BEPALING VAN FLAVOFOSFOLIPOL IN DIERENVOEDERS (AGARDIFFUSIE)

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-049 I-MET-FLVVT-049 BEPALING VAN FLAVOFOSFOLIPOL IN DIERENVOEDERS (AGARDIFFUSIE) Versie 05 Datum van toepassing Opgesteld door : Mieke Vanbrabant, Sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Laboratoriummanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Toevoegingsmiddelen LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 1/13

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draagwijdte van de herziening V. Cloet, 06/2007 Opsteller van initiële versie Volledige tekst QAM, 12/2008 M. Vanbrabant, 08/2012 M. Vanbrabant, 12/2012 M. Vanbrabant, 03/2013 M. Vanbrabant, 06/2014 Nummering FoodLIMS geen wijziging versie Blz Update documentbeheer Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 02. Opmerkingen tijdens interne audit N 2012/12 (B2) + algemene update Volledige tekst Punt 7 en Punt volledige tekst Opmerkingen tijdens externe BELAC audit Volledige tekst 12/ algemene update Omwille van de omvang van de wijzigingen, wordt de tekst door gebruik van markering van wijzigingen niet meer bruikbaar. Vandaar is besloten om de markering van wijzigingen weg te laten in versie 04. Opmerking tijdens externe BELAC audit 01/2014 (ACT-14XTV-0038) van toepassing voor methode Punt * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 2/13

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN Standaarden Micro-organisme Voedingsbodem TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE WERKWIJZE EXTRACTIE Concentraten, voormengsels en mineraalmengsels Overige dierenvoeders Verdunning van het monsterextract ENTEN VAN DE VOEDINGSBODEM KLAARMAKEN VAN DE PLATEN INCUBATIE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 3/13

4 1 Doel Kwantitatieve bepaling van flavofosfolipol in dierenvoeders en concentraten. 2 Toepassingsgebied De methode is geschikt voor de controle van versleping en de dosering van flavofosfolipol in gemedicineerde diervoeders en premixen. De rapporteringsgrens van de methode bedraagt 1 mg/kg. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Overzicht van de belangrijkste afwijkingen ten opzichte van de referentiemethode: Overenting van de stam Bereiding van de entsuspensie Aangepaste glazen chromatografiekolom Voor lage gehaltes wordt 0,15 ml extract per ponsgaatje toegevoegd Incubatie gedurende uur bij C Aflezing met behulp van vergrotingsapparatuur en digitale schuifpasser Dataverwerking via softwareprogramma 4 Definities en afkortingen Term Definitie 5 Principe Een monster wordt geëxtraheerd met 50% methanol en indien nodig wordt het extract opgezuiverd met behulp van een anionenwisselaar. LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 4/13

5 De antibiotische activiteit wordt bepaald door het meten van de diffusie (inhibitie- of remmingszones) van flavofosfolipol in een agarvoedingsbodem geënt met Staphyloccocus aureus (ATCC 6538 P). De diameters van de bekomen remmingszones zijn rechtevenredig met het logaritme van de antibioticumconcentratie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaarheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel gevaarlijke stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Richtlijnen in verband met werken in het microbiologisch labo worden beschreven in LAB 25-I 15 HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO. De risicoklasse waartoe de gebruikte stam behoort, is terug te vinden in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Alle reagentia dienen van pro analyse -kwaliteit te zijn of van hogere kwaliteit indien vermeld. Reagentia Labonr Water, gedemineraliseerd (demi) R Natriumchloride (NaCl) R Kaliumchloride (KCl) R L-ascorbinezuur R Methanol, HPLC-kwaliteit (CH 3 OH) R0183 LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 5/13

6 8.1.6 Citroenzuur (C 6 H 8 O 7 ) R Tris(hydroxymethyl)aminomethaan p.a. R Natriumhydroxide pellets (NaOH) R Natriumhydroxide (NaOH) 1N: los 40 g NaOH pellets (R0206) op in 1 l H 2 O W Citroenzuuroplossing 0,5 M: Voeg 105 g citroenzuur (R0673) toe aan 1000 ml water (R1004) in een maatkolf van 1000 ml. Leng aan tot de maatstreep en meng. W Anionenwisselaar: Dowex 1x2, mesh, Cl-vorm (Serva catalogus nr ) of gelijkwaardig Voor het gebruik het product 12 tot 14 uur in 80% methanol (R0183) bewaren R0685 W Steriele fysiologische zoutoplossing (0,85%) (m/v): Los 8,5 g natriumchloride (R0200) op in water (R1004) en verdun tot W ml en autoclaveer Methanol 50% (v/v): Meng 500 ml methanol (R0183) met 500 ml water (R1004) W Methanol 80% (v/v): Meng 800 ml methanol (R0183) met 200 ml water (R1004) W Kaliumchloride-oplossing 1,5%: Los 1,5 g kaliumchloride (R0718) op in 20 ml water (R1004) en leng W0901 aan tot 100 ml met methanol (R0183) Entsuspensie Staphylococcus aureus (ATCC 6538 P) W Oxoid Antibiotic Medium nr. 1 (CM0327) of gelijkwaardig R Siliconen-antischuim-emulsie Rhodorsyl R Hulpstoffen Standaarden Flavofosfolipol standaardstof met gegarandeerde zuiverheid (S0115) Flavofosfolipol standaard stockoplossing, 100 µg/ml (W0133) Weeg, rekening houdend met de zuiverheid, X mg flavofosfolipol (S0115) tot op 0,1 mg nauwkeurig af in een maatkolf van 100 ml en registreer de afgewogen hoeveelheid X op LAB 25-F 04 ANTIBIOTICA REGISTRATIE STOCKSTANDAARDOPLOSSING. Los op in 50% methanol (W0162) en leng vervolgens aan tot de maatstreep zodat de concentratie 100 µg/ml bedraagt. Deze oplossing is 2 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C. LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 6/13

7 Flavofosfolipol standaard werkoplossing, 0,5 μg/ml Pipetteer 0,5 ml van de standaard stockoplossing (W0133) in een maatkolf van 100 ml. Leng aan tot de maatstreep met 50% methanol (W0162) en meng. Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse en komt overeen met standaardoplossing S 8 voor gehaltes hoger dan 20 mg/kg. Door opeenvolgende verdunningen met 50% methanol (W0162) worden de volgende standaardoplossingen bereid voor voeders met een gehalte hoger dan of gelijk aan 20 mg/kg (dierenvoeders, concentraten, voormengsels en mineraalmengsels): S 8 0,5 µg/ml (onverdund) S 4 S 2 S 1 0,25 µg/ml 0,125 µg/ml 0,0625 µg/ml Flavofosfolipol standaard werkoplossing, 0,1 μg/ml Voor dierenvoeders met een gehalte lager dan 20 mg/kg: pipetteer 2 ml van de standaard werkoplossing (0,5 µg/ml) in een maatkolf van 10 ml en leng aan tot de maatstreep met 50% methanol (W0162). Deze werkoplossing wordt bereid op de dag van de analyse en komt overeen met standaardoplossing S 8 voor gehaltes lager dan 20 mg/kg. Door opeenvolgende verdunningen met 50% methanol (W0162) worden de volgende standaardoplossingen bereid voor voeders met een gehalte lager dan 20 mg/kg S 8 0,1 µg/ml (onverdund) S 4 S 2 S 1 0,05 µg/ml 0,025 µg/ml 0,0125 µg/ml Algemene richtlijnen met betrekking tot aanmaak en beheer van standaarden worden weergegeven in LAB 25-D 40 ANTIBIOTICA OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN en LAB 25-I 19 BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN Micro-organisme Staphyloccocus aureus (ATCC 6538 P), risicoklasse 2 (M0108) LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 7/13

8 Algemene richtlijnen met betrekking tot de overenting en het gebruik van stamculturen worden weergegeven in LAB 25-L 23 LIJSTEN ANTIBIOTICA Bewaren van de stam Staphyloccocus aureus wordt geënt in een buis met schuin gestolde agarvoedingsbodem ( ). Na 24 uur incubatie bij 30 ± 2 C wordt deze cultuur in de koelkast bewaard bij een temperatuur van 4 ± 4 C en maandelijks overgeënt Bereiding van de entsuspensie (W0212) Een vers bereide cultuur van op schuin gestolde agarvoedingsbodem ( ) wordt gesuspendeerd in 5 à 10 ml steriele fysiologische zoutoplossing (W0115). Deze entsuspensie is 1 maand houdbaar bij een temperatuur van 4 ± 4 C Voedingsbodem In de handel verkrijgbare kant-en-klare voedingsbodems van gelijke of nagenoeg gelijke samenstelling, mogen worden gebruikt mits ze dezelfde resultaten geven. Tenzij anders vermeld worden oplossingen van NaOH (1N) en HCl (1N) gebruikt om de ph op punt te stellen Voedingsbodem voor het bewaren van de stam Pepton uit vlees Trypton Gistextract Vleesextract Glucose Agar Water 6,0 g 4,0 g 3,0 g 1,5 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml Breng op ph 6,5 ± 0,1 na autoclaveren (20 minuten bij 121 ± 1 C). Laat de buizen voor het bewaren van de stam schuin stollen. Kant-en-klaar alternatief: Oxoid Antibiotic Medium 1 (CM 327) (R0072) Voedingsbodem voor de bepaling Voedingsbodem ( ) met toevoeging van 0,5 g siliconen-antischuim-emulsie. Indien blijkt dat de inhibitiezones scherper zijn zonder de antischuim-emulsie, kan dit weggelaten worden. LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 8/13

9 Kant-en-klaar alternatief voor antischuim-emulsie: SE 2 van Wacker Chemie GmbH, München of Rhodorsyl (R0551). 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Glazen chromatografiekolom, binnendiameter 10 mm, lengte 35 cm, met een kraan aan de onderzijde Terugvloeikoeler met slijpstuk 10 Werkwijze De af te wegen hoeveelheid en de uit te voeren verdunningen variëren naargelang het verwachte gehalte. De relatie gehalte - af te wegen hoeveelheid verdunning(en) wordt weergegeven in LAB 25-D 41 ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN Extractie Het op ph brengen van het extract gebeurt door toevoeging van Tris (R0281). Indien nodig kan het extract aangezuurd worden met citroenzuur (R0673). Wanneer er gecentrifugeerd wordt, gebeurt dit default 10 minuten bij 3500 rpm Concentraten, voormengsels en mineraalmengsels Weeg een hoeveelheid monster (2,0-10,0 g ± 0,1 g) af in een erlenmeyer van 250 ml en voeg eerst ongeveer 150 mg ascorbinezuur (R0778) en vervolgens 100 ml 50% methanol (W0162) toe en meng Breng op ph 8,1-8,2 met ca. 400 mg Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (R0281) en controleer met behulp van ph-indicatorpapier (ph 6,6-8,1) of een ph-meter Wacht 15 minuten en breng de ph opnieuw op 8,1-8,2 met Tris LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 9/13

10 Kook gedurende 10 minuten onder voortdurend roeren onder een terugvloeikoeler Laat afkoelen, centrifugeer en decanteer Overige dierenvoeders Zonder opzuivering (voor gehalten groter dan 20 mg/kg) Weeg een hoeveelheid monster (5,0-40,0 g ± 0,1 g) af zodanig dat deze tenminste 30 µg flavofosfolipol bevat Meng deze hoeveelheid in een erlenmeyer met 100 tot 200 ml 50% methanol (W0162) Breng op ph 8,1-8,2 met ca. 400 mg Tris (R0281) en controleer met phindicatorpapier (ph 6,6-8,1) of een ph-meter Wacht 15 minuten en breng de ph opnieuw op 8,1-8,2 met Tris Kook gedurende 10 minuten onder voortdurend roeren onder een terugvloeikoeler Laat afkoelen, centrifugeer en decanteer Verdun met 50% methanol (W0162) zodat: U 8 U 4 U 2 U 1 0,5 µg/ml 0,25 µg/ml 0,125 µg/ml 0,0625 µg/ml Met opzuivering (voor gehalten kleiner dan 20 mg/kg) Weeg een hoeveelheid monster (20,0-40,0 g ± 0,1 g) af en voeg 100 tot 200 ml methanol 50% (W0162) toe Breng op ph 8,1-8,2 met ca. 400 mg Tris (R0281) en controleer met phindicatorpapier (ph 6,6-8,1) of een ph-meter Wacht 15 minuten en breng de ph opnieuw op 8,1-8,2 met Tris Kook gedurende 10 minuten onder voortdurend roeren onder een terugvloeikoeler Laat afkoelen, centrifugeer en decanteer Kook de suspensie gedurende 15 minuten Laat afkoelen en centrifugeer Meng een gedeelte van het extract met methanol 100% (R0183), zoals aangegeven in LAB 25-D 41 ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN. Bewaar deze oplossing afgesloten overnacht in de diepvries. o Vul een chromatografiekolom met 5 ml anionenwisselaar (W0902) o Was de kolom vervolgens met 100 ml methanol 80% (W0900). Laat de kolom NOOIT droog worden LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 10/13

11 o Breng een gedeelte van het extract equivalent met 16 µg flavomycine op de bereide kolom, volgens LAB 25-D 41 ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN en verwijder de doorgelopen vloeistof o Was de kolom met 50 ml 80% methanol (W0900) en verwijder de doorgelopen vloeistof o Flavofosfolipol wordt geëlueerd met 100 ml KCl/methanol-oplossing (W0901) met een doorloopsnelheid van ca. 2 ml/minuut o Collecteer exact 100 ml van het eluaat o Meng 5 ml van dit eluaat met 3 ml water (R1004). Deze oplossing bevat 0,1 µg flavomycine/ml (= U 8 ) Verdunning van het monsterextract Bereid onmiddellijk de volgende monsteroplossingen met onderstaande verwachte gehalten door opeenvolgende 1 op 1 verdunningen met 50% methanol (W0162): U 8 0,1 µg/ml (onverdund) U 4 U 2 U 1 0,05 µg/ml 0,025 µg/ml 0,0125 µg/ml 10.2 Enten van de voedingsbodem De voedingsbodem voor de bepaling ( ) wordt bij ongeveer 50 C met entsuspensie ( ) geënt als volgt: 0,1 ml entsuspensie (W0212) per 100 ml voedingsbodem. Indien de remmingszones na incubatie niet optimaal zijn, wordt de hoeveelheid toegevoegde entsuspensie aangepast volgens LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA Klaarmaken van de platen De agardiffusie gebeurt in platen waarop de vier standaardconcentraties (S 8, S 4, S 2 en S 1 ) en de vier extractenconcentraties (U 8, U 4, U 2 en U 1 ) elk 2 maal voorkomen. Elke plaat moet beslist alle vier concentraties van standaard en extract bevatten. Daarom moet de afmeting van de platen zo gekozen worden dat men in de agarvoedingsbodem tenminste 8 gaatjes kan ponsen van 13 mm diameter, waarvan de middelpunten niet minder dan 30 mm van elkaar verwijderd zijn. In dit geval worden 2 platen met 16 ponsgaatjes gebruikt, dus 32 remmingszones in totaal als grondslag voor de berekening (elke standaard- en monsterconcentratie in viervoud). LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 11/13

12 Giet in de platen een hoeveelheid geënte voedingsbodem (10.2), zodat een laagdikte van ca. 2 mm bekomen wordt Laat de voedingsbodem stollen en pons er de gaatjes in met het ponstoestel Voor gehalten 20 mg/kg: Pipetteer exact 100 µl van de 4 standaard- en extractoplossingen in de ponsgaatjes van beide platen volgens onderstaand schema: Voor gehalten < 20 mg/kg: Pipetteer exact 150 µl van de 4 standaard- en extractoplossingen in de ponsgaatjes van beide platen volgens onderstaand schema: U 1 U 2 S 2 S 1 U 2 U 1 S 1 S 2 S 4 S 8 U 8 U 4 S 8 U 8 S 4 U Incubatie Incubeer de platen gedurende 16 tot 18 uur in een broedstoof bij 30 ± 2 C. 11 Kwaliteitscontrole Zie LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA. LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 12/13

13 12 Berekening en rapportering De diameter van de waargenomen remmingszones wordt met behulp van vergrotingsapparatuur en een elektronische schuifpasser gemeten tot op 0,1 mm nauwkeurig. De gegevens worden automatisch ingelezen, waarna een softwareprogramma zorgt voor de dataverwerking. De formules die gebruikt worden in het softwareprogramma, de rapportering en de resultaatvalidatie zijn beschreven in LAB 25-P 01 RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-D 29 LAB 25-D 40 LAB 25-D 41 LAB 25-D 54 LAB 25-F 04 LAB 25-F 62 LAB 25-I 15 LAB 25-I 19 LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25-L 23 LAB 25-P 01 LAB 25-P 07 AANMAAK CONTROLEMONSTERS ANTIBIOTICA ANTIBIOTICA: OVERZICHT STANDAARDOPLOSSINGEN ANTIBIOTICA: GEHALTE, INWEEG, VERDUNNINGEN WERKWIJZE FLAVOFOSFOLIPOL ANTIBIOTICA REGISTRATIE STOCKSTANDAARDOPLOSSING REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART HANDELINGEN MICROBIOLOGISCH LABO BEHEER STANDAARDEN TOEVOEGINGSMIDDELEN OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT LIJSTEN ANTIBIOTICA RESULTAATVALIDATIE ANTIBIOTICA VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-049 Bepaling van Flavofosfolipol in dierenvoeders (Agardiffusie) v.05 13/13