I-MET-FLVVT-011. Versie 05 Datum van toepassing

Transcriptie

1 Federaal Agentschap voor de Veiligheid van de Voedselketen FLVVT I-MET-FLVVT-011 I-MET-FLVVT-011 Versie 05 Datum van toepassing Opgesteld door : Jeroen Vancutsem, Sectieverantwoordelijke Nazicht door : Sophie De Volder; QAM; Goedkeuring vrijgave door : Mandy Lekens; Labomanager; Beheer & locatie geldende versie : FLVVT; M:\DOCUMENTEN\QAM\Kwaliteitsysteem Bestemmelingen : Medewerkers FLVVT Trefwoorden : Mycotoxines

2 Overzicht herziening van het document Herziening door/datum* J. Vancutsem, februari 2008 J. Vancutsem, juli 2008 QAM, oktober 2008 J. Vancutsem, september 2010 J. Vancutsem, november 2012 J. Vancutsem, september 2014 Reden van herziening Opsteller initiële versie (methodenummer 308) Opmerkingen gemaakt tijdens BELAC-audit dd 03/03/2008 (B-NC UIT ) + wijziging methodenummer versienummer 01 wordt behouden Tekstdeel / draagwijdte van de herziening Bestandsnaam Blz Algemene herziening Algemene herziening Aanpassingen nav interne audit (ACT-14XTV-0194a en ACT-14XTV-0194b) Hele tekst Hele tekst 9.2 en 11 * Het verschil tussen de huidige datum en de laatste herziening mag niet meer dan 5 jaar bedragen. Wijzigingen ten opzichte van de vorige versie worden gemarkeerd in rood. Indien omwille van de omvang van de wijzigingen, de tekst door gebruik van markeringen niet meer leesbaar wordt, wordt de markering van wijzigingen weggelaten in de nieuwe versie. Dit wordt vermeld in de historiek van het document. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-2/12

3 INHOUDSTABEL 1 DOEL TOEPASSINGSGEBIED WETTELIJKE EN NORMATIEVE DOCUMENTEN DEFINITIES EN AFKORTINGEN PRINCIPE PRESTATIEKENMERKEN VEILIGHEIDSVOORSCHRIFTEN EN BIJZONDERE MAATREGELEN REAGENTIA EN HULPSTOFFEN TOESTELLEN WERKWIJZE KWALITEITSCONTROLE BEREKENING EN RAPPORTERING VERWIJZING NAAR BIJHORENDE PROCEDURES, INSTRUCTIES, DOCUMENTEN, FORMULIEREN OF LIJSTEN LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-3/12

4 1 Doel Kwantitatief bepalen van T-2 en HT-2 toxine. 2 Toepassingsgebied Deze analyse-instructie beschrijft de methode voor het bepalen van T-2 en HT-2 toxine in granen en bier met behulp van HPLC. De rapporteringsgrens is: Rapporteringsgrens Matrix T-2 toxine HT-2 toxine Granen (B) 25 µg/kg 25 µg/kg Bier (NB) 2,5 µg/kg 2,5 µg/kg 3 Wettelijke en normatieve documenten Een overzicht van de wettelijke en normatieve documenten wordt gegeven in LAB 25-L 18 OVERZICHT WETGEVING FLVVT. Wijzigingen ten opzichte van de referentiemethode: geen 4 Definities en afkortingen Term HPLC B NB FLVVT 1-AN DMAP Definitie High Performance Liquid Chromatography Belac accreditatie Niet Belac accreditatie Federaal laboratorium voor voedselveiligheid Tervuren 1-Antroylnitrile 4-Dimethylaminopyridine 5 Principe T-2 en HT-2 toxine worden uit het monster geëxtraheerd met methanol/water (90/10 v/v). Het extract wordt gefiltreerd en een gedeelte van het filtraat wordt na verdunning met een immunoaffiniteitskolom gezuiverd. De uiteindelijke scheiding en bepaling worden uitgevoerd met hoge drukvloeistofchromatografie (HPLC) met een reversed phase C18-kolom en fluorescentiedetectie na derivatisatie met 1-AN en DMAP. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-4/12

5 6 Prestatiekenmerken De relevante meetonzekerheden zijn terug te vinden in LAB 25- L22 OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT. De waarden voor de reproduceerbaaheid (RSD R %) zijn terug te vinden in M:\DOCUMENTEN\QAM\Tweedelijn\Beoordeling tweedelijn.xlsx. 7 Veiligheidsvoorschriften en bijzondere maatregelen De scheikundige producten die bij deze analysemethode gebruikt worden, zijn ondergebracht bij de potentieel giftige en kankerverwekkende stoffen. Dit maakt het noodzakelijk de voorziene maatregelen in het laboratorium toe te passen om blootstelling aan of contact met deze producten tot een minimum te herleiden. Algemene en specifieke veiligheidsvoorschriften zijn opgenomen in LAB 25-P 07 VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT. Mycotoxines zijn uiterst giftige verbindingen. Handelingen dienen in een zuurkast te worden uitgevoerd. Speciale voorzorgsmaatregelen dienen te worden genomen wanneer mycotoxines in vaste vorm zijn, vanwege hun elektrostatische karakter waardoor zij zich gemakkelijk in werkruimten verspreiden. Decontaminatie van het glaswerk en toxinehoudende oplossingen wordt uitgevoerd door gebruik van een javeltablet in de vaatwasser. 8 Reagentia en hulpstoffen 8.1 Reagentia Reagentia Acetonitril, HPLC-kwaliteit Methanol Natriumchloride Tolueen, pesticide analyse Water, HPLC kwaliteit 1-Antroylnitrile poeder 4-Dimethylaminopyridine poeder Gedemineraliseerd water Water, UHPLC kwaliteit Natriumchlorideoplossing 4% Labonr. R0026 R0183 R0200 R0273 R1003 R2013 R2012 R1004 R2023 W0219 LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-5/12

6 Los 40 g (± 1g) natriumchloride op in 1000 ml gedemineraliseerd water. Standaardverdunningsoplossing T2-HT2: Acetonitril/water (70/30, v/v): Meng 700 ml acetonitril met 300 ml HPLC-water. Extractieoplossing Methanol/water (90/10, v/v) : Meng 900 ml methanol met 100 ml gedemineraliseerd water. 1-Antroylnitrile (1-AN) 1 mg/ml: Los 100 mg (± 10 mg) 1-AN (R2013) op in tolueen in een maatkolf van 100 ml. Deze oplossing is 1 jaar houdbaar. 1-Antroylnitrile (1-AN) 0,3 mg/ml : Verdun 15 ml van W1061 met tolueen in een maatkolf van 50 ml. Deze oplossing is 6 maanden houdbaar. 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) 10 mg/ml: Los 1000 mg (± 100 mg) DMAP (R2017) op in tolueen in een maatkolf van 100 ml. Deze oplossing is 1 jaar houdbaar. 4-Dimethylaminopyridine (DMAP) 0,325 mg/ml : Verdun 3,25 ml van W1063 met tolueen in een maatkolf van 100 ml. Deze oplossing is 6 maanden houdbaar. W0220 W1057 W1061 W1060 W1063 W Hulpstoffen R2021: Immunoaffiniteitskolommen Easi-extract T-2 and HT-2; (R-Biopharm) Vouwfilters: S&S 595 ½ Ø 240 mm Microfilter: Ø 125 mm; 1,5 µm Standaarden T-2 en HT-2 standaardoplossingen Commerciële standaarden van 100 µg/ml in acetonitril. De houdbaarheid is vermeld op het certificaat. Bewaar deze oplossingen in de koelkast bij 4 ± 4 C. Concentratie Nummer standaard T-2 toxine 100 µg/ml S0058 HT-2 toxine 100 µg/ml S W1058: T-2 en HT-2 kalibratie-oplossing Laat voor gebruik de standaardoplossingen (S0058 en S0059) op kamertemperatuur komen Breng 50 µl T-2 standaardoplossing (S0058) en 50 µl HT-2 standaardoplossing (S0059) in een proefbuis Verdamp het solvent bij ongeveer 60 C onder een lichte stikstofstroom. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-6/12

7 Voeg 50 µl DMAP-oplossing 0,325 mg/ml (W1062) toe Voeg daarna 50 µl 1-AN 0,3 mg/ml (W1060) toe. Vortex gedurende ongeveer 1 minuut Laat het mengsel gedurende 15 minuten reageren bij 60 C. Koel het mengel daarna af gedurende 10 minuten in ijs of equivalent Blaas daarna droog met behulp van stikstof in de sample concentrator bij ongeveer 60 C Los op in standaardverdunningsoplossing (W0220), breng kwantitatief over in een maatkolf van 50 ml en vul aan tot aan de maatstreep zodat een oplossing van 100 ng/ml bekomen wordt. Bewaar deze oplossing goed afgesloten in het donker in de koelkast bij 4 ± 4 C en gebruik deze niet langer dan 1 maand en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat. De piekoppervlakte van de nieuwe kalibratie-oplossing mag maximaal 20% afwijken van de vorige kalibratie-oplossing die meegenomen wordt binnen dezelfde analysereeks. Indien de waarde niet voldoet wordt de meetreeks verworpen en een nieuwe kalibratie-oplossing bereid. Indien het probleem zich nogmaals voordoet moet getracht worden de oorzaak op te sporen om het probleem te verhelpen. De gegevens worden genoteerd in LAB 25 F45 BEHEER VAN STANDAARDEN MYCOTOXINES W1059: T2-HT2 spike-oplossing 10 µg/ml Laat voor gebruik de standaardoplossingen (S0058 en S0059) op kamertemperatuur komen. Breng 500 µl T2-standaardoplossing (S0058) en 500 µl HT2-standaardoplossing (S0059) in een maatkolf van 5 ml. Leng aan met standaardverdunningsoplossing (W0220) zodat een oplossing van 10 µg/ml bekomen wordt. De houdbaarheid bedraagt 2 maanden en niet langer dan de bewaardatum op het certificaat. 9 Toestellen 9.1 Algemeen Een overzicht van de gebruikte apparatuur wordt gegeven in LAB 25-L 21 APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT. 9.2 Specificaties voor deze methode Chromatografische omstandigheden HPLC Kolom: Chromolith RP-18e (4,6 x 100 mm) + guard-kolom Kolomoven: 30 C LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-7/12

8 Detectorparameters o Detector: fluorescentie o Golflengte: excitatie: 381 nm, emissie: 470 nm Pompparameters o Loopsnelheid : 1,0 ml/min o Gradiëntelutie o Elutieschema: Tijd (min) water (%) Acetonitril (%) o De gradiënt mag aangepast worden teneinde een betere resolutie te bekomen. Autosampler parameters: Injectievolume 100 µl UHPLC Kolom: Acquity UPLC BEH C18, 1,7 µm + guard kolom Kolomoven: 30 C Detectorparameters o Detector: fluorescentie o Golflengte: excitatie: 381 nm, emissie: 470 nm Pompparameters o Loopsnelheid : 0,2 ml/min o Gradiëntelutie o Elutieschema: Tijd (min) Water (%) Acetonitril (%) , , LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-8/12

9 17, , , o De gradiënt mag aangepast worden ten einde een betere resolutie te bekomen Autosampler parameters: Injectievolume 20 µl Voordat een analysereeks gestart wordt, moet voldoende stabilisatietijd voor het systeem in acht genomen worden. De tijd om het systeem te laten stabiliseren bedraagt ongeveer 30 minuten of tot een constante basislijn bekomen wordt. Vervolgens worden de kalibratie oplossingen geïnjecteerd. De piekoppervlakken van de eerste injectie van de kalibratie oplossing van 50 ng/ml wordt genoteerd op LAB 25-F 62 REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART. Hierbij moet een reproduceerbaar piekoppervlak (maximaal 20% afwijking t.a.v. vorige notatie in LAB 25-F 62 voor HPLC-methoden en S/N 20 voor de standaard met de laagste concentratie voor UHPLC-methoden) verkregen worden. De standaardpiek moet zonder schouder of gelijksoortige chromatografische tekortkoming zijn. Dit wordt visueel gecontroleerd. Indien niet voldaan aan deze voorwaarden, worden eerst andere parameters zoals druk, lekkages, temperatuur gecontroleerd en verholpen alvorens over te gaan naar bereiding van nieuwe standaarden Controle op de lineariteit Bij elke reeks van analyses worden 4 standaardoplossingen geïnjecteerd. Met deze punten wordt een kalibratielijn opgesteld. Deze worden geïnjecteerd uit de kalibratie-oplossing (W1058) in volgende volumes (met bijhorende concentraties) : concentratie injectievolume HPLC injectievolume UPLC concentratie in de matrix (µg/kg) 10 ng/ml 10 µl 2 µl ng/ml 25 µl 5 µl ng/ml 50 µl 10 µl ng/ml 100 µl 20 µl 100 Na elke 6 monsters wordt telkens de referentieoplossing van 50 ng/ml geïnjecteerd ter controle van het verloop in piekrespons. De piekuitslagen van de referentiestandaard mogen niet meer dan 10% verschil geven in een analysereeks. Indien het verschil groter is, worden de resultaten na de laatst goede standaard verworpen. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-9/12

10 De kalibratielijn moet recht zijn. De correlatiecoëfficiënt moet minimaal 0,99 bedragen. Als aan deze eisen is voldaan, wordt dadelijk verdergegaan. Zoniet, worden eerst de oorzaken van de problemen opgespoord en verholpen Verloop van de metingen De metingen worden op volgende wijze uitgevoerd: Kalibratie-oplossing 10 ng/ml Kalibratie-oplossing 25 ng/ml (1) Kalibratie-oplossing 50 ng/ml Kalibratie-oplossing 100 ng/ml Blancomonster Blancomonster + spike 25 µg/kg Referentieoplossing 50 ng/ml (± 10 % afwijking op (1)). Zoniet herhaalset. Maximum 6 monsters Referentieoplossing 50 ng/ml (± 10 % afwijking op (1)). Zoniet herhaalset. Maximum 6 monsters Referentieoplossing 50 ng/ml (± 10 % afwijking op (1)) Zoniet herhaalset tot vorige referentieoplossing, indien die niet in orde is. 10 Werkwijze 10.1 Extractie Weeg 50,0 g (± 0,5 g) van het analysemonster af in een Schottfles met 5g (± 0,5 g) NaCl. Voeg 250 ml extractieoplossing (W1057) toe. Homogeniseer in een ultraturrax gedurende 3 minuten of laat gedurende 30 minuten schudden bij ± 250 rpm Filtreer het mengsel over een vouwfilter en verzamel het filtraat Verdunning van het extract Pipetteer 10 ml van het extract in een Schottfles Verdun het extract met 40 ml natriumchlorideoplossing 4% (W0219) en wacht 5 minuten. Schud 3 minuten en wacht vervolgens weer 5 minuten. Filtreer over een microfilter en verzamel het filtraat. Let er op dat de filter niet beschadigd wordt bij het vouwen. Zorg dat het bekomen extract vrijwel helder is Opzuivering Laat 25 ml verdund extract volledig door de immunoaffiniteitskolom lopen met behulp van de zwaartekracht (25 ml is equivalent met 1 g staal) of stel de vacuüm manifold zo in dat het extract met een snelheid van maximum 1 druppel per seconde doorloopt. LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-10/12

11 Koppel hiervoor een glazen spuit aan op de immunoaffiniteitskolom. Laat 20 ml water door de kolom lopen m.b.v. de zwaartekracht of gebruik de vacuüm manifold. Droog de kolom door er lucht door te persen met de spuit om de laatste druppels water te verwijderen. Elueer met 750 µl methanol. Verzamel het eluaat in een proefbuis en spoel de kolom 3 keer na via backflushing. Zuig hiervoor het eluaat op en laat het opnieuw door de kolom lopen. Elueer nogmaals met 750 µl methanol Blaas lucht door de kolom om de laatste druppels methanol te verzamelen. Blaas met behulp van stikstof het eluaat droog in de sample concentrator bij ongeveer 60 C Derivatisering Voeg 50 µl DMAP 0,325 mg/ml (W1062) toe aan het gedroogde residu Voeg daarna 50 µl 1-AN reagens 0,3 mg/ml (W1060) toe Vortex gedurende ongeveer 1 minuut Laat het mengsel gedurende 15 minuten reageren bij ongeveer 60 C Koel het mengel daarna af gedurende 10 minuten in ijs of equivalent Blaas daarna droog met behulp van stikstof in de sample concentrator bij ongeveer 60 C Los het eluaat op in 1 ml standaardverdunningsoplossing (W0220), vortex gedurende ongeveer 30 seconden en breng de inhoud in een vial. Injecteer 100 µl in de HPLC of 20 µl in de UHPLC 11 Kwaliteitscontrole Bij iedere set analysen wordt een blancomonster meegenomen volgens de methode. Het resultaat van het blancomonster mag niet hoger zijn dan de rapporteringsgrens. Indien er een piek waargenomen wordt, wordt de gehele meetreeks verworpen. Bij iedere set analysen wordt een blancomonster gespiked met 25 µg/kg T-2 toxine en 25 µg/kg HT2-toxine. Het terugvindingspercentage moet meer dan 60 % en minder dan 130 % van de werkelijke waarde zijn. Dit wordt genoteerd op een controlekaart waarbij moet voldaan zijn aan LAB 25-I 22 Controlekaarten. Indien het terugvindingspercentage niet voldoet wordt de reeks verworpen. De spiking gebeurt door toevoeging van 125 µl van spikeoplossing (W1059) aan 50,0 g blanco monster. Laat het solvent uitdampen gedurende ten minste 30 minuten. De piekidentificatie gebeurt bij iedere reeks van analyses door vergelijking van de retentietijden van het monster met deze van de referentieoplossing. De retentietijd van T2 en HT-2 in elk chromatogram mag 5 % 0,2 minuten afwijken t.o.v. de retentietijd van de vorige injectie voor UHPLC-runs en 0,4 minuten voor HPLC-runs afwijken t.o.v. de LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-11/12

12 retentietijd van de referentieoplossing. Indien de retentietijd niet voldoet, worden de resultaten na de laatste goede standaard verworpen. De retentietijd staat vermeld op het chromatogram. Naast de piekidentificatie is de identiteit van het molecule gegarandeerd door de specificiteit van de methode. De fluorescentiedetectie gebeurt op een voor het molecule specifieke excitatiegolflengte en een emissiegolflengte. Daarnaast zijn de antilichamen van de immunoaffiniteitskolommen specifiek. 12 Berekening en rapportering De berekening van de concentratie wordt uitgevoerd op de kalibratiecurve. Een positieve vaststelling dient door het sectiehoofd of plaatsvervanger aantoonbaar geparafeerd te worden op de ruwe data. Het analytische resultaat wordt geregistreerd met correctie op basis van de terugvinding. Het terugvindingspercentage moet worden vermeld. Voor monsters met een concentratie > LOQ moet de meetonzekerheid vermeld worden bij het analyseresultaat. Indien bij diervoeders de waarde > 50% van de norm, dient de analyse opnieuw uitgevoerd te worden. Het in het analyserapport vermelde resultaat is de gemiddelde waarde uit ten minste twee, op aparte porties van het monster uitgevoerde bepalingen. Neem als resultaat het gemiddelde van de 2 resultaten, die voldoen aan de reproduceerbaarheid (= 2,8 s R ) van de methode. Indien geen enkel resultaat voldoet aan de reproduceerbaarheid van de methode, vermeld het gemiddelde van de 3 resultaten, gevolgd door de 3 resultaten. 13 Verwijzing naar bijhorende procedures, instructies, documenten, formulieren of lijsten. LAB 25-F 45 LAB 25-I 22 LAB 25-L 21 LAB 25-F 62 LAB 25-L 18 LAB 25-L 22 LAB 25-P 07 BEHEER STANDAARDEN MYCOTOXINES CONTROLEKAARTEN APPARATUUR GEBRUIKT VOOR ANALYSEN FLVVT REGISTRATIE KOLOMMEN & CONTROLEKAART OVERZICHT WETGEVING FLVVT OVERZICHT MEETONZEKERHEDEN FLVVT VEILIGHEIDSINSTRUCTIES FLVVT LAB 25-MET-FLVVT-011T-2 en HT-2 toxine in granen (HPLC) v.05-12/12