VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Transcriptie

1 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption Screening van GGO s (I-MET 038a) DNA-extractie RT-PCR Maïs-, soja-, rijst(producten) en papaya 19/11/2014 Overzicht van de prestatiekenmerken : DNA-extractie DNA-concentratie: van ieder extract wordt de DNA-concentratie bepaald en het criterium is gesteld op >10 µg/ml Zuiverheid van het DNA: van ieder extract wordt de zuiverheid van het DNA bepaald en deze moet tussen 1,6 en 2,0 gelegen zijn Inhibitie: op ieder extract wordt een inhibitietest uitgevoerd. In het extract mag er geen inhibitie zijn. Bij deze test moeten de extracten voldoen aan de volgende criteria: Helling van de regressierechte: tussen -0,9 en -1,1 (theoretische waarde : - 1,0), Correlatiefactor R² > 0,98 Het absolute verschil tussen de gemeten Ct van de werkoplossing en de geëxtrapoleerde Ct moet <0,5 Analyse van routinestalen geanalyseerd in ander labo: Voor parameters aanwezig in het monster >LOD: beide labo s: resultaat = Aanwezig Voor parameters afwezig in het monster: beide labo s: resultaat = Afwezig Parameters aanwezig rond LOD: resultaat van de beide labo s: resultaat = aanwezig of <LOD (afhankelijk van het startgewicht voor de extractie) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

2 Parameters <LOD: resultaat beide labo s: resultaat = < LOD of afwezig (afhankelijk van het startgewicht voor de extractie) Ringtesten: goede resultaten moeten bekomen worden bij het deelnemen aan een ringtest De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn voor de betreffende matrices/parameters: Geen inhibitie in de DNA-extracten Deelnemen aan een ringtest met het bekomen van goede resultaten. Historiek validatiedossier: Versie Herziening Reden Wijzigingen door / datum 1 KO/ Aanpassing dossier 2010, aanvulling met extra testen en uitbreiding naar matrices rijst(producten) en papaya Samenvoegen dossier en aanvullen met extra gegevens en foto s LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

3 Samenvatting validatiegegevens 1 Inleiding In het labo worden de volgende types matrices getest voor de aan- of afwezigheid van GGO s: maïs, soja, rijst en papaja. Op DNA-extracten van producten op basis van maïs, soja, rijst en papaya wordt met RT-PCR een screening uitgevoerd naar merkers die een aanwijzing kunnen zijn voor de aanwezigheid van GGO s, met name p35s, tnos, EPSPS, Cry1Ab alsook de plantenspecies plant (endogeen), maïs (endogeen), soja (endogeen), koolzaad(endogeen), rijst (endogeen) en papaya (endogeen). Voor de producten op basis van maïs en soja werd een beperkte bijkomende validatie uitgevoerd. De CTABmethode, gebruikt voor de DNA-extractie werd aangepast. De wasstappen met ethanol werden weggelaten en na de precipitatiestap werd er direct overgegaan naar de DNA-cleanup kit die reeds in het labo gebruikt werd. Voor de rijst(producten) en papaya (vruchten) werd een uitgebreide validatie uitgevoerd aangezien dit een nieuwe matrixgroep betreft. 2 Keuze van de methode 2.1 DNA - extractie De bestaande methode LAB 24 I-MET 038 GGO DNA-extractie is geschikt voor de extractie van DNA uit matrices van plantaardige oorsprong (in verkleinde toestand). 2.2 Screening GGO-merkers De bestaande methode LAB 24 I-MET 038a GGO Screening is geschikt voor de screening van DNA-extracten verkregen met de CTAB-extractiemethode. 2.3 Type validatie Secundaire validatie 3 Samenvatting validatiegegevens In eerste instantie wordt per matrix de validatie van de DNA-extractie besproken. Vervolgens de validatie van de verschillende screeningsmerkers. Als laatste worden per matrix de resultaten van ringtesten of routinemonsters onderzocht in het NRL besproken. 3.1 DNA-extractie (I-MET-FLVVM-038) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

4 Bij de validatie werden de volgende punten onder de loep genomen: DNA-concentratie: van ieder extract wordt de DNA-concentratie bepaald en het criterium is gesteld op >10 µg/ml Voor de bepaling van de DNA-concentratie werd de absorptie gemeten bij 260nm. Aan de hand van een standaardcurve (deze wordt maandelijks opgesteld aan de hand van verschillende concentraties kalfsthymus DNA). Zuiverheid van het DNA: van ieder extract wordt de zuiverheid van het DNA bepaald en deze moet tussen 1,6 en 2,0 gelegen zijn Voor de bepaling van de zuiverheid van het DNA worden van het extract de absorpties gemeten bij 260 en 280 nm. De DNA-zuiverheid is de verhouding tussen de absorptie bij 260 en 280 nm. Inhibitie: op ieder extract wordt een inhibitietest uitgevoerd. Deze wordt verder besproken in punt In iedere extract mag er geen inhibitie zijn. Bepaalde substanties aanwezig in het monster of in het extract kunnen de PCR-reactie inhiberen. Zij beïnvloeden de efficiëntie van de DNA-amplificatie door de werking van het DNA-polymerase of de enzymatische cofactoren te beïnvoeden. Bij de DNA-extractie moeten deze componenten geëlimineerd of sterk gereduceerd worden. De mate van inhibitie is afhankelijk van de concentratie aan inhibitoren. Wanneer het DNA verdund wordt, zal ook de concentratie aan inhibitoren verlagen en daarmee ook het inhiberend effect. Op dit principe is de test gebaseerd. Per monster en per analist werden vanuit de werkoplossing (10 µg/ml of onverdund) van twee extracten opeenvolgende verdunningen aangemaakt. De gebruikte verdunningen zijn 1/4, 1/8, 1/16 en 1/32 (een verdunningsfactor van 2). De onverdunde werkoplossing en de verdunningen werden in tweevoud op PCR-plaat gezet en een screeningstest voor de plantspeciesmerker (zoals maïs, soja, rijst of papaya) werd uitgevoerd. Om na te gaan of er inhibitoren aanwezig zijn in de extracten werden de gemiddelde Ct-waarden van de verdunde extracten in grafiek uitgezet ten opzichte van de 2 log (logaritme met basis 2) van de verdunningen en werd de lineaire regressierechte berekend. Vervolgens werd op basis van de regressierechte de Ct-waarde geëxtrapoleerd naar de onverdunde werkoplossing. Bij deze test moeten de extracten voldoen aan de volgende criteria: Helling van de regressierechte: tussen -0,9 en -1,1 (theoretische waarde : - 1,0), Correlatiefactor R² > 0,98 Het absolute verschil tussen de gemeten Ct van de werkoplossing en de geëxtrapoleerde Ct moet <0,5 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

5 A. Maïs(producten) en soja(producten) Voor de validatie van de DNA-extractie uit maïs- en sojaproducten werden de routinemonsters getest: : sojagrits : koeken : Bloem : Glutenarme voeding : Zetmeel : gevriesdroogde soep : Voedingssupplementen De monsters werden geanalyseerd door iedere analist. Er werd gewerkt met een startgewicht van 200mg monster. Validatieparameters: DNA-concentratie: het criterium is gesteld op >10 µg/ml Zuiverheid van het DNA: gelegen tussen 1,6 en 2,0 Inhibitie: geen inhibitie in het extract 3.1.A.1.1 DNA-concentratie en -zuiverheid Resultaten DNA-concentratie van maïs- en soja(producten) DNA-extracten monster Analist Epje DNA-concentratie DNA-zuiverheid (µg/ml) KO ,16 1, ,45 1, ,80 1,8 AVB ,51 1, ,11 1, ,18 1,7 MR ,61 1, ,74 1, ,51 1, KO ,9 1, ,5 1, ,7 1,5 AVB ,46 1, ,43 1,8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

6 ,53 1,8 MR ,24 1, ,54 1, ,67 1, KO ,77 1, ,85 1, ,92 1,8 AVB ,18 1, ,36 1, ,16 1,9 MR ,4 1, ,38 1, ,16 1, KO ,1 1, ,9 1, ,0 1,8 AVB ,5 1, ,7 1, ,9 1,6 MR ,8 1, ,8 1, ,2 1, KO ,4 1, ,6 1, ,2 2,0 AVB ,5 2, ,8 2, ,2 2,0 MR ,4 1, ,1 1, ,7 1, KO ,8 1, ,0 1, ,9 1,8 AVB ,8 1, ,7 1, ,8 1,8 MR ,8 1, ,9 1,8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

7 ,2 1, MR ,63 1, ,8 1, ,94 1,2 AVB ,09 1, ,27 1, ,48 1,5 Voor 84 % van de extracten werd er voldaan aan het criterium van de DNA-concentratie. Bij producten waarbij voor de bereiding verhittingsstappen doorlopen werden, kan een deel van het DNA afgebroken worden en kan erna extractie minder DNA aanwezig zijn in het extract. Voor 95% van de extracten werd er voldaan aan het criterium voor de DNA-zuiverheid ( ). 3.1.A.1.2 Inhibitie Op een aantal van de bovenvernoemde extracten werd een inhibitietest uitgevoerd. Resultaten inhibitietesten Monster Analist Regressierechte Absoluut verschil gemeten Ct en geëxtrapoleerde Ct werkoplossing KO y = -0,955x + 21,953 met R² = 0,999 0,17 AVB y = -1,0654x + 21,16 met R² = 0,9948 0,28 MR y = -0,941x + 22,219 met R² = 0,999 0, KO y = -0,9017x + 17,369 met R² = 0,994 0,42 AVB y = -1,095x + 19,61 met R² = 0,9992 0,29 MR y = -1,0563x + 18,1 met R² = 0,9928 0, KO y = -1,045x + 22,963 met R² = 0,9963 0,11 AVB y = -0,9787x + 23,002 met R² = 0,9985 0,28 MR y = -1,0025x + 23,247 met R² = 0,9998 0, KO y = -0,9663x + 23,455 met R² = 1 0,01 MR y = -0,9838x + 26,1 met R² = 0,9997 0,40 AVB y = -0,9938x + 23,993 met R² = 1 0, KO y = -0,92x + 21,758 met R² = 0,999 0,35 MR y = -0,9704x + 23,967 met R² = 0,9992 0,40 AVB y = -0,92x + 21,758 met R² = 0,999 0, KO y = -0,99x + 29,29 met R² = 0,9973 0,47 AVB y = -0,9496x + 19,348 met R² = 0,9949 0,45 MR y = -0,9067x + 19,681 met R² = 0,9851 0, MR y = -1,0933x + 23,429 met R² = 0,9995 0,16 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

8 In alle extracten werd voldaan aan de vooropgestelde criteria Helling van de regressierechte: gelegen tussen -0,9 en -1,1 Determinatiecoëfficient R²: > 0,98 Het absolute verschil tussen de gemeten Ct van de werkoplossing en de geëxtrapoleerde Ct bedraagt < 0, A.1.3 Besluit DNA-extractie maïs- en soja(producten) Uit bovenstaande validatietesten is dus gebleken dat de CTAB-extractiemethode vertrekkende van 200mg monster geschikt is voor maïs- en soja(producten). B. Rijst(producten) 3.1.B.1 DNA-extractie uit rijst Voor de validatie van de DNA-extractie uit rijst werden 4 types getest: Snelkookrijst Bruine rijst Langkorrel rijst Basmati rijst De vier monsters werden geanalyseerd door iedere analist. Er werd gewerkt met een startgewicht van 300mg gemalen rijst. Validatieparameters: DNA-concentratie: het criterium is gesteld op >10 µg/ml Zuiverheid van het DNA: gelegen tussen 1,6 en 2,0 Inhibitie: geen inhibitie in het extract LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

9 3.1.B.1.1 DNA-concentratie en -zuiverheid Resultaten DNA-concentratie van Rijst DNA-extracten Rijstmonster Analist Epje DNA-concentratie DNA-zuiverheid (µg/ml) 1 TVDS ,8 1, ,17 1, ,71 1,9 NDP ,28 1, ,66 1, ,31 1,8 MR ,19 2, ,06 1, ,68 1,9 2 TVDS ,88 1, ,93 1, ,83 1,8 NDP ,17 1, ,66 1, ,25 1,7 MR ,72 1, ,08 1, ,52 2,0 3 TVDS ,81 1, ,58 1, ,21 1,8 NDP ,98 1, ,32 1, ,21 2,0 MR ,54 2, ,79 2, ,37 2,1 4 TVDS ,53 1, ,46 1, ,27 1,8 NDP ,82 1, ,38 1, ,45 1,8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

10 MR ,86 1, ,64 1, ,95 1,7 Voor 97 % van de extracten werd er voldaan aan het criterium van de DNA-concentratie. Voor 97% van de extracten werd er voldaan aan het criterium voor de DNA-zuiverheid ( ). 3.1.B.1.2 Inhibitie Resultaten inhibitietesten Monster Analist Regressierechte Absoluut verschil gemeten Ct en geëxtrapoleerde Ct werkoplossing 1 TVDS y = -1,0461x + 21,744 met R² = 0,998 0,46 NDP y = -1,0692x + 23,108 met R² = 0,995 0,47 MR y = -1,0173x + 20,987 met R² = 0,992 0,47 2 TVDS y = -1,09x + 19,366 met R² = 0,998 0,42 NDP y = -1,05x + 19,753 met R² = 0,996 0,36 MR y = -1,0963x + 20,066 met R² = 0,995 0,33 3 TVDS y = -0,9375x + 22,564 met R² = 0,999 0,17 NDP y = -1,0982x + 22,778 met R² = 0,997 0,39 MR y = -1,0466x + 22,915 met R² = 0,992 0,35 4 TVDS y = -1,02x + 21,179 met R² = 0,998 0,30 NDP y = -1,0991x + 21,113 met R² = 0,999 0,46 MR y = -1,02x + 21,057 met R² = 0,996 0,42 In alle extracten werd voldaan aan de vooropgestelde criteria Helling van de regressierechte: gelegen tussen -0,9 en -1,1 Determinatiecoëfficient R²: > 0,98 Het absolute verschil tussen de gemeten Ct van de werkoplossing en de geëxtrapoleerde Ct bedraagt < 0, B.1.3 Besluit DNA-extractie op rijst Uit bovenstaande validatietesten is dus gebleken dat de CTAB-extractiemethode vertrekkende van 300mg monster geschikt is voor rijst. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

11 Er worden allerhande rijstproducten op de markt gebracht, zoals rijstnoedels, rijstpapier, rijstkoeken, rijstgriesmeel, rijstpap, In de validatie van DNA-extractie uit rijstproducten werden de volgende producten meegenomen: Rijstnoedels Rijstpapier Rijstkoeken 3.1.B.2 Validatie DNA-extractie uit rijstnoedels Op de vier types rijstnoedels werd door alle analisten een DNA-extractie uitgevoerd vertrekkende van 300 mg. Rice Noodles van het merk A (5mm) Rice Noodles van het merk B (2mm) Rice sticks van het merk C Rice sticks van het merk D 3.1.B.2.1 DNA-concentratie en -zuiverheid Resultaten DNA-concentratie van Rijstnoedels DNA-extracten Rijstnoedels monster Analist Epje DNA-concentratie (µg/ml) DNA-zuiverheid 1 MR ,60 2, ,90 2, ,20 2,0 TVDS ,92 2, ,47 2, ,92 2,0 NDP ,58 2, ,95 1, ,99 2,0 2 MR ,77 2, ,17 1, ,39 2,0 TVDS ,39 2, ,44 2, ,17 1,9 NDP ,16 1, ,99 2,0 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

12 ,08 2,0 3 MR ,30 2, ,02 2, ,49 2,0 TVDS ,04 1, ,16 1, ,08 1,9 NDP ,20 2, ,19 1, ,99 1,9 4 MR ,63 1, ,48 1, ,62 1,8 TVDS ,76 2, ,14 2, ,66 2,0 NDP ,45 2, ,37 2, ,27 2,0 Voor alle extracten was er voldaan aan het criterium voor de DNA-concentratie ( > 10µg/ml). Voor alle extracten was er voldaan aan het criterium voor de DNA-zuiverheid ( ). 3.1.B.2.2 Inhibitie Resultaten inhibitietesten Monster Analist Regressierechte Absoluut verschil gemeten Ct en geëxtrapoleerde Ct werkoplossing 1 TVDS y = -0,947x + 24,501 met R² = 0,997 0,04 NDP y = -0,914x + 22,817 met R² = 0,998 0,05 MR y = -0,95x + 23,969 met R² = 0,994 0,03 2 TVDS y = -0,9593x + 23,734 met R² = 0,985 0,09 NDP y = -0,9508x + 22,333 met R² = 0,992 0,02 MR y = -0,966x + 24,362 met R² = 0,987 0,19 3 TVDS y = -0,9357x + 23,332 met R² = 0,993 0,14 NDP y = -0,9528x + 21,8 met R² = 0,998 0,25 MR y = -0,9925x + 22,45 met R² = 0,989 0,38 4 TVDS y = -0,9904x + 23,968 met R² = 0,999 0,19 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

13 NDP y = -1,0168x + 22,195 met R² = 0,981 0,39 MR y = -0,9903x + 22,891 met R² = 0,997 0,25 Uit de resultaten van de inhibitietesten is gebleken dat er in de extracten geen inhibitie optrad tijdens de PCR-reactie. 3.1.B.2.3 Besluit DNA-extractie op rijstnoedels Uit bovenstaande validatietesten is dus gebleken dat de CTAB-extractiemethode vertrekkende van 300mg monster geschikt is voor rijstnoedels. 3.1.B.3 Validatie DNA-extractie uit rijstpapier en rijstkoeken Voor de matrix rijstpapier en rijstkoeken wordt er vertrokken van 1g monster voor de DNA-extractie. Dit protocol werd toegepast door de analisten op vier stalen rijstpapier en vier stalen rijstkoeken. Rijstpapier 1. Rijstpapier van het merk A (cirkelvormig) 2. Rijstpapier van het merk B (waaiervorm) 3. Rijstpapier van het merk C (vierkant) 4. Rijstpapier van het merk D Rijstkoeken 1. Rijstkoeken van het merk A 2. Rijstkoeken van het merk van B 3. Rijstkoeken (zonder zout) van het merk C 4. Rijstkoeken (met zout) van het merk D Aan de hand van deze testen zal er nagegaan worden of het criterium voor de DNA-concentratie en de DNAzuiverheid voor dit type stalen nog kan gesteld worden. Door de verschillende verwerkingsstappen die grondstoffen ondergaan tijdens het productieproces, kan een (groot) gedeelte of alle DNA afgebroken worden, zodat het in bepaalde producten moeilijk is, DNA van goede kwaliteit te extraheren. 3.1.B.3.1 DNA-concentratie en -zuiverheid Resultaten DNA-concentratie van Rijstpapier DNA-extracten Monster rijstpapier Analist Epje DNA-concentratie DNA-zuiverheid (µg/ml) 1 TVDS ,68 1,4 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

14 3519 5,38 1, ,40 1,4 NDP ,15 1, ,50 1, ,27 1,4 MR ,96 1, ,67 1, ,67 1,1 KO ,12 1, ,21 1, ,59 1,7 2 TVDS ,91 1, ,22 1, ,13 1,6 NDP ,61 1, ,33 1, ,72 1,8 MR ,82 1, ,18 1, ,20 1,7 KO ,27 1, ,01 1, ,99 1,7 3 TVDS ,20 1, / * / * ,85 1,1 NDP ,84 1, ,40 1, ,46 1,5 MR ,56 1, ,78 1, ,88 1,2 KO ,55 1, ,40 1, ,94 1,4 4 TVDS ,82 1, ,74 1, ,04 1,2 NDP ,58 1,2 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

15 3553 4,51 1, ,06 1,3 MR ,71 1, ,9 1, ,37 1,4 KO ,36 1, ,54 1, ,34 1,4 *Dit epje wordt niet in beschouwing genomen. Het supernatans werd bij epje 3524 toegevoegd. Voor 21 % van de extracten werd er voldaan aan het criterium van de DNA-concentratie. Voor 29% van de extracten werd er voldaan aan het criterium voor de DNA-zuiverheid ( ). Bij producten waarbij voor de bereiding verhittingsstappen doorlopen werden, kan een deel van het DNA afgebroken worden en kan erna extractie minder DNA aanwezig zijn in het extract. Resultaten DNA-concentratie van Rijstkoeken DNA-extracten Monster rijstkoeken Analist Epje DNA-concentratie DNA-zuiverheid(µg/ml) (µg/ml) 1 TVDS ,86 1, ,71 1, ,90 1,6 NDP ,31 1, ,22 1, ,84 1,2 MR ,67 1, ,68 1, ,11 1,2 KO ,37 1, ,39 1, ,51 1,2 2 TVDS ,15 1, ,37 1, ,65 1,6 NDP ,22 1, ,19 1, ,89 1,1 MR ,28 0, ,80 1, ,89 1,2 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

16 KO ,56 1, ,84 1, ,62 1,0 3 TVDS ,11 1, ,32 1, ,74 1,4 NDP ,22 1, ,42 1, ,27 1,3 MR ,56 1, ,55 1, ,79 1,2 KO ,84 2, ,54 1, ,07 1,2 4 TVDS ,93 1, ,42 1, ,41 1,4 NDP ,31 1, ,40 1, ,90 1,1 MR ,14 1, ,52 1, ,45 1,2 KO ,66 1, ,61 1, ,25 1,5 Voor 2 % van de extracten werd er voldaan aan het criterium van de DNA-concentratie. Voor 8% van de extracten werd er voldaan aan het criterium voor de DNA-zuiverheid ( ). Bij producten waarbij voor de bereiding verhittingsstappen doorlopen werden, kan een deel van het DNA afgebroken worden en kan erna extractie minder DNA aanwezig zijn in het extract. Uit deze gegevens blijkt dat het criterium voor de beide types van matrices niet kan gesteld worden. 3.1.B.3.2 Inhibitie Inhibitieresultaten Rijstpapier LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

17 Monster Analist Regressierechte Absoluut verschil gemeten Ct en geëxtrapoleerde Ct werkoplossing 1 TVDS y = -0,9734x + 32,05 met R² = 0,997 0,30 NDP y = -0,9115x + 30,631 met R² = 0,996 0,20 KO y = -0,9841x + 29,175 met R² = 0,998 0,21 2 TVDS y = -0,9067x + 31,591 met R² = 0,973 0,57 MR y = -0,9462x + 28,515 met R² = 0,981 0,10 NDP y = -1,0748x + 27,815 met R² = 0,980 0,44 KO y = -0,9423x + 29,619 met R² = 0,991 0,26 3 TVDS y = -0,9x + 32,43 met R² = 0,985 0,31 NDP y = -0,931x + 28,78 met R² = 0,991 0,01 KO y = -0,9032x + 30,455 met R² = 0,997 0,07 4 TVDS y = -1,0901x + 29,584 met R² = 0,990 0,45 MR y = -1,0233x + 27,087 met R² = 0,986 0,08 NDP y = -0,927x + 29,309 met R² = 0,995 0,12 KO y = -1,0108x + 28,059 met R² = 0,998 0,37 Slechts in 1 extract is er niet voldaan aan het criterium voor de determinatiecoëfficient en het absolute Ctverschil. Er dient wel opgemerkt dat de Ct-waarden van de verschillende verdunningen rond of boven LOD Ct liggen. Inhibitieresultaten Rijstkoeken Monster Analist Regressierechte Absoluut verschil gemeten Ct en geëxtrapoleerde Ct werkoplossing 1 TVDS y = -0,9058x + 29,386 met R² = 0,982 0,04 NDP y = -1,02x + 28,051 met R² = 0,989 0,30 MR y = -1,0435x + 26,86 met R² = 0,996 0,44 KO y = -0,991x + 26,585 met R² = 0,996 0,27 2 TVDS y = -0,9227x + 30,062 met R² = 0,992 0,31 MR y = -0,93x + 28,562 met R² = 0,995 0,37 NDP y = -1,0243x + 28,825 met R² = 0,991 0,44 3 TVDS y = -1,0118x + 30,347 met R² = 0,984 0,25 MR y = -0,9551x + 29,178 met R² = 0,985 0,19 NDP y = -0,9332x + 29,814 met R² = 0,997 0,11 KO y = -0,9864x + 29,153 met R² = 0,996 0,42 4 TVDS y = -0,9525x + 29,534 met R² = 0,995 0,11 MR y = -0,9897x + 26,488 met R² = 0,988 0,22 NDP y = -1,0417x + 28,103 met R² = 0,982 0,32 KO y = -0,9226x + 28,135 met R² = 0,986 0,25 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

18 In alle extracten is er voldaan aan de vooropgestelde criteria 3.1.B.3.3 Besluit DNA-extractie uit rijstpapier en rijstkoeken Uit de bovenstaande resultaten kan er besloten worden dat de voorgeschreven extractie methode geschikt is voor de DNA-extractie uit rijstpapier en rijstkoeken. Ondanks het feit dat de DNA-concentratie en de DNAzuiverheid niet beantwoordden aan het vooropgestelde criterium, toonden de inhibitietesten aan dat de extracten geschikt waren voor screeningstesten. Vertrekkende van 1g monster brengt de extractie iets meer DNA op dan wanneer men vertrekt van 200mg en is praktisch gezien handiger om uit te voeren. C. Papaya Voor de extractie van DNA uit papaya wordt er enkel gewerkt met de schil van de papaya, omdat uit dit deel meer DNA kan geêxtraheerd worden. Er wordt gestart met 500mg monster. DNA-concentratie en -zuiverheid Monsternummer Nummer epje Concentratie (ng/µl of µg/ml) Zuiverheid Abs 260nm/Abs 280nm Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

19 Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Papaya Voor 85 % van de extracten werd er voldaan aan het criterium van de DNA-concentratie. Voor 54% van de extracten werd er voldaan aan het criterium voor de DNA-zuiverheid ( ). De rijpheid van de papaya heeft een invloed op de DNA-opbrengst en de daarmee gepaard gaande zuiverheid. Hoe rijper de papaya, hoe meer vruchtvlees er meekomt met de schil bij het raspen. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

20 3.1.C.1 Inhibitie Inhibitieresultaten papaya Monster Regressierechte Absoluut verschil gemeten Ct en geëxtrapoleerde Ct werkoplossing Papaya 21 y = -0,9157x + 19,563 met R² = 0,991 0,24 Papaya 22 y = -0,9875x + 19,93 met R² = 0,981 0,27 Papaya 23 y = -0,911x + 19,879 met R² = 0,997 0,26 Papaya 24 y = -1,0684x + 19,585 met R² = 0,982 0,48 Papaya 25 y = -0,922x + 19,262 met R² = 0,991 0,07 Papaya 26 y = -0,9449x + 19,316 met R² = 0,983 0,08 Papaya 27 y = -0,9902x + 19,337 met R² = 0,996 0,36 Papaya 28 y = -0,9738x + 19,338 met R² = 0,984 0,47 Papaya 29 y = -0,9497x + 19,734 met R² = 0,997 0,28 Papaya 30 y = -0,978x + 19,219 met R² = 0,987 0,20 Papaya 31 y = -1,0048x + 18,72 met R² = 0,996 0,44 Papaya 32 y = -1,0689x + 18,717 met R² = 0,987 0,11 Papaya 33 y = -0,907x + 18,923 met R² = 0,994 0,21 Papaya 34 y = -0,9493x + 18,646 met R² = 0,984 0,15 Papaya 35 y = -0,971x + 18,539 met R² = 0,996 0,49 Papaya 36 y = -0,9626x + 18,593 met R² = 0,991 0,25 In alle extracten is er voldaan aan de vooropgestelde criteria. 3.1.C.2 Besluit DNA-extractie papaya Uit bovenstaande validatietesten is dus gebleken dat de CTAB-extractiemethode vertrekkende van 500mg monster geschikt is voor papaya. 3.2 Screening GGO merkers (I-MET-FLVVM-038) A. Bepaling van de LOD merkers plantspecies Voor de bepaling van de LOD van merkers voor plantenspecies werd er gewerkt met een extract van een CRM of voor rijst en papaya met een extract van rijst en papaya. Vanuit de werkoplossing (DNA-conc. 10 µg/ml) van deze extracten werden verschillende verdunningen aangemaakt en met PCR getest voor de LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

21 merker rijst. De volgende verdunningen werden aangemaakt: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32,1/64, 1/256 tot 1/16384 (afhankelijk van de DNA-concentratie in het species). Iedere verdunning werd 3 maal op PCR-plaat gezet en de hoogste verdunningen 10x. Om te controleren of het maken van de opeenvolgende verdunningen goed verlopen is, wordt de gemiddelde Ct-waarde per verdunning in een grafiek uitgezet ten opzichte van de 2 log van de verdunning en wordt hiervan de regressierechte berekend. Het aanmaken van de verdunningen is correct uitgevoerd als de helling van de regressierechte gelegen is tussen -0,9 en -1,1 en als de determinatiecoëfficient R 2 >0,98. De concentratie overeenstemmende met de hoogste verdunning waarbij de 10 resultaten positief zijn, wordt beschouwd als de LOD. De gemiddelde Ct van de 10 resultaten is Ct (LOD), welke gebruikt wordt bij het interpreteren van screeningsresultaten. Resultaten LOD plantenspecies Merker LOD Ct (LOD) Plant 0,02% 29 Maïs 0,01% 38 Soja 0,03% 34 Koolzaad 0,02% 37 Rijst 0,01% 38 Papaya 0,01% 34 B. Bepaling van de LOD GGO merkers Voor de bepaling van de LOD van screeningsmerkers p35s, tnos, EPSPS en Cry1Ab worden verdunningen gemaakt van een extract van een CRM. De verdunningen worden 10x op PCR-plaat gezet. De concentratie overeenstemmende met de hoogste verdunning waarbij de 10 resultaten positief zijn, wordt beschouwd als de LOD. De gemiddelde Ct van de 10 resultaten is Ct (LOD), welke gebruikt wordt bij het interpreteren van screeningsresultaten. Resultaten LOD GGO-merkers Merker LOD Ct (LOD) p35s 0,005% 34 tnos 0,01% 35 EPSPS 0,005% 35 Cry1Ab 0,005% 33 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

22 3.3 Analyse van ringtestmonsters of routinemonsters geanalyseerd door het NRL A. Maïs- en sojaproducten Er werd deelgenomen aan de ringtest FAPAS GeMMU20 bestaande uit drie stalen tarwebloem Er moest worden nagegaan of de tarwebloem gecontamineerd was met maïs en/of soja, alsook of de aanwezige soja of maïs GGO was of niet. Parameter GEMMU20A GEMMU20B GEMMU20C Soja Afwezig Aanwezig Afwezig Maïs Afwezig Afwezig Aanwezig p35s Afwezig Aanwezig Afwezig tnos Afwezig Aanwezig Afwezig EPSPS Afwezig Aanwezig Afwezig In het staal GEMMU20B werd RRSoja gedetecteerd bij een gehalte van 24,78% (er werd geen z-score berekend door de ringtestorganisator) De resultaten van het labo kwamen overeen met de resultaten van de ringtest. B. Rijst Aangezien er geen ringmonsters beschikbaar zijn voor dit type van matrix, werden routinestalen opgevraagd aan het NRL en onderzocht. Het labo ontving twee monsters onderzocht door het ILVO T&V: Een monster rijstmie met nummer ( ) Vier submonsters rijstcrackers met nummer ( ) Twee stalen onderzocht in FLVVM werden verstuurd naar CRA-W ( en ) Het labo ontving 7 monsters rijst(producten) en bijhorende extracten van het CRA-W: Twee monsters rijst: R1 en R7 Vijf monsters concentraat rijsteiwit: R2 R6 De verschillende monsters werden geëxtraheerd aan de hand van de methode beschreven in LAB 24 I- MET 038. Een screening werd uitgevoerd op de stalen voor de parameters plant, rijst, p35s, tnos en Cry1Ab. De eindresultaten van de beide labo s werden vergeleken. Criteria voor de vergelijking van de resultaten bekomen door de labo s: Voor parameters aanwezig in het monster >LOD: beide labo s: resultaat = Aanwezig Voor parameters afwezig in het monster: beide labo s: resultaat = Afwezig LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

23 Parameters aanwezig rond LOD: resultaat van de beide labo s: resultaat = aanwezig of <LOD (afhankelijk van het startgewicht voor de extractie) Parameters <LOD: resultaat beide labo s: resultaat = < LOD of afwezig (afhankelijk van het startgewicht voor de extractie) 3.3.B.1 Monsters en (monsters rijst) Tabel 116: Resultaten DNA-concentratie en zuiverheid van extracten rijst Monster Epje DNA-Concentratie (µg/ml) Zuiverheid (260/280) ,76 1, ,11 1, ,87 1, ,31 1, ,06 1, ,76 1,8 In de tabel is het duidelijk dat bij alle extracten de DNA-concentratie > 10 µg/ml. Ook voldoet de zuiverheid aan de vooropgestelde criteria (1,6 2,0). In Tabel 117 worden de screeningsresultaten weergegeven. Tabel 117: Screeningsresultaten FLVVM en CRA-W rijstmonsters Monster Labo Rijst p35s tnos Cry1Ab FLVVM Aanwezig / / <LOD CRA-W Aanwezig <LOD <LOD <LOD CRA-W Aanwezig / / <LOD extracten van FLVVM FLVVM Aanwezig / / <LOD CRA-W Aanwezig / <LOD <LOD CRA-W extracten van FLVVM Aanwezig / / <LOD De stalen werden naar het CRA-W gestuurd voor analyse. In beide monsters werd door het CRA-W naast Cry1Ab ook tnos teruggevonden onder LOD en in één monster p35s <LOD. Als extra test werden ook de extracten van het labo FLVVM naar het CRA-W gestuurd voor screening. Dezelfde resultaten werden bekomen als FLVVM. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

24 3.3.B.2 Monster Een deelmonster rijstmie werd door ILVO T&V naar het labo doorgestuurd. Dit monster werd genomen in het kader van het uitvoeringsbesluit 2011/884 inzake maatregelen met betrekking tot niet-toegelaten genetisch gemodificeerde rijst in rijstproducten van oorsprong uit China. In dit kader wordt er van het monster vier deelmonsters genomen van 125g (voor rijstproducten), ieder deelmonster wordt apart gemalen en per deelmonster worden er twee extracten gemaakt. De resultaten van het ILVO vermeld in de volgende tabellen zijn gebaseerd op screeningen uitgevoerd op de verschillende extracten met name 8. Aangezien het labo van het ILVO niet voldoende monster ontvangen had om 4 deelmonsters van 125g te bekomen, werd in het labo het monster na vermaling in drievoud geëxtraheerd volgens de methode beschreven in LAB 24 I-MET 038 vertrekkende van 300mg monster. Dit monster werd niet alleen door het ILVO T&V onderzocht. CRA-W heeft een tegenanalyse uitgevoerd voor dit staal. Deze resultaten zijn ook opgenomen in dit verslag. In onderstaande tabel worden de resultaten van de DNA-concentratie en de zuiverheid van de verschillende extracten gegeven. Resultaten DNA-concentratie en zuiverheid van extracten rijstmie Monster Epje DNA-Concentratie (µg/ml) Zuiverheid (260/280) Rijstmie ,50 2, ,06 2, ,36 2,0 In de tabel is duidelijk dat voor de drie extracten de DNA-concentratie >10µg/ml en de DNA-zuiverheid gelegen is tussen 1.6 en 2.0. In onderstaande worden de screeningsresultaten van de drie laboratoria weergegeven. Belangrijk is dat de resultaten van de screeningstesten geïnterpreteerd werden volgens het uitvoeringsbesluit 2011/884, waarin vermeld staat dat signalen met een Ct<40 als positief beschouwd worden. Screeningsresultaten FLVVM, ILVO T&V en CRA-W rijstmie Labo Rijst p35s tnos Cry FLVVM Aanwezig Afwezig Afwezig Aanwezig ILVO Aanwezig Aanwezig Aanwezig Afwezig CRA-W Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig De resultaten tonen aan dat de positieve signalen voor p35s en tnos van ILVO T&V niet konden bevestigd worden door de twee andere laboratoria FLVVM en CRA-W. Er dient opgemerkt dat er bij het ILVO voor p35s en tnos niet in alle extracten een signaal teruggevonden werd en dat deze zeer laag waren. In onze extracten werd Cry1Ab teruggevonden, echter bij een signaal rond LOD. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

25 3.3.B.3 Monster Het labo ontving vier submonsters rijstcrackers met het nummer van het ILVO T&V. Het is een monster genomen in het kader van het uitvoeringsbesluit 2011/884. Op de extracten werd een screening uitgevoerd naar plant, rijst, p35s, tnos en Cry1Ab. Resultaten DNA-concentratie en zuiverheid van extracten rijstcrackers Monster Epje DNA-Concentratie (µg/ml) Zuiverheid (260/280) Rijstcracker A ,71 1, ,83 1, ,83 1,4 Rijstcracker B ,65 1, ,51 1, ,63 1,5 Rijstcracker C ,84 1, ,52 1, ,04 0,7 Rijstcracker D ,12 1, ,39 1, ,69 0,8 In alle extracten is de DNA-concentratie < 10 µg/ml en daarmee gepaard gaand is de DNA-zuiverheid zeer laag. Op de extracten werd een screening uitgevoerd naar rijst, p35s, tnos en Cry1Ab. Screeningsresultaten FLVVM en ILVO T&V rijstcrackers Monster Labo Rijst p35s tnos Cry Rijstcracker FLVVM Aanwezig Aanwezig / Aanwezig A ILVO Aanwezig Aanwezig / Aanwezig Rijstcracker FLVVM Aanwezig Aanwezig / Aanwezig B ILVO Aanwezig Aanwezig / / Rijstcracker FLVVM Aanwezig Aanwezig / Aanwezig C ILVO Aanwezig Aanwezig / / Rijstcracker FLVVM Aanwezig Aanwezig / Aanwezig D ILVO Aanwezig Aanwezig / / LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

26 In de vier submonsters rijstcrackers werd door beide laboratoria de aanwezigheid van rijst en p35s gedecteerd. De parameter tnos was afwezig in de 4 submosnters. Voor Cry1Ab werden echter heel lage signalen teruggevonden door FLVVM. Het ILVO heeft enkel in 1 monster Cry1Ab teruggevonden. Belangrijk is dat het ILVO voor de extractie van DNA uit rijst en rijstproducten vertrekt van 100 mg monster i.p.v. 1g. Indien de parameter op een laag niveau in het monster aanwezig is, is de kans groter dat deze niet gedetecteerd wordt wanneer men vertrekt van een lagere monsterhoeveelheid. 3.3.B.4 Monsters R1 R7 Van het CRA-W heeft het labo 7 monsters rijst(producten) ontvangen. R1: rijst (gemalen) R2 R6: concentraat rijsteiwit R7: rijst (gemalen) R1 en R7 zijn twee verschillende rijstvarianten. Op de monsters werd in tweevoud een extractie uitgevoerd vertrekkende van 300 mg monster (R1 en R7) en vertrekkende 1g monster (R2 R6) (volgens de methode beschreven in LAB 24 I-MET 038). Op de extracten werd een screening uitgevoerd naar plant, rijst, p35s, tnos en Cry. Resultaten DNA-concentratie en zuiverheid van extracten rijstcrackers Monster Epje DNA-Concentratie (µg/ml) Zuiverheid (260/280) R ,98 1, ,74 1, ,81 1,7 R ,27 1, ,57 1, ,67 1,9 R ,53 1, ,01 1, ,73 1,9 R ,04 1, ,87 1, ,06 1,9 R ,97 1, ,77 1, ,87 1,8 R ,04 1,8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

27 ,19 1, ,03 1,7 R ,68 1, ,49 1, ,83 1,7 In de tabel is het duidelijk dat bij alle extracten de DNA-concentratie > 10 µg/ml. Ook voldoet de zuiverheid aan de vooropgestelde criteria (1,6 2,0). Naast de eigen extracten werden ook extracten van het CRA-W getest voor de verschillende parameters. Screeningsresultaten FLVVM en CRA-W rijstmonsters Monster Labo Rijst p35s tnos Cry FLVVM Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig FLVVM Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig R1 (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig FLVVM Aanwezig <LOD Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Afwezig <LOD Aanwezig R2 (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Afwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig <LOD Aanwezig R3 (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig <LOD Aanwezig R4 (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig R5 (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig R6 FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

28 R7 (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Aanwezig Aanwezig Aanwezig FLVVM Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig FLVVM Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig (extracten van CRA-W) CRA-W Aanwezig Afwezig Afwezig Afwezig Het labo bekwam dezelfde resultaten voor de screening naar de verschillende parameters in de eigen extracten en de extracten van CRA-W. Bij 3 monsters echter werd tnos in de eigen extracten teruggevonden op een niveau van LOD en in de CRA extracten < LOD. Het CRA heeft voor deze parameter Aanwezig als resultaat. Bij verder onderzoek bleek dat voor deze parameters de Ct-waarden in dezelfde rangorde gelegen waren voor de beide labo s. In 1 monster werd de parameter p35s in eigen extract teruggevonden < LOD en in het extract van CRA-W was de parameter afwezig. Ook het CRA zelf heeft als Afwezig. De DNA-concentratie van de extracten van het CRA-W werd gemeten voor de uitvoering van de PCR-test en deze waren lager dan 10µg/ml en dus lager dan de concentraties bekomen in de eigen DNA-extracten. Voor de DNA-extractie vertrok het CRA van 200mg monster i.p.v. 1g voor de monsters R2 R6. Alle parameters die aanwezig zijn in de monsters op een niveau boven LOD worden in alle extracten teruggevonden door het labo en vertonen dezelfde resultaten als het CRA-W. 3.3.B.5 Besluit Uit bovenstaande testen is gebleken dat het labo vergelijkbare resultaten vindt voor parameters met een Ct boven LOD. Bij signalen onder LOD kan er dus een grotere variatie optreden tussen verschillende analyses en kunnen verschillende resultaten bekomen worden. C. Papaya Het CRA-W heeft ons volgende papaya-monsters bezorgd: P1: verse papaya P2: poeder van papaya Naast de oorspronkelijke monsters bezorgde het CRA-W ons ook de extracten van P1 en P2. DNA-concentratie en zuiverheid Monster Epje DNA-Concentratie (µg/ml) P ,04 1,6 Zuiverheid (260/280) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

29 ,19 1,7 P ,81 1, ,94 1, ,89 1,5 Voor het monster P1 werd in de beide extracten een DNA-opbrengst bekomen > 10µg/ml, met een DNAzuiverheid tussen 1.6 en 2.0. Voor P2 was de opbrengst < 10µg/ml en de DNA-zuiverheid een beetje lager dan 1.6. Er werd een screening uitgevoerd op de extracten van de monsters P1 en P2 (zowel de extracten bekomen in het FLVVM als de extracten afkomstig van het CRA-W) voor papaya, p35s en tnos. Screeningsresultaten Monster P1 P2 Labo Screeningsparameter Extractie door Screening door Papaya p35s tnos FLVVM FLVVM Aanwezig <LOD <LOD CRA-W CRA-W Aanwezig Afwezig Afwezig CRA-W FLVVM Aanwezig Afwezig Afwezig FLVVM FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig CRA-W CRA-W Aanwezig Aanwezig Aanwezig CRA-W FLVVM Aanwezig Aanwezig Aanwezig Het FLVVM en het CRA bekomen vergelijkbare resultaten voor de analyse van de twee papaya-monsters. Het monster P1 geeft na extractie in het FLVVM wel signalen waarvan de Ct-waarden onder de LOD liggen, voor p35s en tnos. Dit is vermoedelijk te wijten aan de hogere DNA-opbrengst bij extractie in het FLVVM. In monster P2 worden papaya, p35s en tnos door beide labo s aangetoond. 3.4 Algemeen besluit Uit bovenstaande resultaten kan besloten worden dat de geteste extractiemethoden voor de verschillende matrices geschikt zijn voor routinematig gebruik in het labo, met name CTAB-methode vertrekkende van 200mg monster voor maïs- en sojaproducteb, 300mg monster voor rijst en rijstnoedels, 1g monster voor rijstproducten zoals rijstkoeken en rijstpapier en 500mg voor papaya. Ook al werd niet altijd een DNAconcentratie bekomen van 10µg/ml, de inhibitietesten toonden aan dat in de extracten geen inhibitie optrad en dat deze geschikt zijn voor het uitvoeren van de screeningstesten. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

30 De vergelijkende testen van routinemonsters vertoonden vergelijkbare resultaten tussen de twee labo s (FLVVM en NRL) bij resultaten boven LOD. Signalen onder LOD vertoonden wat variatie tussen de verschillende labo s (ten gevolge van verschillend startgewicht bij extractie en testen onder LOD niveau). 4 Foto s DNA-extractie Screening met RT-PCR LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31

31 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /31