocid Rempatronen van enkele gedopeerde voederextracten met gekend gehalte antibacteriële stof (op detectieniveau) B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC B. cereus LMG µg/ml ph 6 ph 8 ph 7,2 + TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Penicilline 0,01 + Bacitracine 0,6 + + Avoparcine 0,2 + Flavomycine 0,4 + + Lincomycine 0,3 + Tylosine 0,2 + Spiramycine 0,4 + Tetracycline 0,5 + + Sulfadimidine 0,3 + Virginiamycine 0,2 + LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

24 Samenvattend kan volgend overzicht opgesteld worden (opgenomen in IMETFLVVT058): Produkt of ~ klasse Virginiamycine Penicillines Macroliden Vb. Tylosine Lincomycine Spiramycine. Tetracyclines Avoparcine Salinomycine Monensin Flavomycine Sulfonamides Bacitracine Avilamycine Gevoeligste plaat ATCC 9341 ph 6 ATCC 9341 ph 8 B. subtilis BGA ph 6 B. subtilis BGA ph 8 en B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP ATCC Effect van sporenelementen (2002) Uit de literatuur blijkt dat sommige sporenelementen kunnen interfereren met de bepaling van antibacteriële activiteit, in die zin dat ze ook remzones op de verschillende platen zouden kunnen veroorzaken. Gezien sporenelementen in bepaalde concentraties inherent zijn aan bepaalde voeders werd volgende proef uitgevoerd om dit effect te kunnen inschatten. Gebaseerd op het maximaal toegelaten gehalte aan sporenelementen in volledig diervoeder of dagrantsoen (MB 12/2/99, update 2002) werd volgende proef opgezet. Van zinkchloride, kopersulfaat en mangaansulfaat werden oplossingen bereid met een concentratie van 1000 mg/l in methanol/water (70/30). Vervolgens werden deze oplossingen verder ½ serieel verdund tot een eindconcentratie van 31,25 mg/l. Voor ijzersulfaat bedroeg de hoogste concentratie 1500 mg/l en werd er verdund tot een concentratie van 125 mg/l. Voor de concentraties waarbij er remzones werden vastgesteld, werd de analyse een paar dagen later ter bevestiging herhaald. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

25 B. subtilis BGA ATCC B. cereus TCResistent ph 7,2 + mg/l ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Zink / , , Koper / ,5 31,2 5 Mangaan 100 gb gb gb gb gb gb 250 gb gb gb 125 gb gb gb 62,5 gb gb gb 31,2 5 gb gb gb Ijzer / Controle Tylosine Controle Tetracycline Solventblanco Blanco voeder gb: groeibevorderende zones LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

26 Samenvattend kan volgende tabel worden opgesteld: Maximum gehalte in volledig diervoeder of dagrantsoen volgens MB Plaat waarop remzone zichtbaar bij toegelaten gehaltes element Bemerkingen Totaal ijzer 1250 mg/kg B. subtilis BGA ph 6 Totaal koper 175 mg/kg Totaal mangaan 250 mg/kg groeibevorderende zones op B. subtilis BGA ph6 en ph8 en op B. cereus TC resistent Totaal zink 250 mg/kg ATCC Bij poging tot identificatie van een bepaald antibioticum kan deze tabel dienen als richtlijn bij de interpretatie van de analyseresultaten Temperatuur broedstoof tijdens incubatie (juni 2013, NM) Incubatie van de 5 platen gebeurt in de referentiemethode als volgt: de B. subtilis BGA platen worden gedurende 18 à 24 uur bij 30 C bebroed en de platen worden 18 à 24 uur bij 37 C bebroed. In methode IMETFLVVT058 worden de 7 platen bebroed bij een temperatuur van 37 C gedurende 18 à 24 uur. Dat de incubatietemperatuur geen invloed heeft op de uiteindelijke grootte van de remzones wordt aangetoond door 2 routinemonsters en 2 controlestandaarden toe te voegen aan alle platen en één reeks platen te bebroeden op 30 C en de andere reeks op 37 C. Een overzicht van de bekomen remzones is terug te vinden in onderstaande tabel. Remzones reële voederextracten en controlestandaarden na incubatie op 37 C en 30 C ATCC 9341 ATCC B. cereus LMG B. subtilis BGA Monster Temp. ph 7,2 + ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6, C C C C Controle TYL 37 C Controle TYL 30 C Controle TC 37 C 182 Controle TC 30 C 184 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

27 Interpretatie aan de hand van onderstaande tabel resulteert in een identieke beoordeling voor de remzones van de monsters voor de 2 incubatietemperaturen. remzone < 120 remzone remzone remzone remzone remzone remzone > 260 Remzones reële voederextracten en controlestandaarden na incubatie op 37 C en 30 C ATCC 9341 ATCC B. cereus LMG B. subtilis BGA Monster Temp. ph 7,2 + ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6, C C C + ± C + ± LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

28 4.3 CCβ (juni 2013) Definitie CCβ CCβ is de kleinste hoeveelheid van de stof die met een foutkans van β in een monster kan worden aangetoond en is gelijk aan de laagste concentratie waarbij een methode met een statistische zekerheid van 95 % kan aantonen dat een monster werkelijk verontreinigd is (in geval van niet toegelaten stoffen) Vergelijking MICs IMETFLVVT058 met referentiemethode Een overzicht van de minimale remmende concentraties (MICs) van enkele antibiotica en chemotherapeutica wordt gegeven in bijlage 1 van methode IMETFLVVT058. Uittreksel uit tabel van bijlage 1 van methode IMETFLVVT058: Antibiotica afgeleid van Type Molmassa (g/mol) Gevoeligste testorganisme ph MIC (µg/ml) Aminozuren Di Penicilline G 334,4/ ,01 Aminozuren Poly Bacitracine Virginiamycine 1422,7 525,6823, ,6 0,10,2 Aminoglucosiden Avoparcine Flavomycine Lincomycine ,5 B. subtilis BGA ,2 0,4 0,3 Macroliden Tylosine Spiramycine ,1/ ,2 0,4 Tetracyclines Tetracycline 444,4/444 B. subtilis BGA 6 0,5 Sulfamides Sulfadimidine B. subtilis BGA + TMP 7,2 0,3 In paragraaf van dit validatiedossier wordt voor enkele vaak voorkomende antibiotica nagegaan of deze MICs haalbaar zijn. De gevoeligste plaat (testorganisme) en MIC per antibioticum komen inderdaad overeen met deze vermeld in bijlage 1 van IMETFLVVT058. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

29 Rempatronen van enkele gedopeerde voederextracten met gekend gehalte antibacteriële stof (op detectieniveau) B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC B. cereus LMG ph 7,2 + ph 6 ph 8 µg/ml TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Avoparcine 0,2 + Bacitracine 0,6 + + Flavomycine 0,4 + + Lincomycine 0,3 + Penicilline G 0,01 + Spiramycine 0,4 + Sulfadimidine 0,3 + Tetracycline 0,5 + + Tylosine 0,2 + Virginiamycine 0, Detectielimieten IMETFLVVT058 Wanneer we vervolgens rekening houden met de verdunning van het monster volgens IMETFLVVT 058, bekomen we de onderstaande minimale detecteerbare concentraties voor enkele van de meest voorkomende antibiotica: MIC Concentratie aan antibioticum in te analyseren dierenvoeder (µg/ml) (mg/kg) Avoparcine 0,2 1 Bacitracine 0,6 3 Flavomycine 0,4 2 Lincomycine 0,3 1,5 Penicilline G 0,01 0,05 Spiramycine 0,4 2 Sulfadimidine 0,3 1,5 Tetracycline 0,5 2,5 Tylosine 0,2 1 Virginiamycine 0,2 1 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

30 5 Werking enzymen screening antibiotica (βlactamase en penicillinase) 5.1 Test werking enzymen (nov. 2013, AV) Penicillinasegevoelige penicillines en cephalopsporines kunnen aangetoond worden door aan het monsterextract in het ponsgaatje op plaat M.luteus ATCC 9341 ph 6 het enzyme lactamase of penicillinase (penase) toe te voegen. Indien er penicillines of cephalosporines aanwezig zijn zal de remzone beduidend kleiner worden of verdwijnen na toevoeging van lactamase (breed spectrum). Bij penicillines zal de remzone beduidend kleiner worden of verdwijnen na toevoeging van penase (specifiek), bij cephalosporines verdwijnen de remzones niet. Ter validatie van de werking van beide enzymen werden de volgende oplossingen geanalyseerd volgens methode IMETFLVVT058: Zinkbacitracine (2,4 µg/ml) 2. Zinkbacitracine + penase 3. Zinkbacitracine + βlactamase 4. Amoxicilline (2,0 µg/ml) 5. Amoxicilline + penase 6. Amoxicilline + βlactamase 7. Cephalexin (2,0 µg/ml) 8. Cephalexin + penase 9. Cephalexin + βlactamase 10. Penicilline G (2,0 µg/ml) 11. Penicilline G + penase 12. Penicilline G + βlactamase 13. Controlestd Tylosine (2,0 µg/ml) 14. Controlestd Tylosine + penase 15. Controlestd Tylosine + βlactamase 16. Controlestd Tetracycline (1,0 µg/ml) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

31 De 7 platen zagen er uit als volgt (zie bijlage voor grotere afbeeldingen): ML ph 6 ML ph 8 MFl ph 6,5 BGA ph6 BGA ph8 BGA ph 7,2 + TMP BC TCres LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

32 5.2 Interpretatie resultaten Stoffen die de celwand aantasten βlactamantibiotica Andere antibiotica Penicillines Cephalosporines Carbapenems Monobactams Amoxicilline Cephalexin Zinkbacitracine Penicilline G Tylosine Amoxicilline en penicilline G behoren tot de penicillinasegevoelige βlactamantibiotica en cephalexin tot de cephalosporines. Zinkbacitracine is een polypeptide antibioticum en behoort tot geen van beide groepen, tylosine behoort tot de groep van de macrolide antibiotica. Bekijken we de foto s van de platen ML ph6 en ML ph 8, dan is duidelijk te zien dat de remzones van de β lactamantibiotica verdwijnen na toevoeging van βlactamase, terwijl de remzones van zinkbacitracine en tylosine gelijkaardig blijven. Toevoeging van penase doet de remzones van amoxicilline en penicilline G volledig verdwijnen, terwijl de remzones van cephalexin vertroebelen, maar niet volledig verdwijnen (enkel zichtbaar met tegenlicht). De remzones van zinkbacitracine en tylosine blijven gelijkaardig na toevoeging van penase. Met behulp van het enzym βlactamase kan er bijgevolg een onderscheid gemaakt worden tussen de β lactamantibiotica en de andere antibiotica. Indien er ook dient bepaald te worden of het om een penicilline of cephalosporine antibioticum gaat, kan het enzym penase gebruikt worden. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

33 5.3 Overzicht grootte remzones met/zonder enzymen Nr. ML6 ML8 MFl BGA6 BGA8 TMP TC 1 BAC BAC + P BAC + B AMOX AMOX + P AMOX + B CEPH CEPH + P 9 CEPH + B 10 PEN G PEN G + P 12 PEN G + B 13 TYL TYL + P TYL + B TC µl stdoplossing +/ 100 µl βlactamase of penaseoplossing o BAC stockoplossing 595 µg/ml 0,2 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,4 µg/ml o AMOX stockoplossing 200 µg/ml 0,5 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,0 µg/ml o CEPH stockoplossing 200 µg/ml 0,5 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,0 µg/ml o PEN G stockoplossing 200 µg/ml 0,5 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,0 µg/ml o TYL o TC LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

34 5.4 Overzicht foto s 7 platen met/zonder enzymen Micrococcus luteus ATCC 9341 plaat ph 6 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

35 Micrococcus luteus ATCC 9341 plaat ph 8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

36 Micrococcus luteus ATCC plaat ph 6,5 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

37 Bacillus subtilis BGA plaat ph 6 Bacillus subtilis BGA plaat ph 8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

38 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

39 Bacillus subtilis BGA plaat ph 7,2 met trimethoprim LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40

40 Bacillus cereus TC resistent plaat ph 6,5 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /40