Versie 05 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen Bestuur Laboratoria I-MET-FLVVT-108 I-MET-FLVVT-108 Versie 05 Datum van toepassing Opgesteld door : Jeroen Vancutsem, sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Mycotoxines LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-1/11

2 Overzicht wijzigingen Herziening door/datum * Reden van de herziening Tekstdeel/draag-wijdte van de herziening J. Vancutsem, Opsteller initiële versie (methodenummer 344) juli 2007 J. Vancutsem, oktober 2010 Algemene herziening Hele tekst J. Vancutsem, december 2011 J. Vancutsem, november 2012 J. Vancutsem, mei 2014 Na interne audit en algemene herziening Algemene herziening Aanpassing hoeveelheid OPA-reagens n.a.v. NC ACT-14XTV-0018b Hele tekst Hele tekst 8.1 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-2/11

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN REAGENTIA HULPSTOFFEN TOESTELLEN ALGEMEEN SPECIFICATIES VOOR DEZE METHODE WERKWIJZE EXTRACTIE VERDUNNING VAN HET EXTRACT OPZUIVERING DERIVATISATIE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURE, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-3/11

4 1 Doel Kwantitatief bepalen van fumonisine B 1, B 2 en B 3. 2 Toepassingsgebied Deze analyse-instructie beschrijft de methode voor het bepalen van fumonisine B 1, B 2 en B 3 in granen en graanproducten met behulp van HPLC. De rapporteringsgrens is 0,025 mg/kg voor fumonisine B 1 en 0,050 mg/kg voor fumonisine B 2 en B 3. 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Wijzigingen ten opzichte van de referentiemethode: geen 4 Definities en afkortingen Term FUM HPLC FLVVT OPA Definitie Fumonisine High Performance Liquid Chromatography Federaal Laboratorium voor Voedselveiligheid Tervuren Ortho-phthaldialdehyde 5 Principe Fumonisine wordt uit het monster geëxtraheerd met acetonitril-methanol-water (25/25/50 v/v/v). Het extract wordt gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wordt na verdunning met een immunoaffiniteitskolom gezuiverd. De uiteindelijke scheiding en bepaling worden uitgevoerd met hoge drukvloeistof-chromatografie (HPLC) met een reversed phase C18-kolom en fluorescentiedetectie na derivatisatie met OPA. 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25- L22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT De waarden voor de reproduceerbaaheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-4/11

5 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. Mycotoxines zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen dienen in een zuurkast te worden uitgevoerd. Speciale voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer mycotoxines in vaste vorm zijn, vanwege hun elektrostatische karakter waardoor zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden. Decontaminatie van het glaswerk en toxinehoudende oplossingen wordt uitgevoerd door gebruik van een javeltablet in de vaatwasser. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetonitril, HPLC kwaliteit Methanol HPLC-kwaliteit Natriumchloride Orthofosforzuur Na 2 HP0 4 2H 2 0 NaH 2 PO 4 Kaliumchloride KH 2 P0 4 Water, HPLC-kwaliteit Gedemineraliseerd water 2-mercapto-ethanol O-phthaldialdehyde Natrium tetraboraat decahydraat Extractie-oplossing: acetonitril/methanol/water (25/25/50, v/v/v) Meng 250 ml acetonitril, 250 ml methanol en 500 ml gedemineraliseerd water. PBS-buffer Los op in 1000 ml gedemineraliseerd water: NaCl (R0200) 9 g (± 1g) Na 2 HPO 4.2H 2 O (R0457) 1,2 g (± 0,1g) Labonr. R0026 R0183 R0200 R0232 R0457 R0595 R0718 R0719 R1003 R1004 S2012 R2041 R2042 W1823 W1824 LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-5/11

6 KH 2 PO 4 (R0719) 0,2 g ( ± 0,05g) KCl (R0718) 0,2 g (± 0,05g) Stel de ph op 7 met 50% orthofosforzuur (W1837). Controleer met een ph-indicatorstrip. De houdbaarheid bedraagt 1 maand bij 4 ± 4 C. 0,1 M NaH 2 PO 4 -oplossing Los 12 g (± 1g) NaH 2 PO 4 (R0595) op in 1000 ml gedemineraliseerd water. De houdbaarheid bedraagt 1 maand bij 4 ± 4 C. Orthofosforzuur 50% Meng 500 ml orthofosforzuur (R0232) met 500 ml gedemineraliseerd water. Natrium tetraboraat decahydraat-oplossing 0,1 M Los 3,81 g (± 0,3 g) natrium tetraboraat decahydraat (R2042) op in 100 ml gedemineraliseerd water. De houdbaarheid bedraagt 1 jaar bij 4 ± 4 C. OPA reagens Los 40 mg (± 5 mg) o-phtaldialdehyde (R2041) op in 1 ml methanol en vortex. Voeg 5 ml natrium tetratboraat decahydraat-oplossing 0.1 M (W1842) toe en vortex. Voeg 50 µl 2-mercapto-ethanol (R2040) toe en vortex. Maak van deze oplossing zoveel als nodig is voor de derivatisatie van alle standaarden en stalen die in de reeks moeten geanalyseerd worden. Per injectie is er ongeveer 700 µl 1 ml OPA-reagens nodig. Standaardverdunningsoplossing FUM (75/25, v/v) Meng 750 ml methanol met 250 ml gedemineraliseerd water. Samenstelling loopmiddelen voor HPLC: 75% solvent A: methanol 25% solvent B: 1000 ml 0,1 M NaH 2 PO 4 -oplossing (W1825) + 75 ml orthofosforzuur (W1837) W1825 W1837 W1842 W1843 W Hulpstoffen R0642: Immunoaffiniteitskolommen Fumoniprep; (R-Biopharm) Vouwfilters: S&S 595 ½ Ø 240 mm Microfilter: Ø 125 mm; 1,5 µm Standaarden Fumonisine B 1, B 2 en B 3 standaardoplossingen Commerciële standaarden van 50 µg/ml in acetonitril/water. De houdbaarheid is vermeld op het certificaat. Bewaar deze oplossingen in de koelkast bij 4 ± 4 C. Concentratie Nummer standaard FUM B 1 50 µg/ml S2080 LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-6/11

7 FUM B 2 50 µg/ml S2081 FUM B 3 50 µg/ml S W1833: kalibratie-oplossing fumonisine Laat voor gebruik de fumonisine standaardoplossingen (S2080, S2081, S2127) op kamertemperatuur komen. Voeg 400 µl FUM B 1 (S2080), 400 µl FUM B 2 (S2081) en 400 µl FUM B 3 (S2127) toe in eenzelfde maatkolf van 50 ml. Voeg standaardverdunningsoplossing (W2009) toe tot aan de maatstreep zodat een oplossing van 400 ng/ml bekomen wordt (W1833). Deze oplossing wordt verder verdund volgens onderstaande tabel: concentratie 400 ng/ml 200 ng/ml (referentieoplossing) 100 ng/ml 50 ng/ml concentratie in de matrix 2 mg/kg 1 mg/kg 0,5 mg/kg 0,25 mg/kg benaming concentratie in matrix (mg/kg) verdunning W ml W W1835 0,5 W1836 0,25 20 ml W1833 in 40 ml 5 ml W1833 in 20 ml 5 ml W1833 in 40 ml Bewaar deze oplossing goed afgesloten in het donker in de koelkast bij 4 ± 4 C en gebruik deze niet langer dan 1 maand en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat. De piekoppervlakte van de nieuwe kalibratie-oplossing mag maximaal 20 % verschillen van de vorige kalibratie-oplossing die meegenomen wordt binnen dezelfde analysereeks. Indien de waarde niet voldoet wordt de meetreeks verworpen en een nieuwe kalibratie-oplossing bereid. Indien het probleem zich nogmaals voordoet moet getracht worden de oorzaak op te sporen om het probleem te verhelpen. De gegevens worden genoteerd in LAB25-F45: BEHEER VAN STANDAARDEN MYCOTOXINES. 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van de gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Chromatografische omstandigheden Kolom: Lichrospher 100 RP-18(e) (5 µm) LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-7/11

8 Kolomoven: De reactie wordt uitgevoerd op kamertemperatuur. Detectorparameters o Detector: fluorescentie o Golflengte: excitatie: 335 nm, emissie: 440 nm Pompparameters o Loopsnelheid : 1 ml/min o Isocratisch o Samenstelling: zie hoger Autosampler parameters: Injectievolume 100 µl Voordat een analysereeks gestart wordt, moet voldoende stabilisatietijd voor het systeem in acht genomen worden. De tijd om het systeem te laten stabiliseren bedraagt ongeveer 30 min of tot een constante basislijn bekomen wordt. Vervolgens worden de kalibratie-oplossingen geïnjecteerd. Het oppervlak van de injectie van de kalibratie-oplossing van 200 ng/ml wordt genoteerd op LAB 25-F 62 REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART. Hierbij moet een reproduceerbaar piekoppervlak verkregen worden (maximaal 20% afwijking t.a.v. vorige notatie in LAB 25 F62). De standaardpiek moet zonder schouder of gelijksoortige chromatografische tekortkoming zijn. Dit wordt visueel gecontroleerd. Indien niet voldaan aan deze voorwaarden, worden eerst andere parameters zoals druk, lekkages, temperatuur gecontroleerd en verholpen alvorens over te gaan naar bereiding van nieuwe standaarden Controle op de lineariteit Bij elke reeks van analyses worden de 4 standaardoplossingen geïnjecteerd. Met deze punten wordt een kalibratielijn opgesteld. Na elke 6 monsters wordt telkens de referentieoplossing van 200 ng/ml geïnjecteerd ter controle van het verloop in piekrespons. De piekuitslagen van de referentiestandaard mogen niet meer dan 10% verschil geven in een analysereeks. Indien het verschil groter is, worden de resultaten na de laatst goede standaard verworpen. De kalibratielijn moet recht zijn. De correlatiecoëfficiënt moet minimaal 0,99 bedragen. Als aan deze eisen is voldaan, wordt dadelijk verdergegaan. Zoniet worden eerst de oorzaken van de problemen opgespoord en verholpen Verloop van de metingen De metingen worden op volgende wijze uitgevoerd: LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-8/11

9 Kalibratie-oplossing 40 ng/ml Kalibratie-oplossing 100 ng/ml (1) Kalibratie-oplossing 200 ng/ml Kalibratie-oplossing 400 ng/ml Blancomonster Blancomonster + spike 150 µg/kg Referentieoplossing 200 ng/ml (± 10 % afwijking op (1)). Zoniet herhaalset Maximum 6 monsters Referentieoplossing 200 ng/ml (± 10 % afwijking op (1)). Zoniet herhaalset Maximum 6 monsters Referentieoplossing 200 ng/ml (± 10 % afwijking op (1)) Zoniet herhaalset tot vorige referentieoplossing, indien die niet in orde is 10 Werkwijze 10.1 Extractie Weeg 20 g (± 0,2 g) van het analysemonster af in een Schottfles met 2,5 g (± 0,25 g) NaCl. Voeg 100 ml extractieoplossing (W1823) toe Homogeniseer in een ultraturrax gedurende 5 minuten of laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm. Centrifugeer het extract daarna gedurende 10 minuten bij ongeveer 3000 rpm. Filtreer de bovenstaande vloeistof over een vouwfilter en verzamel het filtraat in een beker Verdunning van het extract Pipetteer 10 ml van het gefilterde extract in een beker. Verdun het extract met 40 ml PBS-buffer (W1824). Meng goed. Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat in een beker. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is Opzuivering Laat 10 verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen met behulp van de zwaartekracht of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt (10 ml is equivalent met 0,4 g staal). Koppel hiervoor een glazen spuit aan op de immunoaffiniteitskolom. Laat 10 ml PBS-buffer (W1824) door de kolom lopen met behulp van de zwaartekracht of gebruik de vacuüm manifold.. Droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels buffer te verwijderen. LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-9/11

10 Elueer de fumonisines met 1,5 ml methanol 100 % aan een snelheid van ongeveer 1 druppel per seconde en verzamel het eluaat. Spoel de immunoaffiniteitskolom daarna met 0,5 ml water aan een snelheid van ongeveer 1 druppel per seconde en verzamel het eluaat Derivatisatie 600 µl van de standaardoplossingen en extractieoplossingen worden automatisch met behulp van het HPLC-toestel gemengd met 200 µl OPA-reagens (W1843). 200 µl wordt binnen de twee minuten na toevoegen van het OPA-reagens geïnjecteerd. Het is aanbevolen een reproduceerbare tijd aan te houden na toevoeging van het OPA-reagens (W1843) en de injectietijd (2 minuten). 11 Kwaliteitscontrole Bij iedere set analysen wordt een blancomonster meegenomen volgens de methode. Het resultaat van het blancomonster mag niet hoger zijn dan de rapporteringsgrens. Indien er een piek waargenomen wordt, wordt de gehele meetreeks verworpen. Bij iedere set analysen wordt een blancomonster gespiked met 150 µg/kg FUM Het terugvindingspercentage moet meer dan 60 % en minder dan 120 % van de werkelijke waarde zijn. Dit wordt genoteerd op een controlekaart waarbij moet voldaan zijn aan LAB 25-I 22 CONTROLEKAARTEN. Indien het terugvindingspercentage niet voldoet wordt de reeks verworpen. De spiking gebeurt door toevoeging van 60 µl van elk van de standaardoplossingen (S2080/S2081/S2127) aan 20 g blanco monster. Laat het solvent uitdampen gedurende ten minste 30 minuten. De piekidentificatie gebeurt bij iedere reeks van analyses door vergelijking van de retentietijden van het monster met deze van de referentieoplossing. De retentietijd van de fumonisines in elk chromatogram mag 5% afwijken t.o.v. de retentietijd van de referentieoplossing. Indien de retentietijd niet voldoet, worden de resultaten na de laatste goede standaard verworpen. De retentietijd staat vermeld op het chromatogram. Naast de piekidentificatie is de identiteit van het molecule gegarandeerd door de specificiteit van de methode. De fluorescentiedetectie gebeurt op een voor het molecule specifieke excitatiegolflengte en een emissiegolflengte. Daarnaast zijn de antilichamen van de immunoaffiniteitskolommen specifiek. 12 Berekening en rapportering De berekening van de concentratie wordt uitgevoerd op de kalibratiecurve. LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-10/11

11 Een positieve vaststelling dient door de sectieverantwoordelijke of plaatsvervanger aantoonbaar geparafeerd te worden op de ruwe data. Het analytische resultaat wordt geregistreerd met correctie op basis van de terugvinding. Het terugvindingspercentage moet worden vermeld. Voor monsters met een concentratie > LOQ moet de meetonzekerheid vermeld worden bij het analyseresultaat. Indien bij diervoeders de waarde > 50% van de norm, dient de analyse opnieuw uitgevoerd te worden. Het in het analyserapport vermelde resultaat is de gemiddelde waarde uit ten minste twee, op aparte porties van het monster uitgevoerde bepalingen. Neem als resultaat het gemiddelde van de 2 resultaten, die voldoen aan de reproduceerbaarheid (= 2,8 s R ) van de methode. Indien geen enkel resultaat voldoet de reproduceerbaarheid van de methode, vermeld het gemiddelde van de 3 resultaten, gevolgd door de 3 resultaten. 13 Verwijzing naar bijhorende procedure, instructies, documenten, formulieren of lijsten LAB 25-L 18 LAB 25-L 21 LAB 25-L 22 LAB 25- F 62 LAB 25- F 45 LAB 25-I 22 LAB 25-P 07 OVERZICHT WETGEVING FLVVT APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT REGISTRATIE KOLOMMEN EN CONTROLEKAART BEHEER VAN STANDAARDEN - MYCOTOXINES CONTROLEKAARTEN VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25 I-MET-FLVVT-108 Bepaling van Fumonisine B1, B2 en B3 in granen en graanproducten - v.05-11/11