Versie 03 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-136 I-MET-FLVVT-136 Versie 03 Datum van toepassing Opgesteld door : Jeroen Vancutsem, sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : HPLC LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 1/11

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draag-wijdte van de herziening J. Vancutsem, september 2010 Opsteller initiële versie J. Vancutsem, januari 2012 J. Vancutsem, november 2012 Update volgens documentbeheer, omwille van de leesbaarheid zijn de wijzigingen weggelaten Algemene herziening Volledige tekst Volledige tekst * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 2/11

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE WERKWIJZE EXTRACTIE VERDUNNING VAN HET EXTRACT OPZUIVERING KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 3/11

4 1 Doel Kwantitatief bepalen van zearalenon. 2 Toepassingsgebied Deze analyse-instructie beschrijft de methode voor het bepalen van zearalenon in granen en afgeleide producten met behulp van HPLC. De rapporteringsgrens is 10 µg/kg. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Wijzigingen ten opzichte van de referentiemethode: geen 4 Definities en afkortingen Term ZEA HPLC IAC Definitie Zearalenon High Performance Liquid Chromatography Immunoaffiniteitskolom 5 Principe Zearalenon wordt uit het monster geëxtraheerd met acetonitril/water (75/25 v/v). Het extract wordt gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wordt na verdunning met een immunoaffiniteitskolom gezuiverd. De uiteindelijke scheiding en bepaling worden uitgevoerd met hoge drukvloeistof-chromatografie (HPLC) met een reversed phase C18-kolom en fluorescentiedetectie. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25-L 22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaaheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 4/11

5 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. Mycotoxines zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen dienen in een zuurkast te worden uitgevoerd. Speciale voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer mycotoxines in vaste vorm zijn, vanwege hun elektrostatische karakter waardoor zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden. Decontaminatie van het glaswerk en toxinehoudende oplossingen wordt uitgevoerd door gebruik van een javeltablet in de vaatwasser. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetonitril (CH 3 CN), HPLC kwaliteit Methanol HPLC kwaliteit Natriumchloride Orthofosforzuur Na 2 HPO 4.2H 2 O KCl KH 2 PO 4 Water, HPLC kwaliteit Gedemineraliseerd water Water, UHPLC kwaliteit PBS-buffer Los op in 1000 ml water: NaCl (R0200) 9 g (± 1g) Na 2 HPO 4.2H 2 O (R0457) 1,2 g (± 0,1g) KH 2 PO 4 (R0719) 0,2 g (± 0,05g) KCl (R0718) 0,2 g (± 0,05g) Stel de ph op 7 met 50% orthofosforzuur (W1837). Controleer de ph met een ph-indicatorstrip. De houdbaarheid bedraagt 1 maand bij 4 ± 4 C. Standaardverdunningsoplossing: methanol water (50-50 v/v) Verdun 500 ml methanol met 500 ml HPLC water Labonr. R0026 R0183 R0200 R0232 R0457 R0718 R0719 R1003 R1004 R2023 W1824 W1832 LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 5/11

6 Orthofosforzuur 50 % Meng 500 ml orthofosforzuur (R0232) met 500 ml gedemineraliseerd water Extractieoplossing Meng 750 ml acetonitiril met 250 ml gedemineraliseerd water W1837 W Hulpstoffen Immunoaffiniteitskolommen: Easi-extract zearalenone (R Biopharm) Vouwfilters: S&S 595 ½ Ø 240 mm Microfilter: 11 cm; 1,5 µm Standaarden ZEA-standaardoplossing (S2149) Commerciële standaard van 100 µg/ml in acetonitril (S2149). De houdbaarheid is vermeld op het certificaat. Bewaar deze oplossing in de koelkast bij 4 ± 4 C W2016: ZEA kalibratie-oplossing Laat voor gebruik de standaardoplossing (S2149) op kamertemperatuur komen. Breng 50 µl van de standaardoplossing (S2149) in een maatkolf van 50 ml. Damp met stikstof de oplossing droog en los het residu op in 50 ml standaardverdunningsoplossing (W1832) zodat een oplossing van 100 ng/ml bekomen wordt. Bewaar deze oplossing in het donker in de koelkast bij 4 ± 4 C. Gebruik deze niet langer dan 1 maand en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat. De piekoppervlakte van de nieuwe kalibratie-oplossing mag maximaal 20 % verschillen van de vorige kalibratie-oplossing die meegenomen wordt binnen dezelfde analysereeks. Indien de waarde niet voldoet wordt de meetreeks verworpen en een nieuwe kalibratie-oplossing bereid. Indien het probleem zich nogmaals voordoet moet getracht worden de oorzaak op te sporen om het probleem te verhelpen. De gegevens worden genoteerd in LAB 25-F45 BEHEER VAN STANDAARDEN MYCOTOXINES W2017: ZEA spike-oplossing 10 µg/ml Laat voor gebruik de standaardoplossing (S2149) op kamertemperatuur komen. Verdun de standaardoplossing (S2149) 10x met acetonitril. De houdbaarheid bedraagt 2 maanden en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 6/11

7 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L21 GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT APPARATUUR 9.2 Specificaties voor deze methode Chromatografische omstandigheden HPLC: Kolom: Lichrospher 100 RP-18(e) (5 µm) + guard kolom Kolomoven: De reactie wordt uitgevoerd op kamertemperatuur. Detectorparameters o Detector: fluorescentie o Golflengte: excitatie: 274 nm, emissie: 446 nm Pompparameters o Loopsnelheid : 1 ml/min o Isocratisch o Samenstelling: 47% water - 53% acetonitril Autosampler parameters: Injectievolume 100 µl UHPLC: Kolom: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 µm + guard kolom Kolomoven: De temperatuur van de kolomoven bedraagt 40 C. Detectorparameters o Detector: fluorescentie o Golflengte: excitatie: 274 nm, emissie: 446 nm Pompparameters o Loopsnelheid : 0,2 ml/min o Isocratisch o Samenstelling: 47% water - 53% acetonitril Autosampler parameters: Injectievolume 20 µl Voordat een analysereeks gestart wordt, moet voldoende stabilisatietijd voor het systeem in acht genomen worden. De tijd om het systeem te laten stabiliseren bedraagt ongeveer 30 min of tot een constante basislijn bekomen wordt. Vervolgens worden de kalibratie-oplossingen geïnjecteerd. De piekoppervlakte van de eerste injectie van de kalibratie-oplossing van 50 ng/ml wordt genoteerd op LAB 25-F 02: REGISTRATIE VAN DE GEBRUIKTE KOLOMMEN - MYCOTOXINES. Hierbij moet een reproduceerbaar LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 7/11

8 piekoppervlak (maximaal 20% afwijking t.a.v. vorige notatie in LAB 25-F 02) verkregen worden. De standaardpiek moet zonder schouder of gelijksoortige chromatografische tekortkoming zijn. Dit wordt visueel gecontroleerd. Indien niet voldaan aan deze voorwaarden, worden eerst andere parameters zoals druk, lekkages, temperatuur gecontroleerd en verholpen alvorens over te gaan naar bereiding van nieuwe standaarden Controle op de lineariteit Bij elke reeks van analyses worden 4 standaardoplossingen geïnjecteerd. Met deze punten wordt een kalibratielijn opgesteld. Deze worden geïnjecteerd uit de kalibratie-oplossing (W2016) in volgende volumes (met bijhorende concentraties) : Concentratie (ng/ml) Injectievolume (µl) concentratie in de matrix (µg/kg) Na elke 6 monsters wordt telkens de referentieoplossing van 50 ng/ml geïnjecteerd ter controle van het verloop van de piekrespons. De piekuitslagen van de referentieoplossing mogen niet meer dan 10% verschil geven in een analysereeks. Indien het verschil groter is, worden de resultaten na de laatst goede standaard verworpen. De kalibratiecurve moet recht zijn. De correlatiecoëfficiënt moet minimaal 0,99 bedragen. Als aan deze eisen is voldaan, wordt dadelijk verdergegaan. Zoniet worden eerst de oorzaken van de problemen opgespoord en verholpen Verloop van de metingen Indien het monster veel ZEA bevat, moet het extract zodanig verdund worden met standaardverdunningsoplossing (W1832) dat de ZEA piek lager is dan de hoogste piek van de kalibratie-oplossingen. De meting wordt op volgende wijze uitgevoerd: Kalibratie-oplossing 10 ng/ml Kalibratie-oplossing 20 ng/ml Kalibratie-oplossing 50 ng/ml (1) Kalibratie-oplossing 100 ng/ml blancomonster blancomonster + spike 50 µg/kg Kalibratie-oplossing van 50 ng/ml ( 10% afwijking op (1)). Zoniet herhaalset LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 8/11

9 5 monsters Kalibratie-oplossing van 50 ng/ml ( 10% afwijking op (1)). Zoniet herhaalset 5 monsters 10 Werkwijze 10.1 Extractie Kalibratie-oplossing van 50 ng/ml ( 10% afwijking op (1)). Zoniet herhaalset tot vorige referentieoplossing, indien die niet in orde is. Weeg 25 g (± 0,25 g) van het analysemonster af in een Schottfles. Voeg 100 ml extractieoplossing (W2015) toe Homogeniseer in een ultraturrax gedurende 3 minuten of laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm. Filtreer het extract over een vouwfilter en verzamel het filtraat in een beker Verdunning van het extract Pipetteer 12 ml van het gefilterde extract in een maatcilinder van 100 ml. Verdun het extract met 88 ml PBS buffer (W1824). Meng goed. Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat in een Schottfles. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is Opzuivering Laat 50 ml verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen m.b.v. de zwaartekracht of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt (50 ml is equivalent met 1,5 g staal) en droog de kolom door er lucht door te persen om de laatste druppels te verwijderen. Let er op dat voor het aanbrengen van nieuwe vloeistof geen lucht aangezogen wordt omdat dit de efficiëntie van de op de kolom aangebrachte antilichamen nadelig beïnvloedt. Koppel daarom eerst de immunoaffiniteitskolom af. Laat 20 ml gedemineraliseerd water door de kolom lopen met behulp van de zwaartekracht en droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels te verwijderen of gebruik de vacuüm manifold. Elueer met 750 µl methanol, verzamel het eluaat. Wacht 1 minuut Elueer opnieuw met 750 µl methanol, verzamel het eluaat. Elueer ten slotte met 1,5 ml HPLC water, verzamel het eluaat en vortex. Injecteer 100 µl in de HPLC. LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 9/11

10 De sample amount bedraagt 1 indien niet werd afgeweken van deze werkwijze. 11 Kwaliteitscontrole Bij iedere set analysen wordt een blancomonster meegenomen volgens de methode. Het resultaat van het blancomonster mag niet hoger zijn dan de rapporteringsgrens. Indien een piek waargenomen wordt, wordt de gehele meetreeks verworpen. Bij iedere set analysen wordt een blancomonster gespiked met 50 µg/kg ZEA. Het terugvindingspercentage moet meer dan 60 % en minder dan 120 % van de werkelijke waarde zijn. Dit wordt genoteerd op een controlekaart waarbij moet voldaan zijn aan LAB 25-I 22 CONTROLEKAARTEN. Indien het terugvindingspercentage niet voldoet wordt de reeks verworpen. De spiking gebeurt door toevoeging van 125 µl ZEA spikeoplossing (W2017) aan 25 g blanco monster. Laat het solvent uitdampen gedurende ten minste 30 minuten. De piekidentificatie gebeurt bij iedere reeks van analyses door vergelijking van de retentietijden van het monster met deze van de referentieoplossing. De retentietijd van zearalenon in elk chromatogram mag 5 % afwijken t.o.v. de retentietijd van de referentieoplossing van 50 ng/ml. Indien de retentietijd niet voldoet, worden de resultaten na de laatst goede standaard verworpen. De retentietijd staat vermeld op het chromatogram. Naast de piekidentificatie is de identiteit van het molecule gegarandeerd door de specificiteit van de methode. De fluorescentiedetectie gebeurt op een voor het molecule specifieke excitatiegolflengte en emissiegolflengte. Daarnaast zijn de antilichamen van de immunoaffiniteitskolommen specifiek. 12 Berekening en rapportering De berekening van de concentratie wordt uitgevoerd op de kalibratiecurve. Een positieve vaststelling dient door het sectiehoofd of plaatsvervanger aantoonbaar geparafeerd te worden op de ruwe data. Het analytische resultaat wordt geregistreerd met correctie op basis van de terugvinding en wordt uitgedrukt in µg/kg, behalve voor dierenvoeders waar het uitgedrukt wordt in mg/kg. Voor monsters met een concentratie > LOQ moet de meetonzekerheid vermeld worden bij het analyseresultaat. Indien bij diervoeders de waarde > 50% van de norm, dient de analyse opnieuw uitgevoerd te worden. Het in het analyserapport vermelde resultaat is de gemiddelde waarde uit ten minste twee, op aparte porties van het monster uitgevoerde bepalingen. Neem als resultaat het gemiddelde van de 2 resultaten, die voldoen aan de reproduceerbaarheid (= 2,8 s R ) van de LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 10/11

11 methode. Indien geen enkel resultaat voldoet aan de reproduceerbaarheid van de methode, vermeld het gemiddelde van de 3 resultaten, gevolgd door de 3 resultaten. 13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-L21 LAB 25-L22 LAB 25-F 45 LAB 25-I 22 LAB 25-F 62 LAB 25-L 18 LAB 25-P 07 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT BEHEER VAN STANDAARDEN MYCOTOXINES CONTROLEKAARTEN REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART OVERZICHT WETGEVING FLVVT VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-136 Zearalenon (HPLC) v.03 11/11