GGO: SCREENING. Versie 06 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVM LAB 24 I-MET-038a GGO: SCREENING Versie 06 Datum van toepassing Opgesteld door : Kristien Orye, sectieverantwoordelijke GGO, Nazicht door : Natasja De Pauw, medewerker sectie GGO, Goedkeuring vrijgave door : Tony Vanhove, labmanager FLVVM a.i., Beheer & locatie geldende versie : FLVVM, Server FLVVM Bestemmelingen : Medewerkers Sectie Biologische analyses : GGO Trefwoorden : Screening, GGO LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 1/16

2 OVERZICHT WIJZIGINGEN (*) Herziening Reden van de herziening Tekstdeel/draag-wijdte door/datum * van de herziening IDV 12/07/2010 TVDS 21/11/2011 RM 18/07/2012 KO 04/10/2012 KO 08/10/2013 KO 21/11/2013 KO 13/01/2014 KO 05/03/2014 Wijzigen product- en referentienummers door invoering nieuwe module solventbeheer Algemene herziening Aanpassen kwaliteitsverantwoordelijke Nieuwe layout Nieuwe lay-out Aanpassen referenties Bijvoegen screeningparameters rijst en Cry en LODwaarden Toevoegen gegevens literatuur papaya-primers Toevoegen/ correctie LOD Ct papaya/ rijst Wijziging locatie templates screening Toevoegen matrix papaya Wijziging criteria DNA-concentratie en DNAzuiverheid voor selectie van de 2 epjes voor screening Toevoegen interpretatie screeningsresultaten bij rijstmonsters genomen in het kader van IEC 223 en IEC389 Wijzigen opstarten PCR Toevoegen/wijzigen verwijzingen documenten (+plaats) Wijzigen positieve controle rijst en toevoegen positieve controle papaya Toevoegen criteria DNA-extract voor positieve controle koolzaad, rijst en papaya, Toevoegen uitvoering inhibitietest Toevoegen 2 e lijnscontrole Volledige tekst werd aangepast. volledige tekst Overal Overal Aanvullen beoordeling van resultaten 12.2 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 2/16

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA Producten Oplossingen Referenties VERBRUIKSMATERIALEN GEBRUIKSGOEDEREN TOESTELLEN WERKWIJZE VOORBEREIDING - ALGEMEEN VOORBEREIDING BEPALEN PLAATSCHEMA, VERDUNNINGEN EN MIX UITVOERING AFWERKING KWALITEITSCONTROLE E LIJNSCONTROLE E LIJNSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERLOOP UITVOERING RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN PROCEDURES/INSTRUCTIES FORMULIEREN DOCUMENTEN LIJSTEN LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 3/16

4 1 Doel Dit werkvoorschrift beschrijft de werkwijze voor de screening van DNA-oplossingen van plantaardig materiaal op - de aanwezigheid van plantaardig materiaal, - de aanwezigheid van bepaalde plantentaxa, - de aanwezigheid van sommige merkers voor genetische modificatie met real-time PCR. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de screening van DNA-extracten verkregen met de CTABextractiemethode. De screening gebeurt met real-time PCR met als indicator de kleurstof SybrGreen I. Voor elk van de gezochte kenmerken wordt een specifiek primerpaar gebruikt (zie 3). Beperking: de screening spoort alleen genetische modificaties op met de promotor p35s en/of de terminator tnos en/of de merker EPSPS en/of de merker Cry1Ab. 3 Wettelijke en normatieve documenten - ISO 21569:2005 Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Qualitative nucleic acid based methods (algemeen). - ISO 21570:2005 Foodstuffs Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products Quantitative nucleic acid based methods + bijlagen. - Primers: plant: WRb: WIV patent, soja: WLe: WIV patent, maïs: WZm: WIV patent, rijst: WOr: WIV patent, koolzaad: WBn: WIV patent, p35s: Wp35: WIV patent, tnos: WNos: WIV patent, EPSPS: ISO 21570, Cry1Ab: WCry1Ab: WIV patent. Papaya: Pap: Literatuur: Detection of genetically modified papaya with PCR, Bavarian Health and Food Safety Authority, Germany. 4 Definities en afkortingen Definities/afkorting PCR real-time PCR dsdna ssdna Verklaring Polymerase Chain Reaction, een PCR-reactie waarbij het verloop van de reactie continu gevolgd wordt, dubbelstrengig DNA, enkelstrengig DNA, LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 4/16

5 primer amplicon Tm epje PC NC CRM korte sequentie ssdna die zich bindt aan het begin of einde van de gezochte sequentie, het gevormde DNA tijdens de PCR-reactie, meer bepaald de gezochte sequentie, smelttemperatuur van een amplicon, eppendorfbuisje positieve controle negatieve controle gecertificeerd referentiemateriaal 5 Principe PCR is een analysetechniek waarbij geselecteerde DNA-fragmenten vermenigvuldigd worden zodat de concentratie ervan hoog genoeg wordt voor detectie. De uitvoering van PCR voor de screening bestaat uit de volgende stappen: - denaturatie ( smelten ) van dsdna tot ssdna door verwarming, - afkoelen van het ssdna waarbij korte specifieke sequenties (primers) zich kunnen binden aan hun complementaire plaatsen op het ssdna en zo korte fragmenten dsdna vormen, - verlengen van de dubbelstrengige primer/dna-fragmenten door het enzym Taq- Polymerase met vorming van een nieuwe dubbelstrengige DNA-sequentie. Hierbij kunnen intercalerende kleurstoffen zich binden met dsdna waarbij die dan fluoresceren bij belichting, - herhalen van de vorige drie stappen. Er worden twee primers gebruikt (de forward en reverse primer) die samen een bepaalde DNA-sequentie afbakenen. Na een aantal cycli gebeurt vooral vermenigvuldiging van de sequentie tussen de twee primers waardoor bij elke cyclus het aantal van deze sequenties verdubbelt. Deze exponentiële vermenigvuldiging leidt er toe dat zelfs een gering aantal originele kopijen van een sequentie kan aangroeien tot een meetbare concentratie. De detectie bij real-time PCR gebeurt aan de hand van meting van fluorescentie: bij het gebruik van de intercalerende fluorescerende kleurstof SybrGreen I treedt er alleen fluorescentie op bij binding van de kleurstof met dsdna. De fluorescentie is een maat van de hoeveelheid aanwezige dsdna. Deze reactie is niet-specifiek en reversibel: bij smelten van het dsdna tot ssdna verdwijnt de fluorescentie om bij afkoelen terug te verschijnen. De belangrijkste aspecten van real-time PCR voor screening zijn: - de gebruikte primers: die bepalen welke DNA-sequentie opgespoord wordt, - het aantal cycli dat herhaald wordt. 6 Prestatiekenmerken De vooropgestelde LOD bedraagt 1/20 van de wettelijke limiet (0,9%) of 0,045%. De LOD (bepaald op de referentieconcentratie DNA = 10 ng/µl van zuiver parameter DNA (100%)) voor de verschillende parameters is: LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 5/16

6 - plant: 0,03%, Ct=27 - soja: 0,03%, Ct=34 - maïs: 0,03%, Ct=35 - koolzaad: 0,03%, Ct=36 - rijst: 0,03%, Ct=34 - papaya: 0,03%, Ct=31 - genetische modificatie (p35s en/of tnos en/of EPSPS): 0,03%, Ct=35 - genetische modificatie (Cry1Ab): 0,03%, Ct=34 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen Voor veiligheidsmaatregelen en bijzondere voorzorgsmaatregelen: zie LAB 24 P 005 I 011 PCR : algemene instructies voor uitvoering. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Producten - Bleekwater, - DNA away, - Sybr Fastmix, - primers voor plant, soja, maïs, koolzaad, rijst, papaya, p35s, tnos, Cry1Ab en EPSPS (LAB 24 I-MET 038a L 001 Primers screening GGO) Oplossingen - DNAse/RNAsevrij steriel water OPLOS 107, - verdund bleekwater 1:6 OPLOS 116, - primers OPLOS Referenties - Maïs Bt11, - Soja RR. 8.2 Verbruiksmaterialen - epjes van 1,5 ml, - gele containers voor biologisch afval, - handschoenen, - PCR-buisje van 10 ml, - pipettips van 1-20 µl, µl en μl met filters, - PCR-plaat GGO, - afdekstrips PCR-plaat. LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 6/16

7 8.3 Gebruiksgoederen - Aandrukplaat voor afsluitstrips, - aandrukrol voor aandrukken plaat in thermocycler, - bekers voor afval, - bewaardozen voor epjes, - houder voor microtiterplaat, - koelblok voor epjes, - regelbare pipetten van 2-20 µl, µl en μl, - rekjes voor epjes. 9 Toestellen - Microcentrifuge, - PCR workbench, - thermocycler, - vortexmixer - Plaatcentrifuge 10 Werkwijze Alle stappen van de screening worden uitgevoerd in lokaal Voorbereiding - algemeen - Bewaar de koelblokken in de diepvriezer, - open de PCR-workbench om hem op te starten, - decontamineer de werktafel, de pipetten, de vortex en de microcentrifuge, - decontamineer het werkblad van de PCR workbench,de pipetten, de vortex en de microcentrifuge, - vul 2 bekers met verdund bleekwater (werktafel + workbench) Voorbereiding bepalen plaatschema, verdunningen en mix Zoek de te analyseren parameters op volgens de technische fiche van het monster in LAB 24 I-MET 038a F 001 Analyses screening GGO. Selecteer aan de hand van de te bepalen parameters en het aantal monsters het gewenste plaatschema onder de folder M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO. Voor (ring)monsters wordt de screening uitgevoerd op 2 van de 3 DNA-extracten van het monster en elk extract in duplo. De richtlijnen voor de extracten zijn: opbrengst >10 µg/ml, een zuiverheid tussen 1,6 2,0 en voor de troebeling een positieve waarde (LAB 24 I-MET 038 GGO : DNA-extractie). Voor de screening worden 2 epjes meegenomen. Voorkeur gaat naar de epjes waarvan de DNA-concentratie en de DNA-zuiverheid voldoen aan de hierboven vermelde richtlijnen. LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 7/16

8 Indien de concentratie van de verschillende extracten kleiner is dan 10 μg/ml, dan wordt het extract onverdund gebruikt: de screening wordt wel uitgevoerd. Indien de zuiverheid en/of de troebeling niet voldoen voor de verschillende extracten wordt de screening uitgevoerd op deze extracten. Mogelijke inhibitie wordt altijd gecontroleerd met de inhibitietest. Open de gewenste template en sla deze op onder de folder M:\Berekeningen\GGO\ Resultaten\Jaartal\Maand als JJJJMMDD_SG_ monsternummer(s)_matrix.xlsx. - Open de tab Plaatschema en vervolledig door de blanco s en de monsternummers met de bijbehorende nummers van de epjes in te vullen. o Druk de plaatlayout af. o Vul naam en datum in. - Open de tab DNAVerdunning voor het berekenen van de verdunningen van de gebruikte DNA-extracten. o Vul de identificatie van de controles in de linkertabel en van de monsters in de rechtertabel in, o de overeenstemmende concentraties van de controles en monsters worden overgenomen van de werkbladen afkomstig van de spectrofotometer (INVAPP398, C:\Jasco Data\DNA concentratie\werkblad\jjjj\mm: DNA concentratie_datum.ufwd) en LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM s GGO (M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO). OPMERKING: indien de concentratie van het monster kleiner is dan 10 μg/ml, dan wordt het extract onverdund gebruikt en wordt onverdund ingevuld als concentratie. o In de tabel worden de volumes (μl) DNA-extract en water berekend die moeten gemengd worden om het gewenste volume met de gewenste concentratie te krijgen (standaard: 10 ng/µl). o Druk dit blad af. o Vul naam en datum in. - Open de tab SYBGREEN met de berekende volumes voor het aanmaken van de mix. o In de tabellen zijn de volumes (μl) Sybr Fastmix, forward en reverse primer en water berekend voor elke benodigde primercombinatie. o Druk dit blad af. - Sla het rekenblad op. Is het niet mogelijk om een voorgeprogrammeerde template te gebruiken, open dan LAB 24 I- MET 038a F 002 Template SG algemeen en sla deze op onder de folder M:\Berekeningen\GGO\Resultaten\Jaartal\Maand als JJJJMMDD_SG_ monsternummer(s)_matrix.xlsx. - Open de tab Plaatschema. o Vul alle gegevens voor de rijen en de kolommen in (primers, blanco s, monsters, controles, ). o Druk de plaatlayout af. o Vul naam en datum in. - Open de tab DNAVerdunning voor het berekenen van de verdunningen van de DNAextracten. Vul in: o de gewenste eindconcentratie in ng/µl (standaard: 10 ng/µl), o het benodigde volume (aantal te vullen wells met het monster x 5 µl/well + benodigd volume voor eventuele verdunningen µl om verliezen te compenseren); per volume een nieuwe tabel gebruiken, LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 8/16

9 o o de identificatie van de monsters / controles, (1 tabel per gewenst volume), de overeenstemmende concentraties van de controles en monsters worden overgenomen van de werkbladen afkomstig van de spectrofotometer (INVAPP398, C:\Jasco Data\DNA concentratie\werkblad\jjjj\mm: DNA concentratie_datum.ufwd) en LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM s GGO (M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO). OPMERKING: indien de concentratie van het monster kleiner is dan 10 μg/ml, dan wordt het extract onverdund gebruikt en wordt onverdund ingevuld als concentratie. o In de tabel worden de volumes (μl) DNA-extract en water berekend die moeten gemengd worden om het gewenste volume met de gewenste concentratie te krijgen. o Druk dit blad af. o Vul naam en datum in. - Open de tab SYBGREEN voor het berekenen van de volumes voor het aanmaken van de mix. o Vul het totaal aantal wells in (aantal te vullen wells met de mix +1-2 om verliezen te compenseren). Per aantal een nieuwe tabel gebruiken en de primer boven de tabel noteren. o In de tabellen worden de volumes (μl ) Master Mix, forward en reverse primer en water berekend voor elke benodigde primercombinatie. o Druk dit blad af. - Sla het rekenblad op Uitvoering - Verdunnen van het DNA-extract (uitvoeren op de voorziene tafel naast de PCRworkbench): o neem de nodige DNA-extracten (ook extractieblanco en controles), o pipetteer in een epje van 1.5 ml volgens de tabel DNAVerdunning (10.2) de vereiste hoeveelheden DNAse/RNAsevrij steriel water en DNA-extract. Vortex en centrifugeer kort. (2x). Bewaar de verdunningen en de blanco s in de koelblok tot het pipetteren van de plaat en plaats de originele extracten terug in de diepvries. - Maken van de mix (uitvoeren in de PCR-workbench): o bepaal de totale hoeveelheid Sybr Fastmix die nodig is op basis van de tabel SYBRGREEN en neem het vereiste aantal buisjes Sybr Fastmix uit de diepvriezer. Laat ontdooien. o Neem voor elke primer (forward en reverse) een epje (evt. reserve) uit de diepvriezer en laat ontdooien, o vul een epje met DNAse/RNAsevrij steriel water, o maak voor elke primercombinatie een mix door de berekende volumes uit de tabel in een epje te pipetteren. Er worden dus evenveel mixen klaargemaakt als er primercombinaties zijn, o vortex en centrifugeer kort af (2x). o Plaats de resten van de Sybr Fastmix en de primers terug in de diepvriezer. - Verdelen van de mix over de microtiterplaat (uitvoeren in de PCR-workbench): o plaats de microtiterplaat, met well A1 linksboven, in de houder, LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 9/16

10 o pipetteer voor elke primercombinatie 20 μl van de mix in de wells volgens het plaatschema. - Verdelen van de DNA-extracten / blanco s / controles over de microtiterplaat (uitvoeren op de tafel naast de PCR workbench): o pipetteer 5 μl (verdund) extract / blanco / controles in de wells volgens het plaatschema. - Sluit de gebruikte kolommen van de plaat af met afdekstrips: o niet gebruikte kolommen mogen open blijven, o druk de strips goed aan met de aandrukplaat (rij per rij en kolom per kolom). - Centrifugeer de plaat gedurende 1 min. bij 4000 rpm in de plaatcentrifuge - Start de PC en de thermocycler op: o Wanneer de self-test van de thermocycler goed verlopen is, dubbelklikken op het ikoon BioRad CFX Manager IDE: username: GGO, paswoord: niets invoeren, enter. o Plaats de plaat in de thermocycler en druk die vast met de aandrukrol, let op de oriëntatie: well A1 = linksboven. o View / Startup Wizard of klik op het ikoontje User-Defined Run Setup o Klik op User-Defined Run Setup o Tab 1: Protocol: Select existing: M:\Berekeningen\GGO\protocols PCR GGO_ProtocolSybrgreen_ WIV_05.prcl/ next o Tab 2: Plate: M:\Berekeningen\GGO\ protocols PCR Quick Plate_96 wells_sybr Only.pltd/ next, o Tab 3: Start Run: indien protocol en plate OK: Start Run rechts onder en opslaan onder de folder M:\Berekeningen\GGO\Ruwe data in het mapje van de huidige maand; indien NOK, tab 1 en/of 2 eerst corrigeren. - Verwijder de bekers met afval (in de gele bak voor biologisch afval), decontamineer de werktafel, het werkblad van de PCR-workbench en de pipetten. - Sluit de PCR workbench Afwerking Na afloop van de analyse de plaat uit de thermocycler verwijderen en in een plastic zakje in de gele bak voor biologisch afval leggen. EEN PLAAT NA PCR-ANALYSE NOOIT OPENEN! 11 Kwaliteitscontrole e lijnscontrole Voor de kwaliteitscontrole worden per plaat de volgende controles meegenomen: - Positieve controle van soja en/of maïs en/of koolzaad en/of rijst en/of papaya (afhankelijk van de technische fiche van het/de monster(s)). Voor soja en maïs zijn de positieve LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 10/16

11 controles twee CRM s. CRM soja bevat genetisch gemodificeerde soja en is positief voor plant, soja, p35s, tnos en EPSPS. CRM maïs bevat genetische gemodificeerde maïs en is positief voor plant, maïs, p35s, tnos en Cry1Ab. Voor koolzaad wordt als positieve controle een DNA-extract van koolzaad gebruikt, waarvan de DNA-concentratie >10 µg/ml en de DNA-zuiverheid gelegen is tussen 1.6 en 2.0. Voor rijst wordt als positieve controle een DNA-extract van rijst gespiked met de maïs CRM s Bt11 en MON810 gebruikt (300mg rijst + 100mg 2% Bt mg 2% MON810, geëxtraheerd volgens LAB 24 I-MET 038) Voor papaya wordt als positieve controle een DNA-extract van papaya gespiked met de maïs CRM Bt11 gebruikt (500mg papaya + 100mg 1% Bt11, geëxtraheerd volgens LAB 24 I-MET 038) Koolzaad is positief voor de parameters plant en koolzaad. Positieve controle rijst is positief voor de parameters plant, rijst, p35s, tnos en Cry. Positieve controle papaya is positief voor de parameters plant, papaya, p35s en tnos. - Negatieve controle: een monster plantaardig materiaal dat geen soja, maïs, koolzaad, papaya of rijst bevat en niet genetisch gemodificeerd is en dus alleen een positieve reactie geeft op de parameter plant. - een of meer extractieblanco s: epjes die de volledige extractieprocedure doorlopen hebben, maar waarbij het monster vervangen werd door water, - van elk te onderzoeken monster worden 2 DNA-extracten (2 epjes) elk in duplo ingezet voor screening, - van elk monster wordt een 10-voudige verdunning in duplo ingezet als controle op inhibitie. De criteria voor de controlemonsters zijn: - PC soja moet positief zijn voor plant, soja, p35s, tnos en EPSPS - PC maïs moet positief zijn voor plant, maïs, p35s, tnos, en bij rijstmonsters ook voor Cry1Ab, - PC koolzaad moet positief zijn voor plant en koolzaad, - PC rijst moet positief zijn voor plant en rijst, p35s, tnos en Cry1Ab, - PC papaya moet positief zijn voor plant, papaya, p35s en tnos, - NC mag alleen positief zijn voor plant, - de blanco s (extractieblanco) moeten negatief zijn op alle parameters (Ct plant > 27), - inhibitietest: Ct-verschil > 2,5. Indien aan een of meerdere van deze voorwaarden niet is voldaan, dan moet de oorzaak gezocht worden en kunnen bv. een of meer van de volgende acties ondernomen worden: - herhalen van de analyse (extractie en/of screening), - herhalen van de analyse met een andere CRM als PC, - bij positieve blanco s: bevestigen en indien bevestigd (= contaminatie) de DNA-extractie herhalen, - indien alle resultaten negatief: probleem opsporen en oplossen. Indien het Ct-verschil voor de inhibitietest <2,5, moet een uitgebreide inhibitietest ingezet worden van de extracten: LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 11/16

12 - Maak van ieder extract vanuit de werkoplossing (10 µg/ml of onverdund) de volgende verdunningen 1/4, 1/8, 1/16 en 1/32. - Zet iedere verdunning in tweevoud op PCR-plaat en screen voor de verschillende merkers getest in de eerste analyse. - Bereken nadien de gemiddelde Ct-waarden (van het geteste species) van de verdunde extracten en zet deze uit in grafiek ten opzichte van de 2log (logaritme met basis 2) van de verdunningen - Bereken de lineaire regressierechte. - De rechte moet voldoen aan de volgende criteria: o Helling van de regressierechte: tussen -0,9 en -1,1 (theoretische waarde : -1,0), o Correlatiefactor R² > 0,98 - Indien niet voldaan is aan de vooropgestelde criteria, wordt een nieuwe regressierechte opgemaakt waarbij de eerste verdunning (de laagste) buiten beschouwing genomen werd. (Er wordt verondersteld dat er nog inhibitie is in die verdunning). Indien er echter wel voldaan is aan de voorwaarden, kan verondersteld worden dat er geen inhibitie meer is in de eerste verdunning. - De screeningsresultaten van de laagste verdunning waarin geen inhibitie wordt waargenomen worden vervolgens beoordeeld (zie punt 12) e lijnscontrole Aangezien er voor de matrix rijst en papaya geen ringanalyses beschikbaar zijn, wordt een tweedelijnscontrole voorzien voor deze matrix. Maandelijks wordt door de sectieverantwoordelijke een monster voorbereid (met of zonder spiking) dat als routinemonster meegenomen wordt in een analysereeks. 12 Berekening en rapportering 12.1 Verloop De berekening van de resultaten omvat de volgende stappen: - bepalen van de Ct s, - selectie van positieve wells aan de hand van de smeltcurves, - evalueren van de Ct s (controles, blanco s, monsters), - interpreteren van het resultaat Uitvoering - Open het rekenblad (10.2) en kopieer het plaatschema van Plaatschema naar Evaluatie. - Open de file met de ruwe data (M:\Berekeningen\GGO\Ruwe data). o Linksboven worden de reactiecurves van alle wells getoond; ga na of het verloop van de curves de typische uitgerokken S-vorm vertoont. Zo niet dan kan dit wijzen op een probleem. o Vink het vakje Log Scale aan. De grafiek wordt nu getoond met een logaritmische schaal voor de Y-as. De curves vertonen nu een lineair deel. LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 12/16

13 o o o o o Horizontaal loopt er in de grafiek een lijn door het lineair deel van de curves; deze lijn bepaalt de threshold, de drempelwaarde die gebruikt wordt om het nummer van de cyclus te bepalen waar de curve die threshold overschrijdt. Deze lijn wordt vastgelegd door de software, maar kan eventueel manueel verschoven worden. Rechtsonder wordt een tabel getoond met als meest linkse kolom de identificatie van de well en de meest rechtse kolom de Ct-waarde, de cyclus (de X-waarde) waarbij de curve de threshold snijdt. Linksonder staat de plaatlayout: van de blauwe wells is de Ct terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbovenhoek van de plaat (blauw wordt grijs) en selecteer kolom 1 (enter op 1 en grijs wordt blauw). Controleer de vorm van de curves en kopieer de Ct s in kolom 1 van de plaatlayout Overzicht alle resultaten op het rekenblad. Selecteer kolom 2 (enter op 1 en blauw wordt opnieuw grijs en enter op 2 en grijs wordt blauw), controleer de vorm van de curves en kopieer de Ct s in kolom 2 van het rekenblad. Herhaal dit voor alle gebruikte kolommen. Wijkt de vorm van de curve af, noteer dit dan in de kolom opmerkingen in het rekenblad. Vergelijk de Ct waarden van de wells die negatief moeten zijn met die van de positieve controles. De positieve controles moeten een duidelijk lagere Ct hebben dan de negatieve wells. Ga na of de Ct van de monsters significant kleiner is dan de waarden voor de negatieve wells. Zo niet, dan is het monster negatief voor die parameter. Ga na of de wells een signaal bevatten dat afkomstig kan zijn van het amplicon dat kenmerkend is voor de betreffende parameter. Dit gebeurt als volgt: klik op de tab Melt Curve. De grafieken met de smeltcurves (links boven) en hun afgeleide (rechts boven) worden getoond, horizontaal loopt er een lijn door de afgeleiden. Trek deze lijn eventueel naar beneden om ook het smeltpunt van de kleinere pieken te zien. Linksonder staat de plaatlayout: van de blauwe wells is het smeltpunt terug te vinden in de tabel ernaast. Klik in de linkerbovenhoek van de plaat (blauw wordt grijs) en selecteer de positieve controle van primer 1 (enter op de well en grijs wordt blauw). Beoordeel nu alle andere wells voor dezelfde primercombinatie/parameter door ze 1 voor 1 aan te klikken en na te gaan of ze een piek vertonen met een maximum bij dezelfde temperatuur als de positieve controle (T m plant: 76,5-77,5 C; T m soja: 81,0-81,5 C, T m maïs: 76,5 C, T m koolzaad: 79,5-80,0 C, T m Rijst: 76,5-77,0 C, T m p35s: 76,5-77,0 C, T m tnos: 72,0-72,5 C, T m EPSPS: 76,0-76,5 C, T m Cry1Ab: 78,5-80,5 C, T m Pap: 78,0-78,5 C). Indien er geen corresponderende piek aanwezig is, is het monster voor die parameter negatief en klik je de well weer weg. Kopieer in het rekenblad de tabel Overzicht alle resultaten naar Overzicht resultaten na selectie op basis van de T m en verwijder in deze laatste tabel de Ct waarden van de negatieve monsters. LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 13/16

14 - Beoordeel de resultaten: Per monster wordt ieder well voor iedere parameter eerst apart bekeken: o indien bij een monster bij een well voor een parameter (plant, soja, maïs, koolzaad, rijst, papaya, p35s, tnos, EPSPS of Cry1Ab) in de smeltcurve geen piek aangetroffen wordt waarvan de smelttemperatuur T m overeenstemt met die van de positieve controle (zie hoger), dan is het resultaat voor die parameter Parameter X afwezig in die well negatief. o Indien bij een monster bij een well voor een parameter (plant, soja, maïs, koolzaad, rijst, papaya, p35s, tnos, EPSPS of Cry1Ab) in de smeltcurve een duidelijke piek aangetroffen wordt waarvan de smelttemperatuur Tm overeenstemt met die van de positieve controle (zie hoger), dan is het resultaat voor die parameter Parameter X aanwezig in die well positief. Voor de beoordeling van een parameter van een monster worden de resultaten van alle wells samen bekeken: o Indien bij het monster 3 of 4 van de 4 wells negatief zijn voor een parameter, dan is het monster negatief voor die parameter. Noteer op het formulier LAB 24 I- MET 038a F 002 bij Conclusie naast de parameter Afwezig. o Indien bij het monster 3 of 4 van de 4 wells positief zijn voor een parameter, dan is het monster positief voor die parameter. Hou bij de beoordeling rekening met de LOD van de parameter: Indien de gemiddelde Ct voor deze parameter < Ct (LOD): noteer op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002 bij Conclusie naast de parameter Aanwezig, Indien de gemiddelde Ct voor deze parameter > Ct (LOD): noteer op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002 bij Conclusie naast de parameter <LOD alsook de gemiddelde Ct-waarde. o Indien bij het monster van het ene extract de beide wells positief zijn voor de parameter en voor het andere extract de beide wells negatief zijn voor de parameter, worden volgende gevallen onderscheiden: Indien de Ct-waarden van de positieve wells > Ct (LOD): noteer op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002 bij Conclusie naast de parameter: <LOD, Indien de Ct-waarden van de positieve wells < Ct (LOD): voer dan een heranalyse (screening) uit waarbij het derde extract van het monster meegenomen wordt. Noteer dit op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002, bij opmerkingen. o Indien bij het monster van ieder extract 1 well positief is voor de parameter, worden volgende gevallen onderscheiden: Indien de Ct-waarden van de positieve wells > Ct (LOD): noteer op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002 bij Conclusie naast de parameter: <LOD, Indien de Ct-waarden van de positieve wells < Ct (LOD): voer een heranalyse (screening) uit en noteer dit op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002, bij opmerkingen, Voor een rijstmonster genomen volgens de technische fiches IEC 223 en IEC 389 wordt in beide gevallen de screening herhaald (er wordt geen rekening gehouden met de LOD). Noteer dit op het formulier LAB 24 I-MET 038a F 002, bij opmerkingen. LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 14/16

15 Indien bij een monster voor de parameters p35s en/of tnos en/of EPSPS en/of Cry1Ab in de smeltcurve een duidelijke piek aangetroffen wordt met dezelfde T m als de positieve controle (zie hoger), dan bestaat het vermoeden dat dit monster positief is voor genetische modificatie. Bij Ct < 35 (34 voor Cry1Ab) (= LOD 0,03%) moet de aanwezigheid van modificatie bevestigd worden (LAB 24 I-MET 038b GGO : bevestiging). Bij rijst en papaya wordt er geen verdere bevestiging uitgevoerd aangezien het niet-geautoriseerde GGO s betreft en deze enkel getest worden door het NRL mits akkoord van het hoofdbestuur van DG Laboratoria Rapportering Vul de resultaten in de LIMS in als aangetoond of niet aangetoond, aangevuld met een eventuele opmerking. Op het beproevingsverslag komen de volgende vermeldingen: - indien niet aangetoond ingevuld wordt: de aanwezigheid is niet aangetoond in concentraties boven LOD, - indien aangetoond ingevuld wordt: de aanwezigheid is aangetoond in concentratie boven LOD, - eventuele opmerkingen. Indien de DNA-concentratie van het monster 10 µg/ml is: - aangetoond boven referentie LOD: aangetoond, - aangetoond onder referentie LOD: niet aangetoond en opmerking parameter gedetecteerd in concentraties < LOD, - niet aangetoond: niet aangetoond. Indien de DNA-concentratie van het monster < 10 µg/ml: - aangetoond boven referentie LOD: aangetoond, - aangetoond onder referentie LOD: niet aangetoond en opmerking parameter gedetecteerd in concentraties < LOD, - niet aangetoond: niet aangetoond en opmerking DNA-concentratie na extractie te laag voor de bepaling van GGO screening elementen. Opmerking: Voor monsters genomen in het kader van de technische fiches IEC 223 en IEC 389 (monsters Chinese rijst en rijstproducten genomen in het kader van het uitvoeringsbesluit 884/2011) wordt voor de interpretatie van de resultaten geen rekening gehouden met de LOD van de parameters p35s, tnos en Cry1Ab. Zoals vermeld in LAB 24 I-MET 38 worden vier submonsters genomen van het ontvangen monster, worden per submonster twee extracten op PCR gezet. Indien bij een van de extracten voor de bovengenoemde merkers een signaal geregistreerd wordt met een Ct<40, wordt voor deze parameter als resultaat aangetoond ingevuld. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten 13.1 Procedures/Instructies LAB 24 P 005 I 011 PCR Algemene instructies voor uitvoering LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 15/16

16 LAB 24 I-MET 038 GGO: DNA-extractie LAB 24 I-MET 038b GGO: bevestiging 13.2 Formulieren LAB 24 I-MET 038 F 002 Verloop DNA-extractie LAB 24 I-MET 038 F 005 Werklijst GGO LAB 24 I-MET 038a F 002 Template SG algemeen Templates screening (M:\QAM-EMAS-OHSAS\DOC-QSE\LAB 24 I-MET\I-MET 038 GGO) LAB 24 I-MET 038a F001 Analyses screening GGO 13.3 Documenten LAB 24 I-MET 038 D 001 Analyseschema DNA-extractie GGO 13.4 Lijsten LAB 24 I-MET 038a L 001 Primers screening GGO LAB 24 I-MET 038 L 001 Overzichtslijst CRM s GGO LAB 24 I-MET 038a GGO Screening - v.06 16/16