GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN 15 VOLLEDIGE DOOFHEIDSGENEN VIA SECOND GENERATION SEQUENCING

Transcriptie

1 FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische biotechnologie Academiejaar GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN 15 VOLLEDIGE DOOFHEIDSGENEN VIA SECOND GENERATION SEQUENCING Apr. Valerie VANDERSTRAETEN Master na master in de Industriële Farmacie Promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce Co-promotor Prof. Dr. P. Coucke

2

3 FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische biotechnologie Academiejaar GENETISCHE DIAGNOSTIEK VAN 15 VOLLEDIGE DOOFHEIDSGENEN VIA SECOND GENERATION SEQUENCING Apr. Valerie VANDERSTRAETEN Master na master in de Industriële Farmacie Promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce Co-promotor Prof. Dr. P. Coucke

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. Datum: Auteur: Valerie Vanderstraeten Datum: Promotor: Prof. D. Deforce

5 Dankwoord De thesis zou niet tot stand gekomen zijn zonder de steun van een aantal mensen die ik hier graag zou willen bedanken. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dieter Deforce en co-promotor Prof. Paul Coucke danken voor het leveren van een extreem boeiend onderwerp. Bedankt voor de kans die ik gekregen heb om ervaring op te doen over next-generation sequencing. Filip Van Nieuwerburgh, bedankt voor de algemene begeleiding en voor het leveren van constructieve commentaar en suggesties. Speciale dank gaat uit naar Bram De Wilde voor de dagelijkse begeleiding. Bedankt voor de vele uren die je in dit onderzoeksproject geïnvesteerd hebt en de talloze tips van onschatbare waarde. Nathalie Vanderstraeten wil ik speciaal bedanken omdat we een zo n goed team vormden bij het uitvoeren van dit onderzoeksproject. Teamwork is the key to succes is nu eenmaal een uitspraak met een hoog waarheidsgehalte. De personeelsleden van het Centrum Medische Genetica Gent, in het bijzonder Sarah, Hendrik en Bieke. Bedankt voor de raad die jullie mij gegeven hebben en de aangename sfeer die er op het labo heerste. Een speciaal dankwoord gaat uit naar mijn vriend Laurian voor zijn onvoorwaardelijke liefde en steun. Hij zorgde voor ontspanning, bracht nieuwe ideeën aan en voegde perspectief toe aan het geheel. Het laatste dankwoord is gericht aan mijn ouders en vrienden die tijd maakten om te luisteren en mij moed gaven om door te zetten.

6 INHOUDSOPGAVE Auteursrecht Dankwoord Inhoudsopgave Lijst met gebruikte afkortingen Inleiding 1. LITERATUURSTUDIE DOOFHEID TE SEQUENEREN DOOFHEIDSGENEN REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION Principe Detectie met TaqMan probe Detectie met ds DNA bindende kleurstoffen Amplificatiecurve Smeltcurve ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx Aanmaken van een library DNA fragmentatie door nebulisatie End-repair Toevoegen van een A base aan het 3 uiteinde van de DNA-fragmenten Ligatie van adaptoren aan de DNA-fragmenten Opzuivering van de ligatieproducten Amplificatie van de adaptor gemodificeerde DNA-fragmenten via PCR Validatie van de library Genereren van clusters in het Cluster Station Voorbereiding Hybridisatie en bridge amplificatie Linearisatie Blocking reactie Hybridisatie van de sequencing primer Sequencing by synthesis in de Genome Analyzer IIx (GAIIx) OBJECTIEVEN MATERIALEN EN METHODEN BESCHRIJVING VAN DNA-STALEN WHOLE GENOME AMPLIFICATION Principe Procedure...21

7 3.3. REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION Principe Procedure POOLEN VAN DE AMPLICONS Principe Procedure CONCENTRATIEMETING VAN DE POOLS MET DE QUANT-IT TM PICOGREEN DS DNA KIT Principe Procedure Voorbereiding Quant-it Picogreen meting dsdna OPZUIVERING VAN PCR PRODUCTEN QIAquick PCR Purification Kit Principe Procedure END-REPAIR Principe Procedure Aanconcentratie met vacuümcentrifuge RC Concentratiemeting met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer End-Repair reactie LIGATIE Principe Procedure KWALITEITSCONTROLE VAN DE LIGATIE MET QPCR Principe Procedure KWALITEITSCONTROLE VAN DE LIGATIE MET DE AGILENT 2100 BIOANALYZER Principe Procedure SIZE SELECTIE Double SPRI methode Principe Procedure Chroma Spin 1000 kolom Principe Procedure KWALITEITSCONTROLE VAN DE SIZE SELECTIE MET QPCR...43

8 Principe Procedure KWALITEITSCONTROLE VAN DE SIZE SELECTIE MET DE AGILENT 2100 BIOANALYZER Principe Procedure RESULTATEN CONCENTRATIEMETING VAN DE POOLS MET DE QUANT-IT TM PICOGREEN DS DNA KIT END-REPAIR Concentratiemeting met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer LIGATIE Kwaliteitscontrole van de ligatie met qpcr Statistische verwerking van de resultaten met R Kwaliteitscontrole van de ligatie met de Agilent Bioanalyzer SIZE SELECTIE Double SPRI methode Kalibratie van de AMPure beads Kwaliteitscontrole met qpcr Kwaliteitscontrole met de Agilent Bioanalyzer Chroma Spin 1000 kolom Kwaliteitcontrole met qpcr Kwaliteitscontrole met de Agilent Bioanalyzer CONCLUSIE LITERATUURLIJST 7. BIJLAGEN Bijlage 1: Bespreking van de 15 te sequeneren doofheidsgenen Bijlage 2: Schematisch overzicht van de Illumina-technologie Bijlage 3: Tabellen met reverse complement van de amplicon forward en backward primers Bijlage 4: Schematische voorstelling van de 96-well platen met de forward primers en backward primers Bijlage 5: Tabel met de codes van de primers Bijlage 6: Offset 0, offset 4 en offset 8 plaat Bijlage 7: 96-well plaat met mastermixen Bijlage 8: 384-well plaat Bijlage 9: Picogreenmeting van de pools Bijlage 10: Absorptiespectra van de pools na opzuivering en aanconcentratie

9 % Procent C Graden Celcius A AD AFA AR ATP BOR bp Buffer EB Buffer PB Buffer PE C LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN Adenine Autosomaal dominant Adaptive Focused Acoustics Autosomaal recessief Adenosine triphosphate Branchio-Oto-Renal Syndrome basenparen Elutiebuffer Binding buffer Wash buffer Cytosine CDH23 Cadherin-like 23 CHARGE Coloboma - Heart defects - Atresia - Genital abnormalities - CMGG CMV cq-waarde C T -waarde Cx26 gen datp dctp ddntp's DEPC-water DFNA DFNB dgtp d.m.v. DNA dntp's DOP-PCR Double SPRI methode dsdna dttp ENaC ESPN ESRRB FAM FRET G g GAIIx Gb GC-gehalte Ear abnormalities Centrum voor Medische Genetica Gent Cytomegalovirus Quantification Cycle Treshold Cycle Number Connexine 26 gen Deoxyadenosine triphosphate Deoxycytidine triphosphate 2, 3 - dideoxynucleotide trifosfaten Diethylpyrocarbonate water Deafness autosomal dominant Deafness autosomal recessive Deoxyguanosine triphosphate door middel van Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleotide trifosfaten Degenerated Oligonucleotide Primed Polymerase Chain Reaction Double Solid Phase Reversible Immobilisation methode Double stranded DNA Deoxythymidine triphosphate Epithelial amiloride sensitive sodium Espin Estrogen-related receptor beta 6-carboxyfluoresceïne Fluorescence Resonance Energy Transfer Guanine gravitatiekracht Genome Analyzer IIx Gigabases Guanine-Cytosine - gehalte

10 gdna Genomisch DNA GJB2 Gap junction protein beta 2 GJB6 Gap junction beta 6 H 2 O Dihydrogen Monoxide HMW High Molecular Weight HRM kleurstoffen High Resolution Melting kleurstoffen HRMCA High Resolution Melting Curve Analysis Hz Hertz i.p.v. in plaats van K/tile Cluster per tile K + kb M m.a.w. MDA g MgCl 2 min min df/dt l ml mm M mm m MPC MTRNR1 gen MYO15A MYO7A n NaOH NaCl ng NGS nl. nm nmol NS NS-AD NS-AR NS-M NS-X o.a. OD 260/280 Optical Density 260/280 OTOF Otoferlin PCDH15 Protocadherin 15 Kalium Kilobasen Golflengte Molariteit met andere woorden Multiple Displacement Amplification microgram Magnesiumchloride minuten verlies van fluorescentie tegenover de temperatuur microliter milliliter millimeter micromolair millimolair micrometer Magnetic Particle Concentrator Mitochondrial 12S rrna gen Myosine XVA Myosine VIIA aantal Natriumhydroxide Natriumchloride nanogram Next Generation Sequencing namelijk nanometer nanomol Niet syndromaal Niet syndromaal autosomaal dominant Niet syndromaal autosomaal recessief Niet syndromaal mitochondriaal Niet syndromaal X gebonden onder andere

11 PCR PEG PEP pg ph PJVK pm pmol Polymerase Chain Reaction Polyethyleenglycol Primer Extension Preamplification picogram Potentia hydrogenii of zuurtegraad Pejvakin picomolair picomol POU3F4 POU domain, class 3, transcription factor 4 QPCR RFU rpm RT-PCR RNA S sec. S-AD sample ID S-AR Quantitative Polymerase Chain Reaction Relative Fluorescence Revolutions per minute Real Time Polymerase Chain Reaction Ribonucleic acid Syndromaal seconde Syndromaal autosomaal dominant Sample Identification Syndromaal autosomaal recessief SLC26A4 Solute carrier family 26, member 4 SNP S-X T T4 PNK TAMRA Taq DNA polymerase TE-buffer TECTA Single Nucleotide Polymorphisms Syndromaal X gebonden Thymine T4 polynucleotide kinase 6-carboxytetramethylrhodamine Thermus aquaticus DNA polymerase Tris/EDTA buffer Tectorin alpha TMC1 Transmembrane channel-like 1 TMIE Transmembrane inner ear TMPRSS3 Transmembrane protease serine 3 TRIO and F-actin binding TRIOBP protein Tris buffer Tris-Cl UV vol:vol WFS1 gen WGA X Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer hydrogen chloride Ultraviolet volume/volume ratio Wolfram syndrome 1 gen Whole Genome Amplification X-gebonden

12 INLEIDING Erfelijk gehoorverlies zonder verdere andere symptomen (niet-syndromaal gehoorverlies) is genetisch zeer heterogeen. Dat wil zeggen dat defecten in meerdere genen gehoorverlies kunnen veroorzaken. Er zijn al meer dan 40 doofheidsgenen bekend, maar een groot aantal doofheidsgenen wacht nog op identificatie. Er zijn zowel dominant (DFNA) als recessief (DFNB) overervende vormen van slechthorendheid. Dominant gehoorverlies is meestal postlinguaal. Recessief gehoorverlies is veelal prelinguaal. Via verschillende methoden waaronder familiestudies (koppelingsonderzoek) wordt de chromosomale regio opgespoord waarin het gendefect in een bepaalde familie/persoon ligt. Vervolgens wordt er in een selectie van deze genen gezocht naar een mogelijk gendefect. Een belangrijke mutatie-detectie techniek is DNA sequentie analyse. Identificatie van het genetisch defect is essentieel voor goed erfelijkheidsadvies aan patiënten en hun families en voor het geven van een prognose. Ook kan het kennen van het genetisch defect in een patiënt van belang zijn bij de keuze van het cochleair implant. Daarnaast levert het identificeren van de genen kennis over het functioneren van het binnenoor. Dit vormt de basis voor mogelijke strategieën voor behandeling. Sequencing vormt een krachtig diagnostisch platform voor het opsporen van mutaties in doofheidsgenen. Alle sequenties van de verschillende exonen in de te onderzoeken genen worden zichtbaar, waardoor men rechtstreeks de mutatie kan afleiden. De hoge vraag naar sequencing aan een lage kost heeft geleid tot de ontwikkeling van high-throughput sequencing of Next Generation Sequencing (NGS) technologieën. Hierbij gebeurt het sequencing proces in parallel, waardoor er duizenden tot miljoenen sequenties in één keer worden gegenereerd. De Genome Sequencer van Roche Life Sciences (454 sequencing) is een high-throughput sequeneringstechnologie gebaseerd op een combinatie van emulsie PCR en pyrosequencing. De lange leeslengte ( bp) maakt de 454 sequeneringstechnologie geschikt voor de sequencing van lange amplicons. De technologie van de Illumina Genome Analyzer IIx steunt op bridge amplification en reversible terminator-based sequencing. De Illumina paired-end technologie heeft een leeslengte van 2 x 100 bp. Omwille van de hogere throughput en de 100-voudige lagere kost per basenpaar bij de Illumina sequeneringstechnologie in vergelijking met de 454 sequeneringstechnologie, is amplicon sequencing op de Illumina Genome Analyzer IIx een aantrekkelijk alternatief. Een groot probleem is dat tot op heden sequencing van lange amplicons op de Illumina Genome Analyzer IIx, een short read sequencer, niet mogelijk is. De bedoeling van dit onderzoeksproject is om 15 volledige doofheidsgenen te sequeneren op de Illumina Genome Analyzer IIx. Amplicon sequencing van deze 15 doofheidsgenen staat reeds op punt op de 454 sequencer van Roche. Om amplicon sequencing mogelijk te maken op de Illumina Genome Analyzer IIx, wordt een protocol van ligeren en ad random fragmenteren ontwikkeld. Meer specifiek bestaat de studie erin dat de efficiëntie van de ligatiereactie wordt geoptimaliseerd op het vlak van de inputhoeveelheid en dat voor de daaropvolgende stappen uit het ligatieprotocol verschillende strategieën met elkaar worden vergeleken. De beste condities worden vervolgens geselecteerd en toegepast op 5 stalen van patiënten met erfelijke doofheid. Een belangrijk criterium bij de selectie van de beste condities is de equimolariteit zodat men voor elke base van elk amplicon evenveel sequencing coverage bekomt.

13 Dit onderzoeksproject gebeurde in samenwerking met Apr. Nathalie Vanderstraeten. In deze scriptie staan de ligatie- en size selectie- experimenten beschreven en becommentarieerd. De uitgevoerde experimenten ter optimalisatie van de fragmentatie staan uitvoerig beschreven in de thesis van Nathalie. Hoofdstuk 1 bevat een bespreking van de verschillende oorzaken van doofheid en een overzicht van de 15 te sequeneren doofheidsgenen. De technologie van de Illumina Genome Analyzer IIx wordt gedetailleerd uiteengezet. De principes van QPCR worden eveneens besproken. Hoofdstuk 2 schetst het objectief van dit onderzoeksproject. In Hoofdstuk 3 worden de gebruikte materialen en methoden besproken. De resultaten zijn opgenomen in Hoofdstuk 4. De conclusie van dit onderzoeksproject staat in Hoofdstuk 5. Het praktisch werk werd uitgevoerd in het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) dat deel uitmaakt van het Universitair Ziekenhuis Gent. Het vertegenwoordigt één van de acht genetische centra in België waar erfelijkheidsonderzoek wordt uitgevoerd.

14 1. LITERATUURSTUDIE 1.1. DOOFHEID In Figuur 1.1. staat een overzicht weergegeven van de verschillende oorzaken van doofheid. Concreet zijn er vier hoofdgroepen: 1. Erfelijk en Niet-Syndromaal (NS) 2. Erfelijk en Syndromaal (S) 3. Niet-Erfelijk 4. Verworven De nummers in Figuur 1.1. hebben betrekking op de vier hoofdcategorieën. Aangeboren Verworven Erfelijk Niet-Erfelijk Niet-Syndromaal (75 %) Syndromaal (25 %) NS-AR (80 %) NS-AD (20 %) NS-X NS-M S-AR S-AD S-X Multifactorieel Virale syndromen FIGUUR 1.1.: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE CATEGORIEÊN OORZAKEN VAN DOOFHEID EN SLECHTHORENDHEID 1 Wanneer doofheid aanwezig is bij de geboorte spreekt men van congenitale of aangeboren doofheid. Congenitale doofheid kan zowel erfelijk als niet-erfelijk zijn. Ongeveer de helft van aangeboren doofheid heeft een erfelijke oorzaak. Erfelijke doofheid kan al dan niet deel uitmaken van een syndroom. De wijze van overerving kan autosomaal dominant (AD), autosomaal recessief (AR), X- gebonden (X) of mitochondriaal (M) zijn. De andere helft van congenitale doofheid wordt veroorzaakt door niet-erfelijke oorzaken zoals infecties (bv. Rubellavirus of Cytomegalovirus) en multifactoriële syndromen. Daarnaast kunnen gehoorstoornissen ook verworven zijn. Intoxicaties (bv. ototoxische aminoglycosiden) van de moeder tijdens de zwangerschap, anoxie of kernicterus van het kind tijdens de geboorte kunnen aan de basis liggen. 1 Erfelijke doofheid treft ongeveer 1 op 1000 kinderen. Bij de meeste dove kinderen is de doofheid de enige klinische afwijking, maar in sommige gevallen komen er nog andere symptomen voor, zoals pigment-, oog- of nierafwijkingen. Men spreekt dan van syndromale doofheid. Een voorbeeld is het Ushersyndroom dat doofheid en blindheid (door retinitis pigmentosa) combineert. De

15 meerderheid van de gevallen is echter niet-syndromaal. In meer dan de helft van de gevallen van doofheid bij kinderen ligt de oorzaak in een mutatie in één gen (monogeen). Er zijn echter veel verschillende genen die erfelijke doofheid kunnen veroorzaken. Op dit moment zijn een 40-tal genen gekend, maar er blijven echter nog vele genen ongekend. Erfelijke doofheid is dan ook een extreem voorbeeld van genetische heterogeniciteit. 1 Slechthorendheid op volwassen leeftijd is nog veel frequenter dan slechthorendheid bij kinderen. De meest voorkomende vorm is ouderdomsslechthorendheid, een aandoening die ongeveer 50% van de mensen ouder dan 80 treft. Veruit de meeste gevallen van slechthorendheid bij volwassenen kennen een complexe oorzaak, waarbij zowel omgevingsfactoren als verschillende genen interageren. Over de genen betrokken bij ouderdomsslechthorendheid is op dit moment nog veel minder geweten dan over de genen voor monogene vormen van doofheid. Een overzicht van de genen betrokken bij doofheid wordt gegeven op de Hereditary Hearing loss Homepage ( welke wordt beheerd door een Antwerpse onderzoeksgroep. 2, TE SEQUENEREN DOOFHEIDSGENEN Er zijn op dit moment een 40-tal verschillende genen gekend die erfelijke doofheid en gehoorverlies kunnen veroorzaken. Het merendeel van deze genen codeert voor eiwitten die meewerken aan het functioneren van de trilhaartjes (stereocilia) van de slakkenhuis (cochlea) in het binnenoor. 4 In dit onderzoeksproject is het de bedoeling om 15 doofheidsgenen te sequeneren met de Illumina Genome Analyzer IIx. De 15 te sequeneren doofheidsgenen staan, samen met de chromosomale regio s waarin het gendefect gelegen is (loci) en/of de syndromen die deze mutaties veroorzaken, weergegeven in Tabel 1.3. Het type erfelijke overdracht wordt afgekort met AR (autosomaal recessief) of AD (autosomaal dominant). Bijlage 1 bevat een korte bespreking van de 15 te sequeneren doofheidsgenen.

16 TABEL 1.3.: OVERZICHT VAN DE 15 TE SEQUENEREN DOOFHEIDSGENEN 4 Gen Officiële Naam Locatie Locus of Syndroom AR of AD TMPRSS3 Transmembrane protease, serine 3 21q22.3 Niet-syndromale doofheid: DFNB8/10 AR TMIE Transmembrane inner ear 3p21 Niet-syndromale doofheid: DFNB6 AR TECTA Tectorin alpha 11q22-q24 Niet-syndromale doofheid: DFNA8/A12 AD Niet-syndromale doofheid: DFNB21 SLC26A4 Solute carrier family 26, member 4 7q31 Niet-syndromale doofheid: DFNB4 AR Pendred Syndrome PCDH15 Protocadherin 15 10q21.1 Niet-syndromale doofheid: DFNB23 AR Usher Syndrome, Type 1F OTOF Otoferlin 2p23.1 Niet-syndromale doofheid: DFNB9 AR GJB2 Gap junction protein, beta 2, 26kDa 13q11-q12 Niet-syndromale doofheid: DFNB1 AR Niet-syndromale doofheid: DFNA3 Vohwinkel's Syndrome Palmoplantar Keratoderma with Deafness Bart-Pumphrey Syndrome Keratitis-Ichtyosis-Deafness Syndrome ESRRB Estrogen-related receptor beta 14q24.3 Niet-syndromale doofheid: DFNB35 AR ESPN Espin 1p36.31-p36.11 Niet-syndromale doofheid: DFNB36 AR CDH23 Cadherin-like 23 10q21-q22 Niet-syndromale doofheid: DFNB12 AR Usher Syndrome, Type 1D MYO7A Myosine VIIA 11q13.5 Niet-syndromale doofheid: DFNA11 AD Niet-syndromale doofheid: DFNB2 Usher Syndrome, Type 1B PJVK Pejvakin 2q31.2 Niet-syndromale doofheid: DFNB59 AR MYO15A Myosine XVA 17p11.2 Niet-syndromale doofheid: DFNB3 AR TMC1 Transmembrane channel-like 1 9q21.12 Niet-syndromale doofheid: DFNB7/11 AR Niet-syndromale doofheid: DFNA36 TRIOBP TRIO and F-actin binding protein 22q13.1 Niet-syndromale doofheid: DFNB28 AR AR AR AR AD AD AD AD AR AR AR AR AD 1.3. REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION Principe Real-time PCR, ook wel kwantitatieve PCR genoemd (Quantitative PCR of QPCR), is een variant op de traditionele PCR reactie. Real-time PCR laat een gelijktijdige amplificatie en kwantificatie van specifieke nucleïnezuursequenties toe. Bij real-time PCR gebeurt de detectie van het PCR-product online door het meten van een fluorescentiesignaal. Na elke PCR-cyclus neemt het fluorescentiesignaal evenredig toe met de toename in hoeveelheid geamplificeerd target-dna. 6 Bij real-time PCR wordt een onderscheid gemaakt tussen specifieke en niet-specifieke detectiesystemen. Specifieke detectiesystemen maken een onderscheid tussen het target-dna en niet-specifieke geamplificeerde fragmenten of primerdimeren. Eén van de meest gebruikte specifieke detectiesystemen is de TaqMan probe procedure. De standaardmethode voor niet-specifieke detectie

17 maakt gebruik van een kleurstof die bindt op dubbelstrengig DNA (dsdna). Een nadeel bij deze methode is dat de kleurstof ook bindt aan primerdimeren en niet-specifieke dsdna fragmenten Detectie met TaqMan probe De TaqMan probe procedure is gebaseerd op een oligonucleotide probe die binnen de targetsequentie van de primers hybridiseert. De probes zijn aan het 5 -uiteinde gelabeld met een fluorescente reporter-dye, bijvoorbeeld FAM (6-carboxyfluoresceïne), en aan het 3 -uiteinde met een niet-fluorescente quencher-dye, bijvoorbeeld TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine). Zolang beide labels aanwezig zijn op de probe, wordt de fluorescentie van de reporter-dye uitgedoofd door de quencher-dye. Dit is te wijten aan FRET of Fluorescence Resonance Energy Transfer. Tijdens de amplificatiecyclus wordt de probe afgebroken door de 5 3 exonuclease activiteit van het DNApolymerase. Hierbij worden de reporter-dye en quencher-dye van elkaar gescheiden. De fluorescentie van de reporter wordt niet meer uitgedoofd. De verhoging van het fluorescentiesignaal is evenredig met de hoeveelheid PCR-product dat wordt gevormd (zie Figuur 1.2.). 7,8 a) Intacte TaqMan-probes. De fluorescentie van de reporter wordt uitgedoofd door FRET. b) Het dubbelstrengig DNA wordt gedenatureerd. De primers kunnen annealen en de TaqMan-probe kan hybridiseren. De fluorescentie van de reporter wordt nog steeds uitgedoofd. c) Wanneer het polymerase een nieuwe DNAstreng gaat synthetiseren en onderweg een TaqManprobe tegen komt, wordt de TaqMan-probe afgebroken en de reporter-dye van quencher-dye gescheiden. De fluorescentie van de reporter-dye wordt niet meer uitgedoofd. Er ontstaat dus een toename van fluorescentie. FIGUUR 1.2.: PRINCIPE VAN TAQMAN PROBE PROCEDURE 6

18 Detectie met ds DNA bindende kleurstoffen a) SYBR Green De meest gebruikte kleurstof is SYBR Green. Deze kleurstof wordt fluorescent bij binding aan dsdna en levert op deze wijze een directe methode voor kwantificering van PCR-producten. SYBR Green intercaleert in dsdna, meer bepaald in de kleine groeve. Het resulterende DNA-kleurstof complex absorbeert blauw licht ( max = 488 nm) en zendt groen licht uit ( max = 522 nm). 9 Gedurende de opeenvolgende PCR-stappen kunnen er verschillende intensiteiten van fluorescerende signalen gemeten worden, afhankelijk van de hoeveelheid dsdna die aanwezig is. Na denaturatie is al het DNA enkelstrengig. SYBR Green zal niet binden en de intensiteit van de fluorescentiesignalen is laag. Gedurende de annealing-stap hybridiseren de PCR-primers op de targetsequentie, wat resulteert in kleine stukjes dsdna. SYBR Green kan dus gaan binden, waardoor de fluorescentie-intensiteit verhoogt. Tijdens de elongatiefase worden de PCR-primers verlengd en kan er dus steeds meer SYBR Green gaan binden. Op het einde van de elongatiefase is al het DNA dubbelstrengig geworden en een maximale hoeveelheid dye gebonden (zie Figuur 1.3.). De fluorescentie wordt gemeten op het einde van de elongatiefase en de toenemende hoeveelheden PCR-product kunnen van cyclus tot cyclus in beeld gebracht worden. 7,8 FIGUUR 1.3.: PRINCIPE VAN SYBR GREEN 10 SYBR Green is niet duur, gemakkelijk in gebruik en gevoelig. Aangezien het zich tussen het dubbelstrengig DNA nestelt, moet er niet voor elke doelsequentie een andere probe ontworpen worden. Een nadeel is wel dat het bindt aan elke dubbelstreng DNA, dus ook aan primerdimeren en niet-specifieke reactieproducten. 7,8 b) LC Green LC Green intercaleert net zoals SYBR Green in dsdna. In tegenstelling tot SYBR Green is LC Green een saturerende dye en inhibeert het de PCR reactie in hoge concentratie niet. De excitatie- en emissiegolflengtes van LC Green Plus liggen bij respectievelijk nm en nm. Wanneer

19 LC Green Plus toegevoegd wordt aan de PCR reactie, verhoogt de annealing temperatuur met 1-3 C. 11 LC Green kleurstoffen zijn speciaal ontwikkeld voor hoge resolutie analyse van een smeltcurve (HRMCA of High Resolution Melting Curve Analysis). Deze technologie karakteriseert DNA op basis van het denaturatiegedrag onder invloed van hitte. Als het geamplificeerd dubbelstrengig DNA, verzadigd met LC Green Plus, gedenatureerd wordt, komt LC Green Plus vrij in het medium en daalt de fluorescentie. Bij SYBR Green daarentegen, een niet-saturerende dye, treedt er een redistributie op van de dye moleculen in het ds DNA (zie Figuur 1.4.). 11 FIGUUR 1.4.: DENATURATIE VAN DS DNA MET SYBR GREEN VERSUS DS DNA MET LC GREEN PLUS 12 De verzadigende eigenschappen van LC Green laten toe om heteroduplex DNA moleculen aan te tonen (zie Figuur 1.5.). Een heteroduplex is een dubbelstrengige DNA-molecule die bestaat uit twee complementaire DNA strengen met een onderling verschil in basenvolgorde. Een heterozygoot (normaal/mutant) geeft 4 soorten enkelstrengige DNA-fragmenten (normale sens, normale antisens, mutante sens en mutante antisens). Hieruit kunnen 4 mogelijke duplexen gevormd worden (normaal sens/normaal antisens, mutant sens/mutant antisens, normaal sens/mutant antisens, mutante sens/normaal antisens). Heteroduplexen hebben een andere vouwing dan homoduplexen. 11 FIGUUR 1.5.: SYBR GREEN DETECTEERT DE HETERODUPLEX IN DE HETEROZYGOTE MUTATIE NIET IN TEGENSTELLING TOT LC GREEN PLUS 12

20 De smelttemperatuur van een bepaalde dubbelstrengige DNA sequentie is afhankelijk van het GC-gehalte, de lengte en de sequentie. De smeltcurve is m.a.w. specifiek voor een bepaalde DNA sequentie. Mutaties doen zich voor als een shift in de smelttemperatuurcurve of een verandering in de vorm van de smeltcurve. Dankzij de hoge gevoeligheid van HRM (High Resolution Melting) kleurstoffen zal zelfs een verandering van één enkele base in een DNA dubbelstreng een verandering induceren in de smeltcurve en bijgevolg in de fluorescentie. Aangezien mutant DNA meestal minder stabiel is dan het wild type, zal mutant DNA meestal eerder uitsmelten. 13 De belangrijkste toepassingen van HRMCA zijn: gene scanning (opsporen van de aanwezigheid van onbekende sequentievariaties in PCR amplicons, als alternatief voor sequencing), SNP genotypering (SNPs of Single Nucleotide Polymorphisms), DNA methylation analyse, DNA mapping en DNA fingerprinting. Deze technologie is bovendien veel goedkoper en preciezer dan methodes gebaseerd op probes Amplificatiecurve Tijdens de qpcr reactie wordt na elke cyclus de hoeveelheid fluorescentie gemeten. In een amplificatiecurve wordt de hoeveelheid fluorescentie (uitgedrukt als Rfu-waarden) uitgezet in functie van het aantal PCR-cycli. De hoeveelheid fluorescentie is een maat voor de hoeveelheid geamplificeerd DNA (zie Figuur 1.6.). 14 FIGUUR 1.6.: AMPLIFICATIECURVE 15 In de amplificatiecurve wordt een threshold-lijn aangegeven, dit is het niveau waarbij de fluorescentie boven het achtergrondsignaal van de eerste cycli uitkomt. Het punt waarin de amplificatiecurve de threshold-lijn snijdt, is de C T -waarde of de Treshold Cycle Number. Hoe hoger de beginconcentratie, hoe sneller een significante stijging in fluorescentie zal worden waargenomen en hoe lager de C T -waarde. 14

21 De C T -waarde ligt in het exponentiële gebied van de amplificatiecurve. De C T -waarde correleert met het aantal cycli die nodig zijn om de exponentiële fase te bereiken (hoe lager, hoe beter). Theoretisch gezien vindt in de exponentiële fase tijdens elke PCR-cyclus een exacte verdubbeling plaats van de hoeveelheid PCR-product. De C T -waarde is omgekeerd evenredig met het logaritme van de beginconcentratie van DNA. Uit Figuur 1.6. blijkt dat de beginconcentratie bij Sample A hoger is dan bij Sample B. 14 Voor kwantificatie zet men van een externe standaardreeks de C T -waarden uit tegenover het logaritme van de initiële hoeveelheid doelwit DNA. Zodoende verkrijgt men een kalibratiecurve. Vervolgens kan met behulp van de C T -waarde van het onbekende staal, door extrapolatie van deze kalibratiecurve, de beginhoeveelheid DNA van het onbekende staal berekend worden Smeltcurve Door verhitting denatureert dubbelstrengig DNA en zal er verlies van fluorescentie optreden, wat gemeten kan worden. Dit wordt weergegeven in een smeltcurve, waarbij het verlies van fluorescentie (-df/dt) tegenover de temperatuur wordt uitgezet (zie Figuur 1.7.). Aangezien de temperatuur van dissociatie afhankelijk is van de lengte en samenstelling van het amplicon, is het bijgevolg mogelijk om na te gaan hoeveel verschillende amplificatieproducten aanwezig zijn in de well. Als er één product wordt geamplificeerd, zal dat product ook in één keer dissociëren bij een bepaalde temperatuur. Dit resulteert dus in één unieke dissociatiepiek in de smeltcurve. Indien er primerdimeren geamplificeerd werden, wordt er gewoonlijk een lage piek geobserveerd rond 70 C. Soms is de piek van de primerdimeren zelfs hoger dan de piek van het specifiek amplificatieproduct. 16 FIGUUR 1.7.: SMELTCURVE (Sample A: TaqMan probe; Sample B: SYBR Green) 17

22 1.4. ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx Het proces van de Illumina Genome Analyzer IIx bestaat uit drie belangrijke stappen. Dit zijn achtereenvolgens: 1. Aanmaken van een library 2. Genereren van clusters in het Cluster Station 3. Reversible terminator-based sequencing in de Genome Analyzer IIx (GaIIx) 18 De karakteristieken van paired-end sequencing met de Illumina Genome Analyzer IIx staan weergegeven in Tabel 1.4. TABEL 1.4.: KARAKTERISTIEKEN PAIRED-END SEQUENCING MET DE ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx 18 Read Length 2 x 100 bp Reads per run Throughput 33 Gb/flowcell Het proces dat hieronder in detail beschreven staat, geldt voor (paired-end) sequencing van genomisch DNA (gdna). In Bijlage 2 staat een schematisch overzicht van de Illumina-technologie. 19, Aanmaken van een library De eerste stap van het sequeneringsproces met de Genome Analyzer IIx van Illumina bestaat uit het aanmaken van een library van dubbelstrengige DNA-fragmenten met aan de uiteinden ervan adaptorsequenties. De adaptorsequenties laten hybridisatie toe met het oppervlakte van de flowcell DNA fragmentatie door nebulisatie In de eerste stap wordt het opgezuiverd gdna (1-5 g, OD 260/280 : 1,8-2) gefragmenteerd via nebulisatie in fragmenten met een grootte < 800 bp. Door nebulisatie ontstaan dubbelstrengige DNAfragmenten met 3 - of 5 -overhangs End-repair Nebuliseren van DNA zorgt voor fragmenten met overhangs. In dit proces worden 3 - en 5 - overhangs van de DNA-fragmenten omgezet in blunt ends d.m.v. het T4 DNA polymerase en het Klenow enzyme. De 3 5 exonuclease activiteit van deze enzymen verwijdert de 3 -overhangs, de 5 3 polymerase activiteit maakt het complement aan van de 5 -overhangs. Door het T4 polynucleotide kinase (T4 PNK) worden de 5 -uiteinden van de DNA-fragmenten gefosforyleerd. 21

23 Toevoegen van een A base aan het 3 uiteinde van de DNA-fragmenten In deze stap wordt er een A base toegevoegd aan het 3 -uiteinde van de blunt gemaakte DNA-fragmenten d.m.v. de polymerase activiteit van het exo - Klenow fragment. Dit bereidt de DNAfragmenten voor op ligatie met adaptoren, die een T base overhang hebben aan hun 3 -uiteinde. Door deze strategie toe te passen wordt de vorming van aan elkaar geligeerde DNA-fragmenten geminimaliseerd Ligatie van adaptoren aan de DNA-fragmenten Na fragmentatie, end-repair en toevoeging van een A base aan het 3 -uiteinde van de DNAfragmenten worden adaptoren geligeerd aan de uiteinden van de DNA-fragmenten d.m.v. het T4 DNA ligase. Er worden twee adaptoren gebruikt: Adaptor 1 en Adaptor 2. Adaptor 1 en 2 bevatten enerzijds elk een sequentie die complementair is met één van de twee amplificatieprimers, die gebonden zijn aan het oppervlakte van de flowcell, zodanig dat hybridisatie mogelijk is. Anderzijds bevatten de adaptoren een sequentie die complementair is met de sequencing primer. In geval van single read sequencing bevat 1 van beide adaptoren een dergelijke sequentie (zie Figuur 1.8.). 21,22 FIGUUR 1.8.: SINGLE READ ADAPTOREN 22 Bij paired-end sequencing bevatten zowel Adaptor 1 als Adaptor 2 een dergelijke sequentie. Eén ervan is complementair aan sequencing primer 1. De andere sequentie is complementair aan sequencing primer 2 (zie Figuur 1.9.). 21 FIGUUR 1.9.: PAIRED-END ADAPTOREN 21 In geval van single read sequencing kan ook gebruik gemaakt worden van een gevorkte adaptor (zie Figuur 1.10.). Hierbij is slechts één adaptor nodig. 23

24 FIGUUR 1.10.: GEVORKTE ADAPTOR 23 De adaptorvork bestaat uit twee partieel geannealde oligonucleotide-sequenties. De adaptorvork is gedeeltelijk dubbelstrengig door een complementair deel van 12 bp lang. Het 3 -uiteinde van de bovenste streng bevat een T base voor TA ligatie met de DNA-fragmenten in de ligatiereactie. Het groene deel P7rev is de complementaire sequentie van de P7 amplificatieprimer. 23 De ligatiereactie gaat door bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat de adaptorvork dubbelstrengig blijft. Bij de ligatiereactie worden er verschillende mogelijke producten gevormd: DNAfragmenten met aan beide uiteinden een geligeerde adaptor, DNA-fragmenten met slechts 1 geligeerde adaptor, DNA-fragmenten zonder adaptor, vrije adaptoren en aan elkaar geligeerde adaptoren. 21, Opzuivering van de ligatieproducten De DNA-fragmenten met geligeerde adaptoren aan beide uiteinden worden opgezuiverd op gel (m.b.v. gelelektroforese) om zo alle niet-geligeerde adaptoren en aan elkaar geligeerde adaptoren te verwijderen. Ligatieproducten met de gewenste lengte worden geselecteerd met behulp van een basenparenladder. De lengte van de ligatieproducten is cruciaal voor de clustergeneratie. In geval van single read sequencing worden de bp bandjes uit de gel geknipt, in geval van paired-end sequencing de band van 300 bp. 21, Amplificatie van de adaptor gemodificeerde DNA-fragmenten via PCR Met behulp van een PCR reactie worden de opgezuiverde ligatieproducten met de gewenste lengte geamplificeerd. 21 De PCR reactie maakt gebruik van twee primers, de P5 en P7 amplification primer. Deze amplificatieprimers kunnen hybridiseren aan de uiteinden van de adaptoren. 23 De 5-3 streng van het PCR-product bevat het complement van de P7 amplification primer en de 3-5 streng bevat het complement van de P5 amplification primer (zie Figuur 1.11.). Hierdoor kunnen beide strengen hybridiseren aan P5 en P7 amplification primer, gebonden aan het oppervlak van de flowcell. De 3-5 streng bevat eveneens het complement van de sequencing primer. Dit laat op zijn beurt hybridisatie toe van de sequencing primer. 23

25 5 AATGATACGGCGACCACCGA P5 amplification primer sequence 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGA P7 amplification primer sequence 5 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT SBS3 sequencing primer sequence INSERT genomic DNA fragment FIGUUR 1.11.: PCR PRODUCT Validatie van de library Op de bekomen library worden een aantal kwaliteitscontroles uitgevoerd: - Bepaling van concentratie van de bibliotheek. Meet de absorptie bij 260 nm. Men moet een hoeveelheid DNA hebben tussen 500 en 1000 ng. - Bepaling van OD 260/280 ratio. De OD 260/280 ratio moet ongeveer 1.8 zijn. - Bepaling van de lengte van de amplicons. Laad 10 % van het volume van de bibliotheek op gel. De smear moet nauw zijn en de lengte moet gelijkaardig zijn aan de lengte van het uitgeknipte DNA na de ligatiereactie aan de hand van de ladder. Wanneer men een brede smear ziet, moet er een tweede opzuiveringsstap op gel gebeuren. - Bepaling van de molaire concentratie van de bibliotheek. Het moleculair gewicht van de bibliotheek wordt berekend door de gemiddelde lengte van de amplicons te vermenigvuldigen met 650 g/mol (moleculaire massa van een basenpaar). De gemiddelde lengte van de amplicons wordt geschat uit de smear op de gel. - Bevestiging dat de amplicons van de DNA bibliotheek afkomstig zijn van het oorspronkelijk gdna. Kloneer 4 % van het volume van de DNA bibliotheek in een sequencing vector. Sequeneer de individuele klonen met behulp van Sanger sequencing Genereren van clusters in het cluster station In het Cluster Station (zie Figuur 1.12.) hybridiseert de bibliotheek aan de flowcell en vindt amplificatie plaats voor latere sequencing in de Genome Analyzer IIx. Elk DNA-fragment (template) van de bibliotheek bindt aan het oppervlakte van de met oligonucleotiden gecoate flowcell en wordt geamplificeerd via bridge amplificatie. Hierdoor wordt uiteindelijk een oppervlaktegebonden kolonie gevormd (cluster). Het resultaat hiervan is een heterogene populatie van clusters met in elke cluster ± 1000 identieke kopieën van de originele template. 24

26 FIGUUR 1.12.: CLUSTER STATION 24 Het Cluster Station verdeelt automatisch alle reagentia. Reactietijden, temperaturen en vloeisnelheden van de reagentia worden gecontroleerd. Het Cluster Station wordt gebruikt in combinatie met de Illumina Cluster Station software. 24 De generatie van clusters gebeurt in volgende stappen: - Hybridisatie van DNA templates: de templates hybridiseren aan het oppervlak van de flowcell, gecoat met oligonucleotide amplificatieprimers. - Amplificatie van DNA templates: de templates worden isotherm geamplificeerd tot clusters. Deze amplificatie is nodig om de intensiteit van fluorescentie te verhogen gedurende de sequencing. - Linearisatie: de dubbelstrengige DNA clusters worden gelineariseerd. Dit is een eerste stap om dubbelstrengig DNA om te zetten in enkelstrengig DNA, nodig voor sequencing. - Blocking reactie: de vrije 3 -hydroxyluiteinden van de gelineariseerde dubbelstrengige DNA clusters worden geblokkeerd. Dit voorkomt sequencing van niet-specifieke sites. - Denaturatie en hybridisatie van sequencing primer: dubbelstrengig DNA wordt gedenatureerd en de sequencing primer hybridiseert aan de gelineariseerde en geblokkeerde clusters. Na deze stap zijn de templates klaar voor sequencing Voorbereiding De DNA templates worden eerst gedenatureerd met NaOH. Denaturatie is nodig om hybridisatie mogelijk te maken met de amplification primers, gebonden aan het oppervlak van de flowcell. Er wordt aangeraden verschillende concentraties van de bibliotheek te laden op de flowcell om zo het aantal clusters die gevormd worden te optimaliseren. Als de DNA concentratie te laag is, zullen er te weinig clusters gegenereerd worden en zal bijgevolg het aantal reads laag zijn. Is daarentegen de DNA concentratie te hoog, dan zullen de clusters te dens zijn en overlappen. Dit compliceert de analyse van de data van de sequencing in sterke mate. Over het algemeen moet de DNA concentratie tussen 1-4 pm liggen. Deze range levert een clusterdensiteit op van ± K/tile. Een tile is een denkbeeldig vierkantje in een laan, met een afmeting van 760 m x 750 m. Elk van de 8 lanen van een flowcell is verdeeld in 2 kolommen van 50 tiles. 24

27 Hybridisatie en bridge amplificatie Na denaturatie wordt de library over het oppervlak van de flowcell gespoeld en hybridiseren de DNA templates met de amplification primers, gebonden aan het oppervlak van de flowcell. Met behulp van DNA polymerase wordt de complementaire streng aangemaakt. 23,24 Vervolgens wordt het dubbelstrengig DNA-fragment gedenatureerd en wordt de originele template weggewassen. De nieuw gesynthetiseerde complementaire streng blijft covalent gebonden op het oppervlak van de flowcell achter. De single templates zijn in een willekeurig patroon gebonden aan de flowcell. De enkelstrengige template kantelt over en hybridiseert met het uiteinde van een naburige amplification primer. Hierbij wordt een brug gevormd. De gehybridiseerde amplification primer wordt verlengd door de activiteit van DNA polymerase. Er wordt een dubbelstrengige brug gevormd. 23,24 Vervolgens wordt de dubbelstrengige brug gedenatureerd. Dit resulteert in twee kopieën van de enkelstrengige templates, covalent gebonden aan de flowcell. Opnieuw zullen de templates ombuigen om te hybridiseren met naastgelegen amplification primers, waarbij bruggen gevormd worden. Gehybridiseerde primers worden verlengd door DNA polymerasen. Deze cyclus van bridge amplificatie wordt herhaald (n = 35) tot er voldoende bruggen gevormd zijn. Naarmate het aantal cycli toeneemt, zullen de clusters alsmaar groter worden. Te grote clusters zullen elkaar raken. Deze worden eruit gefilterd door de Genome Analyzer Pipeline software waardoor de hoeveelheid data van één run zal verminderen. 23, Linearisatie Linearisatie is de eerste stap om dubbelstrengig DNA om te zetten in enkelstrengig DNA. Linearisatie resulteert in forward en reverse strengen die covalent gebonden zijn aan het oppervlak van de flowcell. De reverse strengen worden losgeknipt van de amplification primer en vervolgens weggewassen. Dit zorgt ervoor dat er enkel clusters overblijven met forward strengen. 23, Blocking reactie In de blocking reactie worden de vrije 3 -hydroxyluiteinden geblokkeerd om te voorkomen dat bij de sequencing fluorescente nucleotiden op een andere plaats dan aan het 3 -uiteinde van de sequencing primer worden geïncorporeerd. Op die manier wordt verhinderd dat niet-specifieke plaatsen worden gesequeneerd. Voor de blocking reactie wordt gebruik gemaakt van een terminaal transferase. Dit enzyme plaatst aan de uiteinden van alle vrije amplification primers en aan de uiteinden van alle forward strengen een dideoxynucleotidetrifosfaat-molecule (ddntp). 23, Hybridisatie van de sequencing primer De sequencing primer hybridiseert aan de complementaire sequentie van de adaptor. De flowcell is klaar voor sequencing. 23,24

28 Sequencing by synthesis in de Genome Analyzer IIx (GaIIx) In de Genome Analyzer IIx (zie Figuur 1.13.) worden miljoenen clusters simultaan gesequeneerd. Éen run levert data op in de grootte-orde van verschillende biljoenen basenparen. De Illumina Genome Analyzer IIx maakt hiervoor gebruik van de reversible terminator-based sequencing techniek. 25 FIGUUR 1.13.: GENOME ANALYZER IIx 25 Reversible terminator-based sequencing steunt op het principe van sequencing by synthesis. Dit betekent dat er gebruik gemaakt wordt van DNA polymerase om de sequentie te bepalen. De deoxyribonucleotidetrifosfaat precursoren (datp, dctp, dgtp en dttp) zijn gemodificeerd. De nucleotiden zijn reversible terminators (blokkerende groep op de nucleotiden) en fluorescent gelabeld met elk een verschillend afknipbaar fluorofoor. Wanneer één van deze vier gemodificeerde nucleotiden door DNA polymerase wordt geïncoporeerd, verhindert de reversible terminator verdere ketenverlenging. Deze inhibitie is reversibel. Wanneer immers de blokkerende groep op de nucleotiden en het fluorofoor er wordt afgeknipt, is incorporatie van een nieuw fluorescent gelabelde reversible terminator wel terug mogelijk (zie Figuur 1.14.). FIGUUR 1.14.: REVERSIBLE TERMINATOR BASED SEQUENCING 23 De vier gemodificeerde dntp s worden tegelijkertijd over de flowcell gespoeld. Indien complementair wordt het gemodificeerde nucleotide ingebouwd door de activiteit van DNA polymerase. Niet-geïncoporeerde gemodificeerde nucleotiden worden weggespoeld. Door de fluorescente dye kleurt de cluster bijvoorbeeld geel, rood, groen of blauw naargelang er een A, T, C of

29 G geïncorporeerd wordt. Door een camera wordt een foto genomen van de flowcell (zie Figuur 1.15.). 23,26 FIGUUR 1.15.: CLUSTER PATROON 23 In een volgende stap wordt de blokkerende groep en de fluorescente dye verwijderd, waardoor ketenverlenging opnieuw mogelijk wordt. De vier verschillende fluorescent gelabelde dntp s worden over de flowcell gespoeld en het complementaire nucleotide kan polymeriseren aan het eerste geïncoporeerde nucleotide. Deze incoporatie levert een tweede foto op. Door herhaling van dit proces (100 x) vindt sequencing plaats van elke cluster. Na elke cyclus verandert de cluster van kleur, behalve in het geval van homopolymeren. Door in te zoomen op een klein deel van de flowcell (20 m vierkant) kan elke cluster gevolgd worden gedurende de sequencing. De identiteit van elke geïncoporeerde base en dus ook de sequentie van elke cluster kan afgeleid worden uit de sequentiële foto s die werden genomen (zie Figuur 1.16.). 23,26 FIGUUR 1.16.: BASE CALLING 23 Door het feit dat de vier gemodificeerde nucleotiden tegelijkertijd over de flowcell gespoeld worden, kunnen de nucleotiden met elkaar in competitie treden tijdens de incorporatie. Op die manier zal er minder snel een foutief nucleotide worden geïncoporeerd t.o.v. wanneer de nucleotiden één voor één worden aangeboden. Dit bevordert de accuraatheid. Bovendien laat reversible terminator-based sequencing toe om homopolymeren te sequeneren. 23,26

30 In geval van paired-end sequencing wordt gebruik gemaakt van een hulpinstrument nl., de Paired-End Module (zie Figuur 1.17.). De Paired-End Module voorziet de Genome Analyzer van reagentia voor de tweede read van het paired-end sequencing proces. De Paired-End Module is verbonden met de Genome Analyzer via een externe VICI slang. 25 FIGUUR 1.17.: PAIRED-END MODULE 25 Vooraleer de sequencing van de reverse strengen kan starten, vinden een aantal stappen plaats. Dit zijn achtereenvolgens: - Dehybridisatie van de sequencing pimer: de geëlongeerde sequencing primer, gebruikt voor de eerste read, wordt verwijderd. - Deprotectie: de geblokkeerde 3 -hydroxyluiteinden worden gedeblokkeerd. - Resynthese: de reverse strengen worden geregenereerd via bridge amplificatie. - Linearisatie: dubbelstrengige DNA clusters worden gelineariseerd. Voor de tweede read dienen nu de forward strengen te worden verwijderd. Op die manier blijven er clusters over met enkel reverse strengen. Hierdoor wordt hybridisatie van de tweede sequencing primer aan de reverse strengen mogelijk. - Blocking reactie: dit voorkomt sequencing van niet-specifieke sites. - Denaturatie en hybridisatie van de tweede sequencing primer: dubbelstrengig DNA wordt gedenatureerd en de sequencing primer hybridiseert aan de gelineariseerde en geblokkeerde clusters. Na deze stap zijn de templates klaar voor de tweede read. 25 Sequencing van de reverse strengen gebeurt op een analoge wijze als voor de forward strengen. Met de Genome Analyzer Pipeline Software (Pipeline) kan men de sequeneringsdata van een run analyseren. 25

31 2. OBJECTIEVEN Het objectief van dit onderzoeksproject is het sequencen van 15 volledige doofheidsgenen op de Illumina Genome Analyzer IIx. Amplicon sequencing van deze 15 doofheidsgenen is reeds gerealiseerd op de Genome Sequencer FLX van Roche Life Sciences, een Next Generation Sequencing technologie in termen van high throughput, maar minder goed qua kost per basenpaar. Omwille van de 100-voudige lagere kost per basenpaar en veel hogere throughput bij de Illumina Genome Analyzer IIx, streeft men ernaar amplicon sequencing mogelijk te maken op de Illumina Genome Anaylzer IIx. Het knelpunt is echter de korte leeslengte, 2 x 100 bp bij de paired-end technologie, van de Illumina Genome Analyzer IIx. De te sequeneren amplicons zijn langer dat wat met 2 x 100 bp in één keer kan gesequeneerd worden. Bovendien zijn amplicons op zich moeilijk te fragmenteren. Bij een pool van amplicons met verschillende lengte is het mogelijk dat sommige amplicons (bv. de langere) meer gefragmenteerd worden dan andere. Hierdoor kan de equimolariteit bij de fragmenten met de juiste lengte in gedrang komen. Bovendien kan het zijn dat de fragmenten met de juiste lengte vooral bestaan uit fragmenten die afkomstig zijn van de uiteinden van de amplicons. Aangezien er geen gouden standaard bestaat voor de ad random shearing van amplicons in fragmenten van 300 bp, nodig voor paired-end sequencing op de Illumina Genome Analyzer IIx, werd als alternatief een protocol van ligeren en ad random fragmenteren ontwikkeld. Het ligatieprotocol bestaat uit 5 stappen. - Stap 1: Opzuivering van de amplicons - Stap 2: End-repair van de amplicons - Stap 3: Ligatie van de amplicons - Stap 4: Size selectie van het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA - Stap 5: Ad random shearing van het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA In dit onderzoeksproject is het de bedoeling het ligatieprotocol te optimaliseren. Meer specifiek wordt de inputhoeveelheid van de ligatiereactie geoptimaliseerd. Voor de daaropvolgende stappen uit het ligatieprotocol, de fragment grootte selectie en de ad random shearing, worden telkens twee strategieën met elkaar vergeleken. Het bekomen van equimolariteit is een belangrijk criterium bij het verkiezen van een bepaalde strategie. Als testmateriaal wordt gebruik gemaakt van 5 DNA-stalen van patiënten met erfelijke doofheid. Elk staal bevat alle (gepoolde) amplicons van de 15 te sequeneren doofheidsgenen. Dit onderzoeksproject gebeurde in samenwerking met Apr. Nathalie Vanderstraeten. Deze thesis bevat de resultaten van de optimalisatie van de ligatiereactie en size selectie. De resultaten van de ad random shearing worden in Sequeneren van 15 volledige doofheidsgenen op de Illumina Genome Analyzer IIx uiteengezet.

32 # Amplicons 3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. BESCHRIJVING VAN DNA-STALEN We beschikken over DNA-stalen van 5 patiënten met erfelijke doofheid. De stalen hebben de volgende code: - Staal 1: sh5 S1 - Staal 2: Staal 3: Staal 4: hl ir Staal 5: hl ir2 35 Het is de bedoeling om bij elk van deze 5 patiënten 15 volledige doofheidsgenen te sequeneren met de Illumina Genome Analyzer IIx. Deze 15 doofheidsgenen bevatten in totaal 628 exonen. De lengtedistributie van deze amplicons staat weergegeven in Figuur 3.1. De totale lengte van de amplicons bedraagt basenparen Lengte (bp) FIGUUR 3.1.: LENGTEDISTRIBUTIE VAN DE AMPLICONS 3.2. WHOLE GENOME AMPLIFICATION Principe Voor de stalen hl ir2 27 en hl ir2 35 was er te weinig startmateriaal aanwezig om een PCR reactie uit te voeren. Om dit probleem op te lossen wordt er gebruik gemaakt van Whole Genome Amplification (WGA). Het concept van WGA is pas in de laatste jaren ontwikkeld. De techniek laat toe het (volledige) lineair genomisch DNA (gdna) te amplificeren. Hierdoor beschikt men over voldoende DNA om mee verder te werken. Er worden verschillende WGA principes gebruikt om DNA te amplificeren: DOP-PCR (Degenerated Oligonucleotide Primed Polymerase Chain Reaction), PEP (Primer Extension

33 Preamplification), linker-adaptor ligation based WGA en MDA (Multiple Displacement Amplification) of meervoudige verdringingsamplificatie. 27 In dit onderzoeksproject wordt er gebruik gemaakt van de GenomiPhi DNA Amplification Kit om de kwantiteit van de stalen te verhogen. Het principe van deze kit is gebaseerd op MDA en maakt gebruik van het phi29 DNA polymerase. Dit polymerase zorgt voor een bijzonder accurate amplificatie dankzij de proofreading activiteit (5-3 exonuclease activiteit). De kit bestaat uit 3 componenten: - Sample buffer: bevat random hexameer primers - Reactiebuffer: bevat deoxynucleotiden - Enzym mix: bevat Phi29 DNA polymerase 27 Via deze methode worden grote hoeveelheden ( g) gdna verkregen uit kleine hoeveelheden (ng). De WGA gebeurt exponentieel en in verschillende stappen zoals weergegeven in Figuur 3.2. Na het samenvoegen van de DNA template en de hexameer primers wordt het DNA gedenatureerd door verhitting. Op die manier kunnen de primers ad random (op verschillende plaatsen) hybridiseren met de template. Het polymerase heeft immers een klein stukje dubbelstrengig DNA nodig voor synthese. Hierna worden de reactiebuffer en de enzym mix toegevoegd. Het staal wordt voor 90 minuten geïncubeerd bij 30 C zodat het enzyme zijn werking kan uitoefenen. Uiteindelijk wordt het enzyme geïnactiveerd door hitte. Het voordeel van phi29 DNA polymerase is dat het enzyme isothermisch werkt. Dit wil zeggen dat het enzyme de amplificatie uitvoert bij een constante temperatuur. Extra denaturatiestappen zijn ook niet nodig omdat het enzyme zelf terug zorgt voor een enkelstrengige template door strengverdringing. 27 Figuur 3.2. toont een overzicht van de procedure van de GenomiPhi V2 DNA amplification kit. De procedure bestaat uit een aantal belangrijke stappen: 1) Hexameer primers binden op verschillende plaatsen op het template DNA. 2) Phi29 DNA polymerase start op verschillende plaatsen met DNA synthese. 3) Het polymerase zet de ketenverlenging voort. 4) Naarmate de ketenverlenging doorgaat, treedt er strengverdringing op. 5) Primers binden op de nieuw gevormde enkelstrengige DNA strengen. 6) Door opeenvolgende cycli van ketenverlenging en strengverdringing worden er grote hoeveelheden dubbelstrengig HMW DNA geproduceerd. 27

34 FIGUUR 3.2.: OVERZICHT VAN DE GENOMIPHI V2 DNA AMPLIFICATION KIT PROCEDURE Procedure Het protocol van de Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit bestaat uit 5 stappen. Stap1: Denaturatie van het template DNA in sample buffer door verhitting. - Meng 1 l van het template DNA (tenminste 10 ng) met 9 l sample buffer. - Verhit tot 95 C voor 3 minuten. - Koel af tot 4 C. Stap 2: Bereiding van de mastermix voor DNA amplificatie. - Maak voor elke amplificatiereactie een mastermix door 9 l reactie buffer bij 1 l enzym mix toe te voegen. Maak deze mastermix op ijs. - Voeg de mastermix bij het afgekoelde staal. Stap 3: Incubatie bij 30 C voor 90 minuten voor DNA amplificatie. Stap 4: Post-amplificatie hitte inactivatie van Phi29 DNA polymerase. - Verhit het staal tot 65 C voor 10 minuten. - Koel af tot 4 C. Stap 5: Opzuivering van de geamplificeerde producten (indien noodzakelijk). 27

35 3.3. REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION Principe De 628 exonen van de 15 doofheidsgenen waarin men mutaties wenst op te sporen, worden geamplificeerd met een real-time PCR reactie. Een PCR reactie bestaat uit drie stappen die bij verschillende temperaturen doorgaan. Eerst wordt het doelwit-dna gedenatureerd bij hoge temperatuur (denaturatie). Vervolgens wordt er geïncubeerd met twee oligonucleotide primers waarmee na hybridisatie primer-template complexen gevormd worden (annealing), die dan als initiatiepunt dienen voor de aanbouw van een complementaire DNA-keten door een DNA polymerase uitgaande van deoxyribonucleotide trifosfaten (extensie). Door deze cyclus meerdere malen te herhalen, wordt een exponentiële vermeerdering bekomen van het DNA-fragment gelegen tussen beide primers. 28 Real-time PCR laat een gelijktijdige amplificatie en kwantificatie van specifieke nucleïnezuursequenties toe. Hiertoe wordt, tijdens elke cyclus van de PCR, de hoeveelheid gegenereerd DNA gemeten aan de hand van een fluorescentiesignaal Procedure De qpcr reacties worden uitgevoerd in een 384-well plaat (2 per staal). LC Green wordt hierbij gebruikt als fluorescente dye. Tabel 3.1. toont de samenstelling van de mastermix voor één 384-well plaat. Om te corrigeren voor het verlies tijdens pipetteren wordt een mastermix bereid voor 450 qpcr reacties (foutmarge van 17,19 %). De primerparen worden afzonderlijk toegevoegd (singleplex PCR). TABEL 3.1.: SAMENSTELLING qpcr MASTERMIX qpcr Mastermix Volume (µl) 1 reactie Eindconcentratie Volume (µl) 450 reacties Kapa Taq 5x buffer 2 1 mm 900 MgCl 2 25 mm 0,4 1 mm 180 dntp's 1 mm 1,2 0,12 mm 540 Kapa Taq polymerase 0,04 18 LC Green 0, gdna 25 ng/µl 1 2,5 ng/µl 450 H 2 O 3, ,5 Primerpaar 1,25 0,125 µm 562,5 Eindvolume In Tabel 3.2. staan de condities van de qpcr reactie weergegeven. Tijdens de pre-incubatie wordt gdna gedenatureerd en het hotstart enzyme Kapa Taq polymerase geactiveerd. De PCR cyclus wordt 40 keer herhaald. Na amplificatie wordt de temperatuur opgedreven tot 95 C om de smelttemperatuur te bepalen.

36 TABEL 3.2.: qpcr CONDITIES Temperatuur Tijd Pre-incubatie 95 C 5' Amplificatie 94 C 30'' 58 C 30'' 72 C 50'' Melting 65 C > 95 C 5'' 3.4. POOLEN VAN DE AMPLICONS Principe Na het uitvoeren van de qpcr reacties worden de amplicons uit de qpcr-platen gepipetteerd en per staal samengevoegd in een 1,5 ml epje. Opdat van elk amplicon dezelfde hoeveelheid zou aanwezig zijn in de pool, wordt er genormaliseerd voor de Rfu-waarde. Op deze manier wordt equimolariteit van de amplicons nagestreefd, wat van primordiaal belang is voor de uiteindelijke sequencing Procedure In eerste instantie wordt de gemiddelde Rfu-waarde voor elk van de stalen berekend. Voor deze gemiddelde Rfu-waarde wordt gekozen om een volume van 1 l te poolen. Het te poolen volume van elk amplicon wordt voor elk van de amplicons in Excel berekend met onderstaande formule: Gemiddelde Rfu-waarde van het staal Rfu-waarde van het amplicon x 1 l = te poolen volume (in l) van het amplicon De amplicons worden manueel gepipetteerd in een epje van 1,5 ml. Een 15-tal amplicons worden niet gepooled. De reden daarvoor is ofwel een slechte qpcr reactie ofwel te lange amplicons CONCENTRATIEMETING VAN DE POOLS MET DE QUANT-IT TM PICOGREEN DS DNA KIT Principe In deze stap wordt de DNA-concentratie van de 5 pools gemeten met de Quant-iT TM PicoGreen dsdna Kit. Het principe van de kit steunt op fluorimetrie. Dubbelstrengig DNA wordt fluorescerend gemaakt door gebruik te maken van Picogreen, een kleurstof die bindt aan de kleine groeve van dsdna. Picogreen levert op deze wijze een directe methode voor kwantificering van dubbelstrengig DNA. 29 Zoals dit het geval is bij veel andere kwantitatieve technieken, moet men bij fluorimetrie een kalibratie uitvoeren, dit is een ijklijn opstellen. De ijklijn wordt opgesteld met standaarden met een gekende concentratie dsdna. Door gebruik te maken van interpolatie kan de concentratie van het staal bepaald worden, na meting van de intensiteit van fluorescentie van het staal. De intensiteit van fluorescentie wordt gemeten met een fluorescence microplate reader.

37 Procedure Voorbereiding In deze stap worden de 1xTE buffer, het PicoGreen Reagens, de standaarden voor het opstellen van de ijklijn en (eventuele) verdunningen van de stalen klaargemaakt. 1xTE buffer 1. Leng 1 ml 20xTE aan met 19 ml steriel, gedestilleerd DNAse-vrij water (1/20 verdunning). 2. Vortex. PicoGreen Reagens 1. Laat het Quant-iT TM PicoGreen reagens op kamertemperatuur komen voor 15 minuten. 2. Leng 10 l Quant-iT TM PicoGreen reagens aan met 1990 l TE buffer (1/200 verdunning). 3. Vortex. Het PicoGreen Reagens wordt klaargemaakt in een plastic tube omdat PicoGreen kan adsorberen aan glas. Het PicoGreen Reagens wordt ten allen tijde afgeschermd van licht (met aluminiumfolie) omdat PicoGreen onderhevig is aan fotodegradatie. Standaarden voor ijklijn Uitgaande van een Lambda DNA standaardoplossing (100 g/ml in TE), worden twee stockoplossingen gemaakt met een concentratie van respectievelijk 2 g/ml en 20 ng/ml. 2 g/ml stockoplossing 1. Leng 20 l van de Lambda DNA standaardoplossing aan met 980 l TE buffer (1/50 verdunning van de Lambda DNA standaardoplossing). 2. Vortex. 20 ng/ml stockoplossing 1. Leng 10 l van de 1/50 verdunning (2 g/ml stockoplossing) aan met 990 l TE buffer (1/100 verdunning van de 2 g/ml stockoplossing). 2. Vortex. Verdunningen van de stalen De ijklijn heeft een lineair dynamisch bereik tussen 0 ng/ l en 30 ng/ l. Om te verzekeren dat de concentratie van de 5 pools tussen deze grenzen valt, wordt een 1/10 en 1/100 verdunning bereid van de 5 pools. 1/10 verdunning 1. Leng 2 l van elk staal aan met 18 l TE buffer. 2. Vortex.

38 1/100 verdunning 1. Leng 2 l van de 1/10 verdunning van elk staal aan met 18 l TE buffer. 2. Vortex Quant-it Picogreen meting dsdna Negen ijklijnpunten Er wordt een ijklijn opgesteld met 9 standaarden. De standaarden hebben een concentratie gaande van 0 ng/ l tot 30 ng/ l. De standaarden worden rechtstreeks bereid in wells van een 384-well plaat (zie Tabel 3.3.). Hierbij wordt eerst TE-buffer in de wells gepipetteerd en daarna het DNA. De standaarden worden in triplicate bereid en gemeten. De gemiddelde Rfu-waarden worden gebruikt voor het opstellen van de ijklijn. TABEL 3.3.: BEREIDING VAN DE IJKLIJNPUNTEN Hoeveelheid DNA Volume ( l) van DNA stockoplossingen 0 ng 0 l 50 l 0,25 ng 12,5 l van 20 ng/ml 37,5 l 0,5 ng 25 l van 20 ng/ml 25 l 1 ng 50 l van 20 ng/ml 0 l 5 ng 2,5 l van 2 g/ml 47,5 l 10 ng 5 l van 2 g/ml 45 l 15 ng 7,5 l van 2 g/ml 42,5 l 20 ng 10 l van 2 g/ml 40 l 30 ng 15 l van 2 g/ml 35 l Volume ( l) van TE-buffer Te meten stalen Van elk onverdund staal, elke 1/10 verdunning en elke 1/100 verdunning wordt 1 l gepipetteerd in een well van de 384-well plaat, na het pipetteren van 49 l TE-buffer in de wells. Toevoegen van PicoGreen Reagens Het is heel belangrijk dat het PicoGreen Reagens pas op het einde (dit wil zeggen vlak voor de fluorescentiemeting) wordt toegevoegd, zowel voor de standaarden als voor de te meten stalen. Na deze stap is in elke well een volume van 100 l aanwezig. 1. Voeg aan elke well 50 l PicoGreen Reagens toe. 2. Centrifugeer de 384 well-plaat. 3. Incubeer voor 2-5 minuten bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht.

39 Fluorescentiemeting Voor de fluorescentiemeting wordt gebruik gemaakt van de fluorescence microplate reader Fluostar optima, waarin de 384-well plaat wordt geladen. Na opstarten van de software Fluostar Optima (administrator ok) dient de volgende procedure te worden gevolgd: 1. Setup: reader configuration => fluorescentie => ok 2. Test setup: test protocol => picogreen: dubbelklikken => layout => stalen en standaarden ingeven => ok 3. Measure: Select protocol picogreen => ok => gain adjustment (op hoogste standaard) => ok => start measurement => results => raw data 3.6. OPZUIVERING VAN PCR PRODUCTEN QIAquick PCR Purification Kit Om de PCR producten op te zuiveren wordt gebruik gemaakt van de QIAquick PCR Purification Kit. DNA fragmenten met een lengte van 100 bp tot 10 kb adsorberen aan een silicamembraan van een QIAquick spin kolom in de aanwezigheid van een hoge zoutconcentratie, terwijl contaminanten zoals primers, nucleotiden, polymerasen en zouten verwijderd worden. Het DNA wordt geëlueerd met Tris Buffer of water. De maximale bindingscapaciteit van de kolom bedraagt 10 g. Het reservoir van de kolom heeft een capaciteit van 800 l. 30

40 Principe De adsorptie van DNA aan een QIAquick membraan is zout- en ph- afhankelijk. DNA bindt op silica in de aanwezigheid van chaotropische zouten. Deze zouten veranderen de structuur van water. Ze verminderen de hydrofiliciteit van water door waterstofbruggen, die moleculen in water vormen, te verbreken. Ze veroorzaken ook een denaturatie van het DNA. Door deze effecten kan het DNA binden op silica. Dit is een specifiek bindingsproces waardoor DNA gescheiden kan worden van onzuiverheden. De adsorptie van DNA aan silica hangt ook af de ph. 95 % van het DNA adsorbeert aan silica als de ph 7.5. Dit reduceert drastisch bij hogere ph (zie Figuur 3.3.). Gedurende de adsorptie van DNA aan de silicamembraan zullen primers en andere onzuiverheden zoals zouten, enzymen en nucleotiden niet binden aan de silicamembraan maar doorheen de kolom vloeien. Zouten worden weggewassen door een wasstap met Buffer PE die ethanol bevat. Residuen van Buffer PE, die kunnen interfereren bij een enzymatische reactie, worden verwijderd door een additionele centrifugatiestap. In een laatste stap wordt het DNA geëlueerd. De efficiëntie van elutie hangt sterk af van de zoutconcentratie en de ph van de elutiebuffer. In tegenstelling tot adsorptie, is elutie het meest efficiënt bij een basische ph en lage zoutconcentratie. DNA wordt geëlueerd met 50 of 30 l Buffer EB (10 mm Tris-Cl, ph 8.5) of water. 30

41 FIGUUR 3.3.: PH-AFHANKELIJKHEID VAN DE ADSORPTIE VAN DNA AAN DE QIAQUICK MEMBRAAN Procedure Van elke pool wordt 400 l opgezuiverd. Hiervoor worden er 4 kolommen gebruikt per pool, waarmee telkens 100 l pool wordt opgezuiverd. Belangrijke opmerkingen voor het starten van de procedure: - Voeg ethanol (96-100%) toe aan Buffer PE voor gebruik. - Voer alle centrifugatiestappen uit bij 17,900 x g (13,000 rpm) in een standaard microcentrifugator bij kamertemperatuur. - Er wordt geen ph indicator gebruikt omdat deze mogelijks kan storen bij een enzymatische reactie. Dit levert normaal geen problemen op aangezien er 5 volumina PE Buffer worden toegevoegd met de juiste ph Voeg 5 volumes PB Buffer toe aan 1 volume PCR product. Vortex kort om te mengen. 2. Plaats de QIAquick spin kolom in een 2 ml collection tube. 3. Pipetteer het DNA staal over in de QIAquick spin kolom en centrifugeer voor seconden om het DNA te binden op de membraan. 4. Verwijder de flow-through uit de collection tube. Plaats de QIAquick spin kolom terug in dezelfde collection tube. 5. Voeg 750 l Buffer PE toe aan de QIAquick spin kolom en centrifugeer voor seconden. 6. Verwijder de flow-through uit de collection tube. Plaats de QIAquick spin kolom terug in dezelfde collection tube. Centrifugeer de kolom voor 1 minuut. 7. Plaats de QIAquick kolom in een nieuw 1,5 ml microcentrifuge buisje. 8. Voeg, om het DNA te elueren, 50 l Buffer EB (10 mm Tris-Cl, ph 8.5) of water (ph ) toe in het midden van de QIAquick membraan en centrifugeer de kolom voor 1 minuut. Controleer of het gemiddelde volume van het eluaat ongeveer 48 l bedraagt. 30

42 3.7. END-REPAIR Principe De End-It TM DNA End-Repair Kit (Epicentre Biotechnologies) wordt gebruikt om DNAfragmenten met een 5 - of 3 - enkelstrengige overhang om te zetten in DNA-fragmenten met blunt ends voor ligatie (zie Figuur 3.4.). 31 FIGUUR 3.4.: DE END-IT TM DNA END-REPAIR REACTIE 31 De end-repair reactie is standaard een 50 l reactie waarbij 5 g DNA blunt end kan gemaakt worden. 31 Om economische redenen worden de pools in eerste instantie aangeconcentreerd met een vacuümcentrifuge RC1010. Na aanconcentratie wordt de DNA concentratie van de vijf pools bepaald met een Nanodropmeting. Van elke pool wordt 5 g blunt end gemaakt Procedure Aanconcentratie met vacuümcentrifuge RC Open de centrifuge. 2. Plaats de epjes met open deksel in de centrifuge. 3. Zet de vacuümpomp aan. 4. Druk op de I/O knop (groen) van de centrifuge. 5. Druk op de startknop (zwart) van de centrifuge. 6. Stel de temperatuur in op 50 C d.m.v. de oranje verwarmingsknop en de zwarte regelaar. 7. Sluit de centrifuge. 8. Centrifugeer tot het volume in de epjes voldoende gereduceerd (± 45 minuten) is. 9. Druk op de stopknop (zwart). 10. Schakel de vacuümpomp uit. 11. Druk op de I/O knop van de centrifuge Concentratiemeting met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer a) Principe Dubbelstrengig DNA vertoont een maximale absorptie bij 260 nm. In een spectrofotometer wordt het staal blootgesteld aan UV licht met een golflengte van 260 nm waarna een fotodetector de transmissie meet. Hoe meer licht het staal absorbeert, hoe hoger de DNA concentratie in het staal.

43 Met behulp van de Wet van Lambert Beer kan de hoeveelheid geabsorbeerd licht gerelateerd worden aan de DNA concentratie in het staal. 32 De NanoDrop 1000 Spectrofotometer maakt het mogelijk om kleine staalvolumes (1 µl) te analyseren. Het staal wordt gepipetteerd in het onderste contactpunt, waarna het toestel wordt gesloten (sampling arm naar beneden). Op die manier wordt de druppel samengedrukt en vormt het staal als het ware een kolom die door de oppervlaktespanning op zijn plaats wordt gehouden (zie Figuur 3.5.). In tegenstelling tot een klassieke spectrofotometer zijn er geen cuvetten nodig, wat een snelle reiniging toelaat. 33 FIGUUR 3.5.: KOLOMVORMING OP DE NANODROP 1000 SPECTROFOTOMETER 33 De opname van het absorptiespectrum (tussen 220 nm 750 nm) gebeurt bij een weglengte van 10 mm. De analyse gebeurt door het NanoDrop 1000 software pakket. 33 b) Procedure 1. Open de software Nanodrop 1000 en selecteer nucleic acid. 2. Reinig het toestel (de contactpunten) met een vezelvrij doekje (Kimwipes). 3. Laad 1,5 l sigmawater. 4. Klik op OK. 5. Selecteer DNA 50 bij sample type. 6. Reinig het toestel. 7. Laad 1,5 l elutiebuffer (Buffer EB). 8. Klik op blank. 9. Inspecteer de basisabsorptielijn. 10. Reinig het toestel. 11. Laad 1,5 l elutiebuffer (Buffer EB) en typ bij sample ID: BLANK. 12. Klik op measure. 13. Reinig het toestel. 14. Laad 1,5 l van het staal. Typ bij sample ID de naam van het staal. Klik op measure. Reinig het toestel na de meting. 15. Meet de volgende stalen. 16. Laad, ter controle, nogmaals 1,5 l elutiebuffer (Buffer EB). Typ bij sample ID: BLANK. Klik op measure. 17. Klik op Show Report voor een overzicht van de resultaten van de metingen. 18. Klik op Plots om de absorptiespectra te bekijken. 33

44 End-repair reactie 1. Voeg de volgende componenten bij elkaar in een microcentrifuge tube en meng: 1-34 l DNA (5 g) 5 l 10x End-Repair Buffer 5 l dntp Mix 5 l ATP x l steriel water tot een reactievolume van 49 l 1 l End-Repair Enzyme Mix 50 l (totaal reactievolume) 2. Incubeer bij kamertemperatuur voor 45 minuten. 3. Stop de reactie door te verhitten tot 70 C voor 10 minuten. 31 Maak hiervoor gebruik van de C1000 TM Thermal Cycler (Biorad). - Open het toestel. - Draai in tegenwijzerszin aan de schroef om het deksel naar omhoog te brengen. - Plaats de epjes in het toestel. - Sluit het toestel. - Druk op Incubate. - Stel de temperatuur in op 70 C. - Stel de lid temperatuur in op 105 C om condensatie tegen te gaan. - Klik op Run. - Incubeer voor 10 minuten. - Klik op Cancel Run om de incubatie te beëindigen LIGATIE Principe Voor de ligatie van DNA-fragmenten wordt gebruik gemaakt van de Fast-Link TM DNA Ligation Kit (Epicentre Biotechnologies). Deze ligatiekit is eigenlijk bedoeld voor vectorligatie. De End-It TM DNA End-Repair Kit en de Fast-Link TM DNA Ligation Kit zijn op elkaar afgestemd, wat toelaat om zonder tussenstappen (opzuivering) over te gaan van de end-repair kit naar de ligatiekit. 34 In de Fast-Link TM DNA Ligation Kit wordt ongeveer 0,4 pmol DNA als inputhoeveelheid gebruikt voor de ligatiereactie. Na de end-repair reactie bekomt men voor elke pool 5 g DNA in een volume van 50 l. 5 g DNA met een lengte van gemiddeld 500 bp komt overeen met 16,45 pmol DNA. De inputhoeveelheid DNA is in dit experiment dus veel hoger (> 40 x). Het is niet zeker dat de ligatiereactie met dergelijk hoge inputhoeveelheden nog efficiënt zal doorgaan. Daarom wordt de ligatiereactie eerst getest met 3 verschillende inputhoeveelheden DNA. Deze test wordt in het dubbel uitgevoerd, nl. op de stalen hl ir2 35 en hl ir2 27. Voor elk van deze twee stalen worden 3 ligatiereacties uitgevoerd, nl. met 1 l, 10 l en 39 l als DNA inputvolume. Dit komt overeen met respectievelijk 0,3 pmol, 3 pmol en 11,7 pmol DNA. Op deze manier wordt de ligatiereactie getest met drie rangen aan input DNA:

45 - 0,3 pmol DNA: dit benadert de inputhoeveelheid DNA van de kit - 3 pmol DNA: ± 10 x de inputhoeveelheid DNA van de kit - 11,7 pmol DNA: ± 30 x de inputhoeveelheid DNA van de kit De ligatiereactie is standaard een 15 l reactie. 34 Voor de ligatiereactie met 39 l DNA vindt eerst een aanconcentratie plaats met een vacuümcentrifuge RC1010 (± 15 minuten) Procedure Aan het protocol worden twee modificaties aangebracht. De efficiëntie van de ligatiereactie is hoger als men de reactie incubeert bij lagere temperatuur (bij 16 C i.p.v. kamertemperatuur zoals het protocol voorschrijft) en als men de reactie langer laat doorgaan (4 uur i.p.v. 5 minuten zoals het protocol voorschrijft). 1. Voeg de volgende componenten bij elkaar in een microcentrifuge tube bij kamertemperatuur en meng: 1.5 l 10x Fast-Link Ligation Buffer 0.75 l 10 mm ATP x l DNA x l steriel water tot een volume van 14 l 1 l Fast-Link DNA Ligase 15 l (totaal reactievolume) 2. Incubeer de reactie voor 4 uur bij 16 C. 3. Inactiveer het Fast-Link DNA Ligase door te verhitten tot 70 C voor 15 minuten. 34 Maak voor stap 2 en 3 gebruik van de C1000 TM Thermal Cycler (Biorad). Schrijf voor de incubatie van de ligatiereactie een nieuw programma. - Open het toestel. - Draai in tegenwijzerszin aan de schroef om het deksel naar omhoog te brengen. - Plaats de epjes in het toestel. - Sluit het toestel. - Klik op New Protocol (F4). - Geef het protocol een naam: LIGATIE 4 UUR. - Stel het volume in: 15 l. - Geef het volgende programma in: 16 C voor 4 uur 70 C voor 15 minuten 4 C forever - Stel de lid temperatuur in op 20 C. - Klik op Save File Library. - Klik op Run. - Klik na de run op Cancel Run om de incubatie te beëindigen.

46 3.9. KWALITEITSCONTROLE VAN DE LIGATIE MET QPCR Principe De efficiëntie van de ligatiereacties wordt nagegaan door middel van een qpcr reactie van de ligatiesite. Om de ligatiesites te amplificeren wordt gebruik gemaakt van het reverse complement van de forward en backward amplicon primers (zie Figuur 3.6.). FIGUUR 3.6.: REVERSE COMPLEMENT PRIMERS Met reverse complement primers kan zowel goede ligatie (zie Figuur 3.7.) als slechte ligatie, nl. autoligatie (zie Figuur 3.8.), gedetecteed worden. FIGUUR 3.7.: GOEDE LIGATIE FIGUUR 3.8.: SLECHTE LIGATIE

47 Procedure De kwaliteitscontrole van de ligatiereacties met verschillende DNA inputhoeveelheden verloopt in verschillende stappen. Deze zijn achtereenvolgens: - Stap 1: Primerselectie. - Stap 2: In oplossing brengen van de gelyofiliseerde primers. - Stap 3: Maken van werkoplossingen van de primers. - Stap 4: Maken van primercombinaties. - Stap 5: Maken van mastermixen. - Stap 6: Toevoegen van primercombinaties aan de mastermixen. - Stap 7: Uitvoeren van de qpcr reacties. - Stap 8: Analyse van de resultaten van de qpcr reacties. Stap 1: Primerselectie. In eerste instantie worden 24 amplicon primerparen geselecteerd met een maximale variatie in ampliconlengte, Rfu-waarde en Ct-waarde. Hiervoor worden de amplicons van hoog naar laag gerangschikt in Excel volgens lengte, Rfu-waarde en Ct-waarde. Uit elk van deze rangschikkingen worden telkens 8 primerparen geselecteerd (om de 78 amplicons = 628 amplicons/8). Met behulp van een computerprogramma wordt vervolgens het reverse complement van de geselecteerde forward en backward amplicon primers bepaald (zie Bijlage 3). Het reverse complement van deze 48 primers wordt besteld bij Biolegio. De primers worden geleverd in gelyofiliseerde toestand. Stap 2: In oplossing brengen van de gelyofiliseerde primers. Er wordt een stockoplossing gemaakt van 250 M. 1. Vermenigvuldig het aantal nmol primer met 4. Dit is het aantal l water toe te voegen aan gelyofiliseerde primer om een stockoplossing te bekomen van 250 M. 2. Vries de stockoplossingen in. Stap 3: Maken van werkoplossingen van de primers. Er worden werkoplossingen gemaakt van 40 M. De werkoplossingen worden rechtstreeks bereid in de wells van een 96-well plaat. In Bijlage 4 staat een schematische voorstelling weergegeven van de 96-well platen met de forward primers en backward primers. De forward en backward primers zijn aangeduid met een letter (zie Bijlage 5). In de 96-well plaat met de backward primers worden vier permutaties gebruikt. 1. Label de primers (zie Tabel 5.1. uit Bijlage 5). 2. Ontdooi de primers bij kamertemperatuur. 3. Vortex goed.

48 4. Pipetteer 21 l water in elke well van beide 96-well platen. 5. Voeg 4 l primer toe volgens Figuur 4.1. en 4.2. uit Bijlage Label twee seals. 7. Seal beide 96-well platen. 8. Vortex beide 96-well platen. 9. Centrifugeer beide 96-well platen kort. Stap 4: Maken van primercombinaties. De primercombinaties worden gemaakt met een pipetteerrobot (TECAN) vanuit twee 96-well platen met de werkoplossingen van de forward en backward primers. Het hiervoor gebruikte script is Primer combination. Dit script wordt gebruikt om twee 96-well platen te combineren en laat een permutatie toe van de forward en de backward primer. Door de TECAN robot laten we de forward en backward primers op drie manieren combineren, waardoor er in totaal 12 permutaties ontstaan. Dit resulteert in drie 96-well platen, nl. een offset 0 plaat, offset 4 plaat en offset 8 plaat met in totaal 288 (3 x 96) unieke primercombinaties (zie Bijlage 6). Stap 5: Maken van de mastermixen. Op elk van de 3 ligatiereacties met als relatieve DNA inputconcentratie 1, 10 en 39 worden 288 qpcr reacties uitgevoerd (3 x 96 primercombinaties). Dit gebeurt voor beide stalen. Concreet worden 6 mastermixen bereid met DNA afkomstig van 6 ligatiereacties. Voor de qpcr reacties wordt gebruik gemaakt van de ready made kit PCR mastermix 2x SYBR Green. Hieraan dienen enkel nog de primers, DNA en water te worden toegevoegd. Bij de berekening van het volume mastermix voor 288 qpcr reacties wordt een foutmarge van 15 % gebruikt (zie Tabel 3.4.). TABEL 3.4.: QPCR MASTERMIX qpcr Mastermix Volume (µl) 1 reactie Eindconcentratie Volume (µl) 288 reacties Buffer 2x 2,50 1x 828,00 F primer 2,5 µm 0,50 0,25 µm 165,60 R primer 2,5 µm 0,50 0,25 µm 165,60 DNA (1/1000 verdunning) 1,00 2 ng/µl 331,20 H 2 O 0,50 165,60 Eindvolume Ontdooi de geligeerde stalen hl ir2 27 met als relatieve DNA inputconcentratie Vortex kort en centrifugeer. 3. Maak een 1/1000 verdunning van elk staal. Label 3 epjes en pipetteer 999 l sigmawater in elk epje. Voeg vervolgens 1 l staal toe. Vortex kort en centrifugeer. 4. Label 3 epjes. Hierin worden de mastermixen bereid. 5. Ontdooi de buffer, dit is PCR mastermix 2x SYBR Green (lichtgevoelig). 6. Pipetteer in elk epje 828 l buffer. 7. Pipetteer in elk epje 165,60 l sigmawater.

49 8. Pipetteer 331,20 l DNA van de bereide 1/1000 verdunningen in de epjes. 9. Vortex kort en centrifugeer. 10. Herhaal stappen 1 tot en met 9 voor staal hl ir2 35. Het uitverdelen van elke mastermix over 96 wells van een 384-well plaat gebeurt met de TECAN robot. Het hiervoor gebruikte script is Mastermix test. Met dit script kunnen maximaal 4 mastermixen verdeeld worden over een 384-well plaat. In dit experiment zijn dit drie mastermixen. Elke mastermix wordt eerst manueel uitverdeeld over 8 wells (zie Bijlage 7), aangezien de TECAN robot volgens het script vertrekt vanuit 8 wells van een 96-well plaat. Het volume dat in elk van de 8 wells moet gepipetteerd worden, wordt als volgt berekend: het totale volume mastermix wordt verminderd met het volume van de primers en vervolgens gedeeld door 8 ((1656 l 165,6 l 165,6 l) / 8 = 165,6 l). Om te corrigeren voor het verlies tijdens pipetteren, wordt 165,6 l afgerond naar 160 l. 11. Pipetteer 160 l van de mastermix in 8 wells van een 96-well plaat. 12. Doe hetzelfde voor de 2 andere mastermixen in de kolommen ernaast. 13. Label een seal. 14. Seal de 96-well plaat. 15. Vortex kort. 16. Centrifugeer kort. Stap 6: Toevoegen van primercombinaties aan de mastermixen. De primers worden toegevoegd aan de mastermixen met de TECAN robot. Hiervoor wordt het script Mastermix test gebruikt. In het eerste deel van het script pipetteert de TECAN robot de mastermixen uit de 96-well plaat (zie Bijlage 7) in de 384-well qpcr plaat (zie Bijlage 8). Vervolgens worden de primers uit primerplaat offset 0 toegevoegd aan de mastermixen. Dit gebeurt in 3 pipetteerbewegingen, één voor elke mastermix. Stap 7: Uitvoeren van de qpcr reacties met de Lightcycler 480 van Roche. Voor de qpcr reacties wordt het Eurogentec protocol gebruikt. In Tabel 3.5. staan de condities van dit protocol weergegeven. TABEL 3.5.: QPCR CONDITIES Temperatuur Tijd Pre-incubatie 95 C 5' Amplificatie 95 C 10'' 60 C 45'' 72 C 1'' Melting 60 C > 95 C 5'' Stap 8: Analyse van de resultaten van de QPCR reacties. De resultaten worden statisch verwerkt met het programma R.

50 3.10. KWALITEITSCONTROLE VAN DE LIGATIE MET DE AGILENT 2100 BIOANALYZER Principe Om te controleren of het geligeerd product hoog moleculair is, wordt met de Agilent 2100 Bioanalyzer (zie Figuur 3.9.) een run uitgevoerd. Hiervoor wordt de Agilent High Sensitivity DNA kit (zie Figuur 3.10.) gebruikt. Met deze kit is kwantificatie en scheiding van DNA-fragmenten volgens grootte mogelijk voor DNA stalen met een concentratie in de pg/ l range (5-500 pg/ l). Op een High Sensitivity DNA chip kunnen er maximaal 11 stalen geladen worden. 35 FIGUUR 3.9.: AGILENT 2100 BIOANALYZER 35 De werking van de Agilent 2100 bioanalyzer berust op capillaire gelelektroforese, waarmee DNA-fragmenten gescheiden worden volgens grootte. Agilent DNA kits bevatten chips en reagentia voor het analyseren van DNA-fragmenten. Een Agilent DNA chip bestaat uit een netwerk van microkanalen en reservoirs. Door de kanalen met een gelmatrix te vullen en de reservoirs met staal, is er elektroforese mogelijk op miniatuurschaal. Er is slechts 1 l staal nodig per analyse. De reagentia van de kit zijn: - DNA ladder - DNA markers - DNA dye concentrate - DNA Gel Matrix Procedure FIGUUR 3.10.: AGILENT HIGH SENSITIVITY DNA KIT 35 Stap 1: Decontamineren van de elektroden 1. Vul een van de wells van de elektrode cleaner met RNaseZap. 2. Open de klep van de Agilent 2100 Bioanalyzer en plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer. 3. Sluit de klep en laat ze gedurende 1 min dicht. 4. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner.

51 5. Vul een van de wells van een andere electrode cleaner met RNase-vrij water. 6. Plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer. 7. Sluit de klep en laat het gedurende 10 sec. dicht. 8. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner. Stap 2: Aanmaken van een gel-dye mix. De gel-dye mix heeft een houdbaarheidstermijn van 1 maand. 1. Laat het dye concentraat en de gel matrix gedurende 30 minuten op kamertemperatuur equilibreren. 2. Voeg 15 l van het dye concentraat toe aan de gel matrix. 3. Vortex goed en breng het mengsel over in een spin filter. 4. Centrifugeer het mengsel aan 2240 g gedurende 10 minuten. 5. Bescherm de oplossing van licht en bewaar de oplossing bij 4 C. Stap 3: Laden van de gel-dye mix. 1. Breng een nieuwe High Sensitivity DNA chip in het Chip Priming Station. 2. Pipetteer 9,0 l van de gel-dye mix in de well gemarkeerd met. 3. Sluit het Chip Priming Station. Zorg ervoor dat de duiker van de spuit op 1 ml staat. 4. Druk de hendel aan totdat de clip van de spuit vastzit. 5. Wacht gedurende 60 seconden en laat de clip dan los. 6. Wacht nog 5 seconden en breng dan de duiker van de spuit langzaam terug op 1 ml. 7. Open het Chip Priming Station en pipetteer 9,0 l van de gel-dye mix in de wells die aangeduid zijn met. Stap 4: Laden van de merker. 1. Pipetteer 5 µl van de merker in alle sample wells en de well gemarkeerd met een ladder. Stap 5: Laden van de stalen en de ladder. 1. Pipetteer 1 l van de DNA ladder in de well gemarkeerd met een ladder. 2. Pipetteer 1 l sample in één van de 11 wells (6 gebruikte wells). 3. Pipetteer 1 l merker in elke ongebruikte well (5 ongebruikte wells). 4. Vortex de chip gedurende 1 minuut aan 2400 rpm. 5. Run de chip in de Agilent 2100 Bioanalyzer binnen de 5 minuten. Stap 6: Reinigen van de Agilent 2100 Bioanalyzer 1. Vul een van de wells van een andere electrode cleaner met RNase-vrij water. 2. Plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer. 3. Sluit de klep en laat het gedurende 10 s dicht. 4. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner. 35

52 3.11. SIZE SELECTIE Om alle niet-geligeerde amplicons, autoligaten en laag moleculaire ligatieproducten te verwijderen uit de ligatiereactie, dient er een opzuivering te gebeuren. Concreet wensen we de hoog moleculair geligeerde DNA-fragmenten (> 600 basenparen) op te zuiveren uit de ligatiereactie. Hiervoor worden 2 strategieën getest, nl. de Double SPRI methode en de Chroma Spin 1000 kolom. Staal hl ir2 27-1, en worden opgezuiverd met de Double SPRI methode, staal hl ir2 35-1, en met een Chroma Spin 1000 kolom Double SPRI methode Principe Met de Double SPRI methode is opzuivering mogelijk van DNA-fragmenten boven een bepaalde cut-off size. Deze techniek is gebaseerd op Solid Phase Reversible Immobilization of SPRI: met-carboxyl-gecoate magnetische partikeles (AMPure beads) binden DNA in aanwezigheid van een hoge concentratie polyethyleenglycol (PEG). De binding is te wijten aan een dehydratatie- of precipitatiereactie. Door het sterker hydrofiel karakter van PEG daalt het aantal watermoleculen rond de negatief geladen beads en DNA waardoor de DNA-fragmenten precipiteren op de beads. Deze binding is reversibel. Met een oplossing met lage zoutconcentratie kunnen de DNA-fragmenten geëlueerd worden van de beads. 36,37 In Figuur staat de procedure van de Double SPRI Methode schematisch weergegeven. Beads worden toegevoegd aan het DNA sample en DNA-fragmenten binden aan de beads. Wanneer DNA-fragmenten boven een bepaalde cut-off size gebonden zijn aan de magnetische AMPure beads, worden de beads aan de wand aangeconcentreerd met behulp van een Magnetic Particle Concentrator (MPC). Het ongebonden laag moleculair DNA wordt weggewassen met ethanol. DNAfragmenten boven een bepaalde cut-off size worden geëlueerd met een waterige oplossing. 38 FIGUUR 3.11.: DOUBLE SPRI METHODE 38 De cut-off size van AMPure beads is concentratie-afhankelijk en varieert van lot tot lot zodat de bead/dna ratio (vol:vol) zeer strikt moet gecontroleerd worden. Indien de bead/dna ratio te laag is, zullen enkel de zeer lange DNA-fragmenten weerhouden worden op de beads. Bij een te hoge bead/dna ratio zullen ook de kortere DNA-fragmenten binden aan de AMPure beads. 39

53 Om de size exclusie eigenschappen van een bepaald lot met AMPure beads te bepalen, wordt een kalibratie uitgevoerd. Deze kalibratie dient maar één keer te gebeuren, nl. bij het eerste gebruik van een bepaald lot AMPure beads. Bij later gebruik van hetzelfde lot, mogen de resultaten van deze kalibratie gehanteerd worden om de size selectie uit te voeren. 39 In de kalibratie wordt een 100 bp DNA ladder geïncubeerd met verschillende volumina AMPure beads. De range van de bead/dna ratio s gaat van 0.5:1 tot 1:1 (vol:vol). Elke bead/dna ratio resulteert in een unieke cut-off size. Deze cut-offs worden verkregen door het DNA dat weerhouden wordt op de beads te laden op een Agilent BioAnalyzer DNA 7500 Labchip. Finaal kan uit deze kalibratie de optimale bead/dna ratio (vol:vol) afgeleid worden om de gewenste cut-off size te bereiken Procedure a) Kalibratie AMPure beads 1. Label elf eppendorf tubes (nodig voor elf bead/dna verhoudingen). 2. Verdun de 100 bp DNA ladder: 48 l ladder l water. 3. Verdeel nauwkeurig 100 l van de verdunde ladder over de elf eppendorf tubes. 4. Vortex de AMPure beads en alliquoteer 900 l in een nieuwe eppendorf. 5. Voeg volgende volumes beads bij de tubes toe (zie Tabel 3.6.). Let op: tussen elke pipetteerstap moeten de AMPure beads opnieuw gevortext worden. TABEL 3.6.: KALIBRATIE VAN AMPURE BEADS Bead/DNA verhouding Volume ladder ( l) Volume beads ( l) 1 0, , , , , , , , , , , Vortex al de tubes en incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. 7. Met de Magnetic Particle Concentrator worden de beads tegen de wand van de tube geconcentreerd. Dit kan eventjes duren door de hoge viscositeit van het supernatans. 8. Verwijder het supernatans. 9. Was tweemaal met 500 l 70 % ethanol (wacht telkens 30 seconden alvorens de ethanol af te pipetteren). 10. Verwijder het supernatans en laat de epjes drogen op kamertemperatuur.

54 11. Haal de tubes uit de MPC en voeg 10 l 10 mm Tris-HCl, ph 8.0 toe bij elke tube. 12. Vortex tot de beads opnieuw in suspensie zijn. 13. Plaats de tubes opnieuw in de MPC tot het supernatans bead-vrij is. 14. Breng het supernatans over in nieuwe tubes. 15. Verdun 4 l verse DNA ladder met 6 l water (= controle). 16. Breng van elke tube 1 l aan op een DNA 7500 Labchip. 39 Met een Agilent DNA 7500 kit kunnen dubbelstrengige DNA fragmenten met een lengte van 100 tot 7500 bp (DNA 7500) gekwantificeerd en gescheiden worden. 40 Op basis van de resultaten van de Bioanalyzer run, wordt de bead/dna ratio bepaald waarbij de size cut-off 600 bp bedraagt. Met deze bead/dna ratio worden vervolgens de geligeerde stalen met relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39 van staal hl ir2 27 opgezuiverd. b) Size selectie 1. Label 3 eppendorf tubes (nodig voor de 3 geligeerde stalen). 2. Meet het volume van elk staal met een pipet van 100 l. 3. Leng elk staal aan tot 100 l met EB Buffer. 4. Pipetteer elk staal uit in de gelabelde eppendorf tubes. 5. Vortex de AMPure beads en alliquoteer voldoende (nodig voor 3 size selecties) in een nieuwe eppendorf. 6. Voeg aan elk staal het volume AMPure Beads (afgeleid uit kalibratie) toe, vortex en incubeer gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. 7. Concentreer de beads tegen de wand van tube met de Magnetic Particle Concentrator. Dit kan eventjes duren door de hoge viscositeit van het supernatans. 8. Verwijder het supernatans. 9. Was de beads tweemaal met 500 l 70 % ethanol (wacht telkens 30 seconden alvorens de ethanol af te pipetteren). 10. Verwijder het supernatans en laat de epjes drogen bij 37 C. 11. Voeg 24 l 10 mm Tris-HCl, ph 8.0 toe bij elke tube. 12. Vortex tot de beads opnieuw in suspensie zijn. 13. Plaats de tubes opnieuw in de MPC tot het supernatans bead-vrij is. 14. Breng het supernatans over in nieuwe tubes Chroma Spin 1000 kolom Principe Met een Chroma Spin kolom is opzuivering en size selectie van DNA-fragmenten mogelijk. Het principe van een Chroma Spin kolom is gebaseerd op gelfiltratie- of gelpermeatiechromatografie. Chroma Spin kolommen zijn gepakt met een hars. Het hars bestaat uit uniforme microscopische beads van hydrofiel poreus materiaal waardoor selectief bepaalde moleculen, op basis van hun grootte, kunnen worden verwijderd. Moleculen kleiner dan de poriën worden weerhouden in de poriën van de hars. Moleculen groter dan de poriën bewegen snel doorheen de gelmatrix wanneer de kolom kort

55 wordt gecentrifugeerd. Elutie van moleculen vindt plaats volgens dalende grootte: eerste elueren de grootste moleculen van de kolom. De hoogste recovery (> 90 %) wordt bereikt wanneer de moleculen van interesse significant groter zijn dan de poriën van de matrix. De hoogste zuiverheid wordt bereikt (> 90 % aanrijking) wanneer de contaminanten significant kleiner zijn dan de grootte van de poriën. 41 Er bestaan 6 Chroma Spin kolommen met elk een verschillende poriëngrootte. Het getal op het einde van de naam van de kolom is het 50 % retentiepunt. Met de Chroma Spin-10, de kolom met de kleinste poriën, worden 50 % van de DNA-fragmenten van 10 basenparen en kleiner verwijderd. Bovendien zullen kleine moleculen zoals NaCl en dntp s worden verwijderd. Met de Chroma Spin- 1000, de kolom met de grootste poriën, worden 50 % van de DNA-fragmenten 1000 basenparen verwijderd. De vier overige kolommen met intermediaire poriëngrootte, nl. de Chroma Spin-30, -100, 200, en -400, laten toe om proteïnen en DNA-fragmenten met intermediaire grootte te verwijderen. Er is geen bovenlimiet voor de lengte van de DNA-fragmenten die kunnen worden opgezuiverd. 41 In Figuur staat een schema weergegeven van het protocol van de Chroma Spin kolom. In eerste instantie gebeurt er een prespin van de kolom gedurende 5 minuten. Vervolgens wordt het staal geladen op de kolom. Tot slot wordt er opnieuw gecentrifugeerd gedurende 5 minuten waarbij de grootste DNA-fragmenten eerst zullen elueren. 41 FIGUUR 3.12.: SCHEMA VAN HET PROTOCOL VAN CHROMA SPIN KOLOM 42 In dit experiment worden staal hl ir2 35-1, en opgezuiverd met Chroma Spin Met deze kolom worden meer dan 50 % van DNA-fragmenten > 1000 basenparen, meer dan 70 % van DNA-fragmenten > 1350 basenparen en meer dan 90 % van DNA-fragmenten > 2000 basenparen opgezuiverd. DNA-fragmenten < 300 basenparen en proteïnen, zoals enzymen worden weerhouden op de kolom. Als kolombuffer wordt DEPC-water gebruikt. De concentratie van het staal moet lager zijn dan de saturatielimiet van de hars. De optimale concentratierange voor het protocol is 0,02 1,0 g/ l. De concentratie van de 3 stalen staat weergegeven in Tabel 3.7. Bij een te hoge concentratie bestaat het risico dat niet alle moleculen in oplossing zijn, dat er aggregaten worden gevormd of dat de oplossing te viskeus wordt. Hierdoor kan de effectiviteit van de size selectie verminderen.

56 TABEL 3.7.: CONCENTRATIE VAN DE STALEN Staal Concentratie ( g/ l) , , ,26 Het aanbevolen volume staal dat op de kolom wordt geladen is l. Indien het volume staal groter is, is het mogelijk dat kleine moleculen, normaal weerhouden op de kolom, toch elueren. Bij een te laag staalvolume bestaat het risico dat sommige grote moleculen niet elueren. Aangezien het volume van elk staal lager is dan 70 l wordt na het laden van elk staal op de kolom een hoeveelheid buffer geladen op de kolom. De hoeveelheid buffer komt overeen met het verschil tussen het sample volume en het minimum aanbevolen volume Procedure 1. Verwijder de Chroma Spin kolom uit de plastic verpakking en keer de kolom een paar keer om om de gelmatrix te hersuspenderen. 2. Hou de spin kolom recht en breek het break-away end af. 3. Plaats de spin kolom in een 2 ml collection tube. 4. Verwijder de top cap van de kolom. 5. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 minuten. Na centrifugatie is de matrix halfdroog. 6. Plaats de spin kolom in een 2 ml collection tube. 7. Pipetteer voorzichtig en traag het staal centraal op het oppervlak van de gel. 8. Pipetteer vervolgens de buffer op de kolom. 9. Centrifugeer bij 700 x g gedurende 5 minuten. 10. Maak de spin kolom los van de collection tube. Het opgezuiverde staal bevindt zich in de collection tube KWALITEITSCONTROLE VAN DE SIZE SELECTIE MET QPCR Principe De equimolariteit van de amplicons na opzuivering wordt getest met behulp van een qpcr reactie van de ligatiesite met reverse complement primers. Er worden twee qpcr reacties uitgevoerd: één met de 3 DNA stalen opgezuiverd met de AMPure beads en één met de 3 DNA stalen opgezuiverd met de Chroma Spin 1000 kolom Procedure De procedure is analoog aan deze van de kwaliteitscontrole van de ligatiereacties met qpcr (zie ), met dit verschil dat er maar één primerplaat wordt gebruikt, nl. de offset 0 plaat. Er worden 3 mastermixen bereid met DNA afkomstig van de 1/1000 verdunningen van de opzuiverde stalen hl ir2 27-1, -10, -39. Voor de bereiding van de mastermixen wordt gebruik gemaakt van de ready made kit PCR mastermix 2x SYBR Green. Aangezien er maar één primerplaat wordt getest, wordt een volume

57 mastermix bereid voldoende voor 96 qpcr reacties (foutmarge 15 %). De samenstelling van de mastermix staat weergegeven in Tabel 3.8. TABEL 3.8.: QPCR MASTERMIX qpcr Mastermix Volume (µl) 1 reactie Eindconcentratie Volume (µl) 96 reacties Buffer 2x 2,50 1x 276,00 F primer 2,5 µm 0,50 0,25 µm 55,20 R primer 2,5 µm 0,50 0,25 µm 55,20 DNA (1/1000 verdunning) 1,00 2 ng/µl 110,40 H 2 O 0,50 55,20 Eindvolume Van elke mastermix wordt 50 l gepipetteerd in 8 wells van een 96-well plaat ((552 l 55,2 l 55,2 l) / 8 = 55,2 l). Met het script Mastermix test, wordt elke mastermix met de TECAN robot uitverdeeld over 96 wells van een 384-well plaat en worden de primercombinaties van de primerplaat offset 0 toegevoegd aan de mastermixen. De qpcr reacties worden uitgevoerd met de Lightcycler 480 van Roche. In Tabel 3.9. staan de Eurogentec-condities van de qpcr reactie weergegeven. Vervolgens worden de resultaten van de qpcr reacties geanalyseerd. TABEL 3.9.: QPCR CONDITIES Temperatuur Tijd Pre-incubatie 95 C 5' Amplificatie 95 C 10'' 60 C 45'' 72 C 1'' Melting 60 C > 95 C 5'' De volledige procedure wordt herhaald voor de stalen opgezuiverd met de Chroma Spin 1000 kolom (hl ir2 35-1, -10, -39). De resultaten worden statistisch verwerkt met het programma R KWALITEITSCONTROLE VAN DE SIZE SELECTIE MET AGILENT 2100 BIOANALYZER Principe Om na te gaan of het laag moleculair gewicht DNA verdwenen is na opzuivering wordt een Bioanalyzer run uitgevoerd met een High Sensitivity DNA Labchip Procedure zie

58 4. RESULTATEN 4.1. CONCENTRATIEMETING VAN DE POOLS MET DE QUANT-IT TM PICOGREEN DS DNA KIT De DNA concentratie van de 5 pools wordt gemeten met de Quant-iT TM PicoGreen dsdna Kit. In Bijlage 9 staan de resultaten van de fluorescentiemeting weergegeven voor de standaarden (in triplicate). De gemiddelde Rfu-waarden worden voor elk van de standaarden berekend en gebruikt om de ijklijn op te stellen (zie Bijlage 9). De Rfu-waarden van de PicoGreen meting van de 5 stalen (onverdund, 1/10 verdunning en 1/100 verdunning) staan weergegeven in Bijlage 9. Door extrapolatie van de ijklijn worden de DNA concentraties van de stalen berekend. Indien de DNA concentraties van de stalen worden berekend a.d.h.v. de Rfu-waarde van een verdund staal, wordt de bekomen concentratie vermenigvuldigd met de verdunningsfactor (bv. 1/100 verdund staal => concentratie (ng/ l) x 100). De resultaten van deze berekening staan weergegeven in Tabel 4.1. TABEL 4.1.: DNA CONCENTRATIE VAN DE STALEN Stalen Conc onverdund (ng/ l) Conc 1/10 verdunning x10 (ng/ l) Conc 1/100 verdunning x100 (ng/ l) Sh5S1 21,6 17,7 17, ,6 21,8 13, ,4 22,2 13,5 ir227 16,2 16,1 49,1 ir235 15,9 14,0 3,4 Tenslotte wordt de hoeveelheid DNA (ng) die aanwezig is in de pools berekend. Hiervoor worden de concentraties van de 5 pools vermenigvuldigd met het volume van elke pool (800 l). De resultaten van deze berekening staan weergegeven in Tabel 4.2. TABEL 4.2.: HOEVEELHEID DNA IN ELKE POOL Stalen Concentratie (ng/ l) Volume ( l) Hoeveelheid (ng) Sh5S1 17, , , ir227 16, ir235 14, END-REPAIR Concentratiemeting met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer Na opzuivering van 400 l van elke pool met de QIAquick PCR Purification Kit en aanconcentratie met de vacuümcentrifuge RC1010, wordt van elke pool 5 g blunt end gemaakt (maximale inputhoeveelheid voor één end-repair reactie). Hiervoor wordt eerst de DNA concentratie

59 van elke pool gemeten met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer. De resultaten van de Nanodropmeting na opzuivering en aanconcentratie van de pools staan weergegeven in Tabel 4.3. In Bijlage 10 staan de absorptiespectra van deze meting afgebeeld. Het volume dat van elke pool wordt gebruikt in de end-repair reactie staat weergegeven in Tabel 4.4. TABEL 4.3.: CONCENTRATIE VAN DE POOLS NA OPZUIVERING EN AANCONCENTRATIE Sample ID Concentratie (ng/ l) OD 260/280 blanco 0,0 / sh5 S1 222,3 1, ,9 1, ,0 1,83 ir ,3 1,81 ir ,4 1,80 blanco 0,0 / TABEL 4.4.: INPUTVOLUME VAN DE POOLS VOOR DE END-REPAIR REACTIES Sample ID Volume ( l) voor 5 g sh5 S1 22, , ,60 ir ,70 ir , LIGATIE De ligatiereactie wordt getest met drie inputhoeveelheden aan DNA. De test wordt in het tweevoud uitgevoerd, nl. op de stalen hl ir2 35 en hl ir2 27. Voor elk van deze twee stalen worden drie ligatiereacties uitgevoerd, nl. met als relatieve inputconcentratie 1, 10 en Kwaliteitscontrole van de ligatie met qpcr In Figuur 4.1. staan de amplificatiecurves weegegeven van de qpcr reacties van het geligeerde staal hl ir2 27 met relatieve inputconcentratie 1, met de reverse complement primers van primerplaat offset 0. In deze plot is duidelijk te zien dat de amplificatiecurves zich verdelen in twee clusters. De amplicons van de eerste cluster hebben lagere cq-waarden dan deze van de tweede cluster, wat betekent dat de beginconcentratie van de amplicons van de eerste cluster hoger is dan deze van de tweede cluster. Dit kan verklaard worden door het feit dat de eerste cluster zowel autoligaten als nuttige ligaten bevat en de tweede cluster enkel nuttige ligaten.

60 FIGUUR 4.1.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR MET DE PRIMERS VAN OFFSET 0 PLAAT Om dit vermoeden te bevestigen, worden selectief de amplificatiecurves geplot waarbij autoligatie mogelijk is. Autoligatie kan enkel gedetecteerd worden met het reverse complement van de forward en backward primer van hetzelfde amplicon. Met deze primercombinaties kunnen zowel goede ligaten (ligaten van hetzelfde amplicon) als autoligaten opgespoord worden, wat correleert met een lagere cq-waarde. Figuur 4.2. toont het resultaat van deze plot: de eerste cluster van amplificatiecurves uit Figuur 4.1. komt tevoorschijn. FIGUUR 4.2.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR MET REVERSE COMPLEMENT FORWARD EN BACKWARD PRIMERS VAN HETZELFDE AMPLICON VAN OFFSET 0 PLAAT

61 Wanneer de amplificatiecurves worden geselecteerd waarbij enkel nuttige ligatie en dus geen autoligatie mogelijk is, wordt de plot bekomen in Figuur 4.3. Hiervoor maken we gebruik van het reverse complement van een forward en backward primer van een verschillend amplicon. Zoals verwacht stemmen de amplificatiecurves overeen met de tweede cluster amplificatiecurves uit Figuur 4.1. FIGUUR 4.3.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR MET REVERSE COMPLEMENT FORWARD EN BACKWARD PRIMER VAN VERSCHILLEND AMPLICON VAN OFFSET 0 PLAAT Hetzelfde fenomeen treedt op bij de geligeerde stalen hl ir2 27 met relatieve inputconcentratie 10 en 39 en bij de geligeerde stalen hl ir2 35 met relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39. Het optreden van autoligatie is dus reproduceerbaar. Bij de qpcr reacties met primerplaten offset 4 en offset 8 is er geen bimodale clustering van de amplificatiecurves te zien. Dit is te verwachten aangezien in deze primerplaten geen reverse complement primercombinaties van hetzelfde amplicon aanwezig zijn Statistische verwerking van de resultaten met R Voor de statische verwerking van de resultaten van de qpcr reacties wordt gebruik gemaakt van het programma R. Het doel van deze statistiek is om na te gaan of er een relatie is tussen de postligatie cq-waarden en parameters van de amplicons vóór ligatie. Concreet wordt er nagegaan of er een correlatie is tussen: - de cq-waarden na ligatie en de gemiddelde ampliconlengte - de cq-waarden na ligatie en de cq-waarden na amplificatie van de originele amplicons - de cq-waarden na ligatie en de relatieve fluorescentie van de originele amplicons Via scatterplots worden deze al dan niet aanwezige correlaties opgespoord.

62 a) Boxplot van de cq-waarden met relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39 In Figuur 4.4. staan de boxplots weergegeven van de cq-waarden van staal hl ir2 35 met relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39. In de gele boxplots worden telkens de cq-waarden geplot waarbij gebruik wordt gemaakt van reverse complement primers van hetzelfde amplicon, in de groene boxplots deze waarbij gebruik wordt gemaakt van reverse complement primers van een verschillend amplicon. FIGUUR 4.4.: BOXPLOTS VAN DE CQ-WAARDEN BIJ RELATIEVE INPUTCONCENTRATIE 1, 10 EN 39 In deze boxplots is opnieuw een duidelijk onderscheid te zien tussen nuttige ligatie en zelfligatie. Preferentieel treedt nuttige ligatie op, maar er is ook steeds een fractie autoligatie aanwezig. De fractie autoligatie wordt kleiner bij een stijgende inputconcentratie. Dit wordt gereflecteerd in de hogere cq-waarden van autoligatie bij relatieve inputconcentratie 39 in vergelijking met relatieve inputconcentratie 1 en 10. Biologisch kan dit verklaard worden door het feit dat de kans dat een amplicon ligeert aan een andere ligatiepartner dan aan zichzelf, groter is bij een hoge DNA concentratie dan bij een lage DNA concentratie. Als er weinig DNA als input wordt gebruikt, treedt er preferentieel zelfligatie op. Naarmate de inputhoeveelheid in de ligatiereactie stijgt, neemt de hoeveelheid geligeerd product toe. Deze relatie is echter gelimiteerd: de cq-waarden van nuttige ligatie dalen van relatieve inputconcentratie 1 naar 10, maar stagneren bij relatieve inputconcentratie 39. De ligatiereactie kent m.a.w. een maximale inputconcentratie, die zich ergens bevindt tussen relatieve inputconcentratie 10 en 39. Boven deze maximale (optimale) inputconcentratie resulteert meer input DNA niet in meer ligatieproduct. We kunnen besluiten dat de ligatiereactie concentratie-afhankelijk is en dat bij de ligatiereactie met een relatieve inputconcentratie 10 het rendement of de opbrengst ligatieproduct naar input DNA het hoogst is.

63 b) Scatterplot van de cq-waarden na ligatie versus de gemiddelde ampliconlengte In Figuur 4.5. staat de scatterplot weergegeven van de cq-waarden van staal hl ir2 35 na ligatie versus de gemiddelde ampliconlengte waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39. De gemiddelde ampliconlengte wordt berekend door de som te maken van de lengte van de amplicons waarvoor het reverse complement van de forward en backward primer werd ontwikkeld, en dit getal vervolgens te delen door 2. FIGUUR 4.5.: SCATTERPLOT VAN DE CQ-WAARDEN NA LIGATIE VERSUS DE GEMIDDELDE AMPLICONLENGTE Ideaal willen we geen verband zien tussen de ampliconlengte en cq-waarden na ligatie en dus een rechte bekomen. Dit lijkt hier goed te kloppen. In deze scatterplot is ook te zien dat de cq-waarden het laagst zijn bij relatieve inputconcentratie 10, wat opnieuw wijst op de concentratie-afhankelijkheid van de ligatiereactie. Het voornaamste besluit uit deze scatterplot is dat de ampliconlengte geen invloed heeft op de ligatiereactie. Dit betekent dat het poolen van amplicons met een verschillende lengte geen invloed zal hebben op de equimolariteit van deze amplicons in het ligatieproduct. c) Scatterplot van de cq-waarden na ligatie versus de cq-waarden na amplificatie van de originele amplicons In Figuur 4.6. staat de scatterplot weergegeven van de cq-waarden van staal hl ir2 35 na ligatie versus de cq-waarden na amplificatie van de originele amplicons, waarbij een onderscheid wordt gemaakt tussen relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39.

64 FIGUUR 4.6.: SCATTERPLOT VAN DE CQ-WAARDEN NA LIGATIE VERSUS DE CQ-WAARDEN NA AMPLIFICATIE VAN DE ORIGINELE AMPLICONS Opnieuw wensen we geen trend te zien in deze scatterplot zodat de cq-waarden na amplificatie van de originele amplicons geen maat zijn voor de hoeveelheid amplicon in de ligatieproducten. Dit wordt bevestigd in deze scatterplot. Wanneer we het uiterst linkse datapunt buiten beschouwing laten, bekomen we voor elke relatieve inputconcentratie min of meer een rechte. Het is dus niet zo dat een amplicon met een hoge cq-waarde later niet meer zou terug te vinden zijn in de ligatieproducten. d) Scatterplot van de cq-waarden na ligatie versus de relatieve fluorescentie van de originele amplicons Figuur 4.7. toont de scatterplot van de cq-waarden na ligatie versus de relatieve fluorescentie van de amplicons van staal hl ir2 35, waarbij een onderscheid wordt gemaakt tussen relatieve inputconcentraties 1, 10 en 39. FIGUUR 4.7.: SCATTERPLOT VAN DE CQ-WAARDEN NA LIGATIE VERSUS DE RELATIEVE FLUORESCENTIE VAN DE ORIGINELE AMPLICONS

65 Opnieuw willen we geen verband zien tussen de relatieve fluorescentie van de amplicons en de cq-waarden na ligatie. Dit wordt bevestigd in deze scatterplot. De rechten zijn zelfs vlakker dan deze van de cq-waarden na amplificatie van de originele amplicons. Er is dus geen enkel verband tussen de relatieve fluorescentie van de amplicons en de post-ligatie cq-waarden. De amplicons werden bij het poolen genormaliseerd naar de relatieve fluorescentie waarde. De normalisatie lijkt geslaagd te zijn. Door correctie voor de relatieve fluorescentie waarde lijkt men dus equimolariteit van de amplicons te bekomen. Wel dient er opgemerkt te worden dat we geen negatieve controle hebben. We kunnen m.a.w. niet vergelijken met een pool waarvoor geen normalisatie naar de fluorescentiewaarde werd uitgevoerd. Indien dit geen significant verschillend resultaat zou opleveren, zou dit een enorme vereenvoudiging (pipetteerwerk) van het protocol betekenen Kwaliteitscontrole van de ligatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 In Figuur 4.8. staan de elektroferogrammen van de geligeerde stalen hl ir2 27 en hl ir2 35 met als relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39 weergegeven. FIGUUR 4.8.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN STAAL HL IR2 27-1/10/39 EN STAAL HL IR2 35-1,- 10, -39 NA LIGATIE In de elektroferogrammen kunnen duidelijk twee pieken onderscheiden worden. De eerste piek bij ~400 bp stelt de piek van de niet-geligeerde PCR producten voor. De tweede piek zijn de ligatieproducten van hoog moleculair gewicht. Het hoog moleculair gewicht ligatieproduct heeft een lengte van 2 tot 20 kb. Uit de elektroferogrammen kunnen een aantal conclusies getrokken worden: - De ligatiereactie is reproduceerbaar: de elektroferogrammen van staal hl ir2 27 en hl ir2 35 zijn zeer vergelijkbaar. - De ligatiereactie is concentratie-afhankelijk.

66 - De opbrengst aan hoog moleculair gewicht ligatieproduct is het hoogst bij de ligatiereactie met als relatieve inputconcentratie 10. In Figuur 4.9. staat een samenvattend elektroferogram van het staal hl ir2 27 weergegeven. In deze figuur is duidelijk te zien dat de ligatiereactie het meest efficiënt is doorgegaan bij relatieve inputconcentratie 10. Hierbij is de meerderheid van het DNA hoog moleculair gewicht geligeerd DNA. FIGUUR 4.9.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE GELIGEERDE STALEN HL IR2 27 MET RELATIEVE INPUTCONCENTRATIE 1, 10 EN SIZE SELECTIE Om de hoog moleculair gewicht geligeerde DNA fragmenten (> 600 basenparen) op te zuiveren uit de ligatiereactie worden 2 methodes getest, nl. de Double SPRI Methode en de Chroma Spin 1000 kolom Double SPRI methode Kalibratie van de AMPure beads In Figuur staan de resultaten van de kalibratie van de AMPure beads weergegeven. De getallen boven elke laan verwijzen naar het volume beads dat gebruikt werd in de kalibratie. In het elektroforesepatroon ziet men duidelijk dat de size cut-off stijgt als de bead/dna ratio daalt. Voor ons doeleinde is de optimale bead/dna ratio 0,5 (vol:vol). Bij deze ratio ligt de size cut-off waarde tussen 700 en 1000 basenparen en wordt dus al het laag moleculair (< 700 bp), al dan niet geligeerd, DNA verwijderd. De geligeerde stalen hl ir2 27-1, en worden opgezuiverd met een bead/dna ratio van 0,5 (vol:vol).

67 FIGUUR : ELEKTROFORESEPATROON VAN DE KALIBRATIE VAN DE AMPURE BEAD Kwaliteitscontrole met qpcr De equimolariteit van de amplicons na opzuivering met de Double SPRI methode wordt getest met behulp van een qpcr reactie van de ligatiesite met reverse complement primers van primerplaat offset 0. In Figuur 4.11., en staan de amplificatiecurves weergegeven van respectievelijk de geligeerde en opgezuiverde stalen hl ir2 27-1, -10 en -39. FIGUUR 4.11.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR NA SIZE SELECTIE MET DE DOUBLE SPRI METHODE

68 FIGUUR 4.12.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR NA SIZE SELECTIE MET DE DOUBLE SPRI METHODE FIGUUR 4.13.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR NA SIZE SELECTIE MET DE DOUBLE SPRI METHODE In de plots is duidelijk te zien dat na size selectie de bimodale clustering van de amplificatiecurves verdwenen is. De eerste cluster met lage cq-waarden (autoligaten + nuttige ligaten) is volledig opgeschoven naar de pool van de nuttige ligatien. Dit betekent dat de autoligaten verwijderd zijn bij de opzuivering. Met het programma R worden de data van deze qpcr reacties statistisch verwerkt. In Figuur staan de boxplots weergegeven van de cq-waarden voor en na size selectie met de Double SPRI methode, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39.

69 NA SIZE SELECTIE VOOR SIZE SELECTIE FIGUUR 4.14.: BOXPLOTS VAN DE CQ-WAARDEN BIJ RELATIEVE CONCENTRATIE 1, 10 EN 39 VOOR EN NA SIZE SELECTIE MET DE DOUBLE SPRI METHODE In de boxplots is te zien dat er bij de size selectie een shift optreedt van de nuttige ligaten uit het gele blok naar het groene blok. De autoligaten spelen we m.a.w. kwijt bij de opzuivering. De spreiding van de cq-waarden daarentegen, is na size selectie toegenomen met 2 à 3 waarden. Dit kan gedeeltelijk verklaard worden door de 1/2 verdunning in het protocol van de Double SPRI methode. Aangezien deze verdunning maar een shift van 1 cq-waarde kan verklaren, wijst dit er op dat er verlies optreedt bij de opzuivering. Dit verlies kan mogelijks toegeschreven worden aan selectiviteit van de AMPure beads voor bepaalde DNA sequenties. Omdat de qpcr reacties voor en na size selectie in een verschillende qpcr plaat gebeurden, is er geen optimale vergelijking mogelijk. In ideale omstandigheden moest er in elke qpcr plaat een interne standaard meegenomen worden Kwaliteitscontrole met de Agilent Bionanalyzer 2100 Voor de kwaliteitscontrole van de opzuivering met de Bioanalyzer 2100 wordt een High Sensitivity DNA Labchip gebruikt. De elektroferogrammen voor en na size selectie met de Double SPRI methode staan weergegeven in Figuur 4.15.

70 VOOR SIZE SELECTIE NA SIZE SELECTIE FIGUUR 4.15.: ELEKTROFEROGRAMMEN VOOR EN NA SIZE SELECTIE MET DE DOUBLE SPRI METHODE De opzuivering van de stalen hl ir en -10 zijn het meest geslaagd. De piek van laag moleculair gewicht DNA is na opzuivering nagenoeg volledig verdwenen. Dit is niet het geval voor staal hl ir , waar er nog een smear van laag moleculair gewicht DNA aanwezig is na opzuivering Chroma Spin 1000 kolom In dit experiment worden de geligeerde stalen hl ir2 35-1, -10 en -39 opgezuiverd met een Chroma Spin-1000 kolom Kwaliteitscontrole met qpcr De kwaliteit van de opzuivering met een Chroma Spin-1000 kolom wordt nagegaan met behulp van qpcr met reverse complement primers van primerplaat offset 0". De resultaten van de analyse van de qpcr reacties staan weergegeven in Figuur 4.16., en 4.18.

71 FIGUUR 4.16.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR NA SIZE SELECTIE MET DE CHROMA SPIN-1000 KOLOM FIGUUR 4.17.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR NA SIZE SELECTIE MET DE CHROMA SPIN-1000 KOLOM

72 FIGUUR 4.18.: AMPLIFICATIECURVES VAN STAAL HL IR NA SIZE SELECTIE MET DE CHROMA SPIN-1000 KOLOM Kwaliteitscontrole met de Agilent Bioanalyzer 2100 Na de opzuivering wordt 1 l van elk staal geladen op een High Sensitivity DNA Labchip. De elektroferogrammen staan weergegeven in Figuur VOOR SIZE SELECTIE NA SIZE SELECTIE FIGUUR 4.20.: ELEKTROFEROGRAMMEN VOOR EN NA OPZUIVERING MET DE CHROMA SPIN 1000 KOLOM De opzuivering van staal hl ir lijkt mislukt te zijn aangezien nagenoeg al het DNA weerhouden werd op de kolom. Mogelijks is dit te wijten aan een te lage DNA concentratie. Zowel in staal hl ir als werd niet al het laag moleculair DNA verwijderd. De te verkiezen methode voor de scheiding van laag moleculair DNA van hoog moleculair geligeerd DNA is de Double SPRI Methode.

73 5. CONCLUSIE Next Generation Sequencing (NGS) biedt een snelle en kosten-effectieve methode voor moleculaire diagnostiek van genetisch heterogene ziektes. Erfelijke doofheid is een extreem voorbeeld van genetische heterogeniciteit. Voor niet-syndromale monogene slechthorendheid worden minstens 40 verschillende genen verantwoordelijk geacht, maar een meerderheid van de verantwoordelijke genen blijft nog steeds onbekend. Identificatie van de verantwoordelijke genen is belangrijk voor een goed erfelijkheidsadvies aan de patiënt en zijn/haar familie en voor de ontrafeling van de pathofysiologische mechanismen die leiden tot gehoorverlies. Dit laatste vormt de basis voor mogelijke behandelingsstrategieën. In dit onderzoeksproject was het de bedoeling om 15 volledige doofheidsgenen te sequeneren op de Illumina Genome Analyzer IIx met de paired-end technologie (2 x 100 bp). Dit is wenselijk omwille van de 100-voudige lagere kost per basenpaar en de hogere throughput bij de Illumina Genome Analyzer IIx in vergelijking met de Genome Sequencer van Roche Life Sciences (454 sequencing). Het knelpunt is echter dat sequencing van lange amplicons nog niet mogelijk is op de Illumina Genome Analyzer IIx omwille van de korte leeslengte. Daarom werd in dit onderzoeksproject een protocol van ligeren en ad random fragmenteren ontwikkeld en geoptimaliseerd wat amplicon sequencing op de Illumina Genome Analyzer IIx moet mogelijk maken. Het grote voordeel van dit protocol is dat het protocol PCR-gebaseerd is, waardoor het protocol zoveel als nodig herhaald kan worden. De belangrijkste doelstelling bij de optimalisatie van het ligatieprotocol is het bekomen van equimolariteit zodat men voor elke base van elk amplicon evenveel sequencing coverage bekomt. De studie die de inputhoeveelheden in de ligatiereactie vergelijkt, toont dat de hoogste opbrengst hoog moleculair gewicht geligeerd DNA bereikt wordt met een relatieve inputconcentratie van 10. Naast de concentratie-afhankelijkheid van de ligatiereactie, blijkt de ligatiereactie reproduceerbaar te zijn. De te verkiezen strategie voor de scheiding van het laag moleculair gewicht DNA van het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA is de Double SPRI methode. Deze methode is eveneens sterk reproduceerbaar. Voor de ad random fragmentatie van het hoog moleculair geligeerd DNA in fragmenten van 300 bp is Covaris AFA de methode bij uitstek. De distributie van fragmentlengtes is nauw waardoor de recovery van fragmenten met de gewenste lengte hoog is. Eens men de optimale fragmentatiecondities heeft gevonden, is deze methode gemakkelijk te herhalen en bovendien sterk reproduceerbaar. De fragmentatie met het enzyme NEBNext TM dsdna Fragmentase daarentegen is moeilijk te controleren en optimaliseren. De distributie van de fragmentlengtes is zeer breed waardoor men maar weinig fragmenten overhoudt met de gewenste lengte. Bovendien gaat de fragmentatiereactie gepaard met een enorm DNA-verlies. Het ligatieprotocol dat amplicon sequencing moet mogelijk maken op de Illumina Genome Analyzer IIx, gebruik makende van de paired-end technologie (2x100 bp), ziet er na optimalisatie als volgt uit:

74 - Opzuivering van de amplicons met de QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). - End-repair van de amplicons met de End-It TM DNA End-Repair Kit (Epicentre Biotechnologies). Om economische redenen wordt in één end-repair reactie de maximale inputhoeveelheid gebruikt, nl. 5 g/50 l. - Ligatie van de amplicons met de Fast-Link TM DNA Ligation Kit (Epicentre Biotechnologies). Uitgaande van één end-repair reactie worden 5 ligatiereacties uitgevoerd met als inputvolume 10 l. In tegenstelling tot de aanbevelingen van de kit, wordt de ligatiereactie gedurende 4 uur geïncubeerd bij 16 C. - Size selectie van het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA met de Double SPRI methode. De bead/dna ratio (vol:vol) wordt gekozen op basis van de kalibratie van de AMPure beads (in dit onderzoeksproject 0,5). De size selectie lijkt het meest geslaagd indien elke ligatiereactie afzonderlijk wordt opgezuiverd. - Ad random fragmentatie van het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA in fragmenten van 300 bp met Covaris AFA. De fragmentatiecondities die hiervoor aangewend worden, zijn: Duty Cycle: 5 % - Intensity: 3 - Cycles per burst: Time: 180 sec. Finaal werd in dit onderzoeksproject het geoptimaliseerde ligatieprotocol toegepast op de 5 doofheidsstalen. Bovendien werden de niet-geligeerde amplicons van de 5 doofheidsstalen gesheared met Covaris AFA. De hiervoor gebruikte fragmentatiecondities, bepaald op basis van shearingexperimenten van amplicons, zijn: Duty Cycle: 5% - Intensity: 5 - Cycles per burst: Time: 12 minuten. Een vergelijkende studie van de sequencing-resultaten van de run op de Illumina Genome Analyzer IIx zal moeten uitwijzen welke methode, het ligatieprotocol of de shearing van niet-geligeerde amplicons, de beste is.

75 6. LITERATUURLIJST TimePCR/TaqManvsSYBRGreenChemistries/index.htm Wittwer, C. (2009). High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. Hum Mutat., 30 (6), CurveAnalysis.jpg Preparing Samples for Paired-End Sequencing (for research only) versie feb 2009 ( OWYtMjhlYzBiZWM4OTM2&hl=en) 22. Preparing Samples for Sequencing Genomic DNA reva.pdf ( UtYzZhNGEzOGQ3ZWM2&hl=en) 23. Illumina (making sense out of life): Introduction to the Genome Analyzer System II (Day ( g&hl=en) 24. Cluster Station Operations Guide (for research only) ( 0ZTAtM2JmYWI4ZWZiZGRk&hl=en) 25. Sequencing User Guide (for research only) For Single-Read and Paired-End Sequencing 26. Complementarity of Next Generation Sequencing technologies Dr. Apr. Filip Van Nieuwerburgh

76 Cursus Farmaceutische biotechnologie, Prof. Dr. Apr. Dieter Deforce, GS FLX titanium General Library Preparation Method Manual

77 Bijlage 1: Bespreking van de 15 te sequeneren doofheidsgenen a) TMPRSS3 Het TMPRSS3 gen codeert voor een eiwit dat behoort tot de familie van de serine proteasen. Men vermoedt dat dit enzyme een rol speelt bij de ontwikkeling van het binnenoor. Onderzoekers hebben ontdekt dat het TMPRSS3 proteïne een ander proteïne, namelijk het ENaC of epithelial amiloride sensitive sodium activeert. ENaC is op zijn beurt belangrijk bij de controle van belangrijke chemische pathways in het binnenoor. 4 Er werden reeds meer dan 10 mutaties gerapporteerd in het TMPRSS3 gen bij patiënten met niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB8/10 genaamd. De meeste mutaties zijn missense mutaties, waardoor het TMPRSS3 proteïne zijn normale functie niet meer kan uitoefenen. 4 b) TMIE Het TMIE gen codeert voor het transmembranair binnenoor proteïne. Sommige studies hebben aangetoond dat dit proteïne een belangrijke rol speelt bij de ontwikkeling van de stereocilia in het binnenoor. Daarnaast zou dit proteïne ook noodzakelijk zijn voor het goed functioneren van de gehoorzenuw. 4 Er werden reeds 5 mutaties (puntmutatie, insertie of deletie) in het TMIE gen geïndentificeerd bij patiënten met niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid (DFNB6). Hoe deze mutaties precies leiden tot gehoorverlies is nog niet duidelijk. 4 c) TECTA TECTA codeert voor alpha-tectorine. Alpha-tectorine is een structureel proteïne dat zich bevindt in de tectoriale membraan in het binnenoor. De tectoriale membraan is een homogene, gelatineuze laag die gaat trillen onder invloed van geluid, en via trilhaarcellen de geluidswaarneming doorgeeft aan de hersenen. Bij de vorming van de tectoriale membraan interageert alpha-tectorine met andere proteïnen. Twee regio s zijn hierbij belangrijk, nl. het vwfd domein en het zona pellucida domein. 4 Verschillende missense mutaties veroorzaken DFNA8/A12, een vorm van niet-syndromale autosomaal dominante doofheid. Door deze mutaties verandert het vwfd domein of het zona pellucida domein en worden proteïne-interacties verstoord. De structuur van de tectoriale membraan is verstoord waardoor de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen niet meer mogelijk is. 4 Een nonsense mutatie in het TECTA gen ligt aan de basis van DFNB21, een vorm van nietsyndromale autosomaal recessieve doofheid. Concreet wordt hierbij ofwel geen proteïne, ofwel een verkorte versie van alpha-tectorine aangemaakt. Opnieuw wordt hierdoor de structuur van de tectoriale membraan verstoord en bijgevolg ook de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen. 4

78 d) SLC26A4 SLC26A4 codeert voor pendrine. Pendrine fungeert als aniontransporter in de nieren, het binnenoor en de schildklier. In de schildklier zorgt pendrine voor het transport van iodide-ionen uit de cel, die vervolgens binden aan thyroglobuline. Dit is een belangrijke stap bij de aanmaak van schildklierhormonen. In het binnenoor is pendrine belangrijk voor het behoud van de juiste levels chloride- en bicarbonaationen. Dit is essentieel voor het hoorvermogen en voor de behouden van de juiste hoeveelheid vloeistof in het binnenoor. De vloeistof in het binnenoor is belangrijk bij de ontwikkeling van een aantal structuren in het binnenoor, zoals de cochlea en de aquaductus vestibuli. 4 Mutaties in SLC26A4 leiden ofwel tot niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB4 genaamd, ofwel tot het Syndroom van Pendred. Kenmerkend voor DFNB4 is een vergroting van de aquaductus vestibuli. Het syndroom van Pendred leidt tot een misvorming van de cochlea en struma, veroorzaakt door hypothyroïdie. Intussen werden meer dan 60 mutaties geïdentificeerd bij patiënten met het Syndroom van Pendred. Bijna al deze mutaties werden ook teruggevonden bij DFNB4. Meestal gaat het om een missense mutatie, een insertie of een deletie. Een insertie of deletie creëert een prematuur stopsignaal waardoor maar een klein deel van pendrine wordt aangemaakt (nonsense mutatie). Globaal zorgen al deze mutaties voor een gedaalde activiteit van pendrine, waardoor de levels anionen in de vloeistof van het binnenoor wijzigen. Dit verstoort op zijn de beurt de ontwikkeling van de structuren van het binnenoor, wat leidt tot gehoorverlies. 4 e) PCDH15 PCDH15 codeert voor protocadherine 15, een intercellulaire adhesiemolecule in het binnenoor en in de fotoreceptoren van de retina. In het binnenoor speelt protocadherine 15 een belangrijke rol bij de ontwikkeling van de stereocilia. 4 Een aantal mutaties in PCDH15 veroorzaken niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB23 genaamd. Concreet gaat het om een missense mutatie waardoor de normale structuur en functie van protocadherine 15 verandert. De onvolledige ontwikkeling van de stereocilia ligt aan de basis van het gehoorverlies. 4 Bij patiënten met het Usher Syndroom type 1F werden reeds 9 mutaties ontdekt in PCDH15. Het resultaat hiervan is de vorming van een weinig tot niet-actief protocadherine 15 hetzij door een abnormale structuur, hetzij door expressie van een klein stuk van het proteïne. Aangezien dit defecten veroorzaakt in zowel het binnenoor als de retina, wordt het Usher Syndroom gekenmerkt door gehooren gezichtsverlies. 4 f) OTOF OTOF codeert voor otoferline. OTOF komt tot expressie in de cochlea en de hersenen. Hoewel de exacte functie van otoferline niet gekend is, blijkt dit proteïne essentieel te zijn voor het hoorvermogen. Mogelijks speelt otoferline een rol bij het loslaten van neurotransmitters uit

79 zenuwcellen, betrokken bij het gehoor. Dit proces is afhankelijk van de calciumconcentratie in de cel. Otoferline bevat een aantal regio s, C2 domeinen, welke calcium binden. 4 Er werden reeds 16 mutaties geïdentificeerd in OTOF bij patiënten met DFNB9, een vorm van niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid. Sommige mutaties leiden tot de vorming van een abnormaal klein, niet-functioneel proteïne of verhinderen de aanmaak van otoferline. Andere mutaties veranderen de driedimensionale structuur van het proteïne, waardoor de binding met calcium niet meer mogelijk is. 4 g) GJB2 Het GJB2 gen is ook bekend als het connexine 26 gen (Cx26). Connexine 26 is een transmembranair eiwit dat er voor zorgt dat de celmembranen in het binnenoor voldoende doorgankelijk zijn voor het transport van K + van de ene cel naar de andere door de vorming van gap junctions. 4 Onderzoekers hebben meer dan 90 mutaties (deleties, inserties en missense mutaties) geïdentificeerd in het GJB2 gen die DFNB1 veroorzaken, een vorm van niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid. Door deze mutaties kunnen er geen functionele gap junctions meer gevormd worden, waardoor het K + level in de cellen van het binnenoor wordt verstoord. Te hoge kaliumlevels kunnen cellen aantasten. Daarnaast hebben onderzoekers een aantal missense mutaties ontdekt in het GJB2 gen welke DFNA3 veroorzaken, een vorm van niet-syndromale doofheid dat autosomaal dominant wordt overgeërfd. Hoe deze GJB2 mutaties leiden tot gehoorverlies is onduidelijk. 4 Het Vohwinkel syndroom wordt veroorzaakt door twee missense mutaties in het GJB2 gen. Concreet gaat het om een substitutie van ofwel asparaginezuur door histidine, ofwel van glycine door valine. Het Vohwinkel syndroom wordt gekenmerkt wordt door hyperkeratose (verdikking van de huid) en doofheid. Men heeft daarnaast ook ontdekt dat twee GJB2 missense mutaties aan de basis liggen van de aandoening gekenmerkt door Keratoderma palmoplantaris en doofheid. In dit geval gaat het om een substitutie van ofwel glycine door alanine, ofwel van arginine door glutamine. 4 Een ander syndroom veroorzaakt door GJB2 missense mutaties is het Bart-Pumphrey syndroom. Specifiek gaat het om een substitutie van ofwel glycine door serine, ofwel van asparagine door lysine. Tot slot werden verschillende missense mutaties ontdekt in GJB1, die het Keratitis- Ichtyosis-Deafness (KID) syndroom veroorzaken. 4 h) ESRRB Het ESRRB gen speelt een belangrijke rol bij het bewaren van het ionen-evenwicht binnen en buiten de cellen van het binnenoor. Het ionen-evenwicht is essentieel voor het hoorvermogen. Het ESRRB gen behoort tot dezelfde klasse van genen als de oestrogeenreceptoren. Deze genen coderen voor eiwitten die aan de buitenkant van een cel hormonen binden en vervolgens het signaal doorgeven aan de celkern, waar genen aan- en uitgeschakeld worden. Het ESRRB gen is vooral actief in het prille beginstadium van een embryo. Bij muizen zorgt het ervoor dat cellen de status van

80 stamcel behouden en nog niet gaan differentiëren. Het gen speelt ook, net als veel genen die belangrijk zijn in de vroege ontwikkeling, een rol in de tumorbiologie. 4,5 Mutaties in het ESRRB gen liggen aan de basis van niet-syndromale sensorineurale autosomaal recessieve doofheid type 35 (DFNB35). Men spreekt van sensorineurale doofheid bij gehoorverlies door aandoeningen van de cochlea, de gehoorzenuw of de zenuwbaan naar de hersenen. 4 i) ESPN ESPN codeert voor espine. Espine komt voor in het binnenoor en speelt een belangrijke rol bij het hoorvermogen en het evenwicht. Espine bindt aan actine, een proteïne dat belangrijk is voor de beweging en de vorm van de cel. Actine bevindt zich in grote mate in de stereocilia. Espine is belangrijk bij de ontwikkeling van de stereocilia. Wanneer geluid in de cochlea komt, bewegen de stereocilia met de vloeistof mee. Deze beweging is belangrijk voor de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen en voor het ontvangen van informatie over de positie en beweging van het lichaam. 4 Er werden reeds 6 mutaties geïdentificeerd in patiënten met niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB36 genaamd. Concreet gaat het om een deletie van een kleine sequentie, waardoor ofwel geen espine, ofwel een kleine, niet-functionele vorm van espine wordt aangemaakt dat niet meer in staat is om te binden aan actine. Het tekort aan espine verstoort de ontwikkeling en de structuur van de stereocilia, wat leidt tot gehoorverlies en evenwichtsproblemen. Een aantal missense mutaties veroorzaken een autosomaal dominante vorm van niet-syndromale doofheid zonder evenwichtsproblemen. Door deze mutaties verandert de structuur van espine, wat op zijn beurt de ontwikkeling van de stereocilia in het binnenoor verstoort. 4 j) CDH23 CDH23 codeert voor cadherine 23, een intercellulaire adhesiemolecule die voorkomt in het binnenoor en de retina. In het binnenoor speelt cadherine 23 een rol bij de ontwikkeling van de stereocilia, welke bewegen onder invloed van geluidsgolven. Deze beweging is belangrijk voor de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen, een essentieel proces voor het gehoorvermogen. 4 Ongeveer 20 mutaties in CDH23 werden geïdentificeerd bij patiënten met niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB12 genaamd. Meestal gaat het om een missense mutatie, waardoor cadherine 23 zijn normale functie niet goed meer kan uitoefenen, met als gevolg een verstoorde ontwikkeling van de stereocilia, wat op zijn beurt doofheid veroorzaakt. 4 Meer dan 30 mutaties in CDH23 liggen aan de basis van het Usher syndroom type 1D. Meestal gaat het om een puntmutatie of een insertie van een korte sequentie. Hierdoor wordt een abnormaal kleine, niet-functionele versie van cadherine 23 gevormd. Een tekort aan cadherine 23 geeft aanleiding tot een onvolledige ontwikkeling van het binnenoor en de retina, wat resulteert in gehoor- en gezichtsverlies. 4

81 k) MYO7A MYO7A codeert voor myosine VIIA en komt tot expressie in het binnenoor en de retina. In het binnenoor speelt myosine VIIA een rol bij de ontwikkeling van de stereocilia (rijk aan actine). De beweging van de stereocilia onder invloed van geluidsgolven is essentieel voor het gehoorvermogen. In de retina is myosine VIIA belangrijk bij de ontwikkeling van het retinaal pigment epitheel. 4 Er werden reeds 4 mutaties in MYO7A ontdekt bij patiënten met niet-syndromale autosomaal dominante doofheid DFNA11. Het gaat om missense mutaties of deleties. Men vermoedt dat een abnormaal myosine VIIA de ontwikkeling van de stereocilia verstoort. 4 Een aantal mutaties in MYO7A worden geassocieerd met DFNB2, een vorm van nietsyndromale autosomaal recessieve doofheid. Onderzoek heeft aangetoond dat deze mutaties representatief zijn voor vroege vormen van het Usher syndroom, gekenmerkt door gehoorverlies en retinitis pigmentosa. Het is nog onduidelijk of alle kinderen met MYO7A mutaties en gehoorverlies op termijn retinitis pigmentosa zullen ontwikkelen. 4 Er werden reeds meer dan 120 MYO7A mutaties ontdekt bij patiënten met het Usher syndroom type 1B. Meestal gaat het om missense mutaties, maar soms ook om nonsense mutaties, inserties en deleties. Al deze mutaties zorgen voor de aanmaak van een niet-functioneel myosine VIIA waardoor de ontwikkeling van de stereocilia van het binnenoor en het retinaal pigment epitheel wordt verstoord. 4 l) PJVK PJVK codeert voor het proteïne pejvakine. Pejvakine komt voor in de gehoorzenuwen en de hersenen. Hoewel de exacte functie ervan niet gekend is, blijkt pejvakine essentieel te zijn voor het hoorvermogen. Essentieel bij het hoorvermogen is de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen, welke via de gehoorzenuwen overgebracht worden naar de hersenen. Waarschijnlijk is pejvakine belangrijk voor de transmissie van deze zenuwimpulsen. 4 Onderzoekers hebben twee mutaties in PJVK geïdentificeerd die DFNB59, een vorm van nietsyndromale autosomaal recessieve doofheid, veroorzaken. Omdat bij dit type gehoorverlies de transmissie van zenuwimpulsen van het binnenoor naar de hersenen verstoord is, spreekt men van auditieve neuropathie. Aan de basis ligt een missense mutatie. 4 m) MYO15A MYO15A codeert voor myosine XVA. MYO15A komt o.a. tot expressie in het binnenoor en de schildklier. In het binnenoor speelt myosine XVA een rol bij de ontwikkeling van stereocilia (rijk aan actine). De beweging van stereocilia onder invloed van geluidsgolven is essentieel voor het gehoorvermogen. Myosine XVA zorgt o.a. voor het transport van whirline naar de toppen van de stereocilia. Beide proteïnes zijn belangrijk voor de structuur van de stereocilia. 4

82 Er werden reeds 7 mutaties ontdekt in MYO15A bij patiënten met niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB3 genaamd. Meestal gaat het om een missense mutatie. Door deze mutaties kan myosine XVA zijn normale functie niet meer uitoefenen of wordt een abnormale, korte, niet-functionele versie aangemaakt. Het gehoorverlies is het resultaat van een verstoorde ontwikkeling van de stereocilia. 4 n) TMC1 TMC1 codeert voor het transmembrane channel-like 1 proteïne. Dit proteïne komt voor in het binnenoor, waar het een rol speelt bij de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen, een essentieel proces voor het gehoorvermogen. Mogelijks is het TMC1 proteïne ook betrokken bij een aantal processen die belangrijk zijn voor de overleving van de cellen van het binnenoor. 4 Verschillende mutaties in TMC1 liggen aan de basis van DFNB7/B11, een vorm van nietsyndromale autosomaal recessieve doofheid. Nonsense, missense mutaties of deleties kunnen aan de basis liggen, waardoor het TMC1 proteïne zijn de normale activiteit niet meer kan uitoefenen. De omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen wordt verstoord. 4 Een missense mutatie in TMC1 veroorzaakt DFNA36, een vorm van niet-syndromale doofheid die autosomaal dominant wordt overgeërfd. Concreet gaat het om de substitutie van asparaginezuur door asparagine op positie o) TRIOBP TRIOPB codeert voor het TRIO en F-actine bindend proteïne (Triobp). Het Triobp proteïne is belangrijk bij de vorming van het cytoskelet. Concreet helpt het Triopb proteïne bij de organisatie van actinefilamenten, een belangrijk onderdeel bij de vorming van het cytoskelet. Er bestaan twee versies van het Triobp proteïne, met name een korte versie die teruggevonden wordt in de meeste weefsels, en een lange versie die specifiek voorkomt in de hersenen, het oog en de cochlea van het binnenoor. In het binnenoor speelt het Triopb proteïne een rol bij de ontwikkeling van de stereocilia. De beweging van de stereocilia onder invloed van geluidsgolven is belangrijk voor de omzetting van geluidsgolven in zenuwimpulsen, een essentieel proces voor het gehoorvermogen. 4 Er werden reeds 9 mutaties ontdekt in TRIOBP die een vorm van niet-syndromale autosomaal recessieve doofheid, DFNB28, veroorzaken. Meestal gaat het om een nonsense mutatie. Hierdoor is er geen interactie meer mogelijk met actinefilamenten van de stereocilia, wat leidt tot gehoorverlies. 4

83 Bijlage 2: Schematisch overzicht van de Illumina-technologie SCHEMA 2.1.: ILLUMINA-TECHNOLOGIE 19,20

84

85 Bijlage 3: Tabellen met reverse complement van de amplicon forward en backward primers TABEL 3.1.: REVERSE COMPLEMENT VAN DE AMPLICON FORWARD PRIMERS Exon Foward Primer Reverse complement MYO15A ex 58-1 CAGAGCTGCATCACCCTAGC GCTAGGGTGATGCAGCTCTG PJVK ex 4-1 TGGACCAATTGGATCTCTGCT AGCAGAGATCCAATTGGTCCA CDH23 ex 47-2 AGCAGGAGTCCTACAGGCTA TAGCCTGTAGGACTCCTGCT MYO15A ex 29-1 AGCCCAGCTCTGATTTCCTC GAGGAAATCAGAGCTGGGCT TMCI ex 7-2 AGAGGAATTGGAAAGATTGAAGGC GCCTTCAATCTTTCCAATTCCTCT PCDH15 ex 1-2 AGAAGGGAAGGGAAAGCACA TGTGCTTTCCCTTCCCTTCT TECTA ex 9-1 AGGCTAGCAATAGGGCAGAC GTCTGCCCTATTGCTAGCCT MYO15A ex 51-2 CTTCCCTTCGGAGCTGGTG CACCAGCTCCGAAGGGAAG TMPRSS3 ex 4 GTGACTCCTGACCCACAGTT AACTGTGGGTCAGGAGTCAC CDH23 ex 50 CCTCGGAGTCCAGGTCTTTC GAAAGACCTGGACTCCGAGG CDH23 ex 15-2 CACGGTGTTCCTTCTCTCCA TGGAGAGAAGGAACACCGTG TECTA ex 10-4 AAGGTGGCCTGTACTACTGC GCAGTAGTACAGGCCACCTT MYO7A ex 29 GGGAAGCCACAGAAAGCAAC GTTGCTTTCTGTGGCTTCCC PCDH15 ex 1-11 AGAAGTGAGGCCTGGGAAAG CTTTCCCAGGCCTCACTTCT OTOF ex 9-1 GCAGAGGGTCACTAAGACCAG CTGGTCTTAGTGACCCTCTGC MYO15A ex 38 GGTTCCAGGGTTGGGCA TGCCCAACCCTGGAACC TMPRSS3 ex 1-1 CACAACGCACACAGGAGAGA TCTCTCCTGTGTGCGTTGTG PJVK ex 3 GGATTGCCTTGATTTACTATTAGGTG CACCTAATAGTAAATCAAGGCAATCC TECTA ex 6-1 ACCATACCTCCCTAACAGGGT ACCCTGTTAGGGAGGTATGGT OTOF ex 26 CCCTGTCACTCAGGCTTCC GGAAGCCTGAGTGACAGGG PCDH15 ex 1-7 GGGCACATAGTTTGAAGTTCTGA TCAGAACTTCAAACTATGTGCCC MYO7A ex 21 CCTGCAGGCAGGGTCAG CTGACCCTGCCTGCAGG MYO7A ex 27 TCTGCTCACTCCTTAGATTCTGTT AACAGAATCTAAGGAGTGAGCAGA TECTA ex 16 AAGCTACCGCATGTAGGTGT ACACCTACATGCGGTAGCTT

86 TABEL 3.2.: REVERSE COMPLEMENT VAN DE AMPLICON BACKWARD PRIMERS Exon Backward Primer Reverse complement MYO15A ex 58-1 TTGAACCCACTCCCACCCTA TAGGGTGGGAGTGGGTTCAA PJVK ex 4-1 ATCATTTGTATTTCATGCAGACCCT AGGGTCTGCATGAAATACAAATGAT CDH23 ex 47-2 CTGGGAGCTGGGAGGGA TCCCTCCCAGCTCCCAG MYO15A ex 29-1 ACCAGCTTGAAGATGCTCAC GTGAGCATCTTCAAGCTGGT TMCI ex 7-2 TACAGTGTATGTGTGTGTGTGTG CACACACACACACATACACTGTA PCDH15 ex 1-2 TGAAGCCTATGTATTTGGTAAGAAGAA TTCTTCTTACCAAATACATAGGCTTCA TECTA ex 9-1 TGGCGTTGGCATTGTAGAAG CTTCTACAATGCCAACGCCA MYO15A ex 51-2 CGGCTCACTCTACCTGGTTC GAACCAGGTAGAGTGAGCCG TMPRSS3 ex 4 TTTCTCGGACTCCTGCTTCAA TTGAAGCAGGAGTCCGAGAAA CDH23 ex 50 GCAGGGTGGGAGAGGAAG CTTCCTCTCCCACCCTGC CDH23 ex 15-2 AAGCAAGCAAGCAAGTACAGG CCTGTACTTGCTTGCTTGCTT TECTA ex 10-4 CCCATCCTGACGTCTCCAC GTGGAGACGTCAGGATGGG MYO7A ex 29 GACACACACACACACGCATT AATGCGTGTGTGTGTGTGTC PCDH15 ex 1-11 TGTGGAGTCAGTCAGTCAGC GCTGACTGACTGACTCCACA OTOF ex 9-1 CCTCCCACAGACATGGCTAC GTAGCCATGTCTGTGGGAGG MYO15A ex 38 CTTGTGTCTCCAAGCAACCC GGGTTGCTTGGAGACACAAG TMPRSS3 ex 1-1 CCACCAACAGCCACTCAGAA TTCTGAGTGGCTGTTGGTGG PJVK ex 3 TCCCATGGCAACACTTTAGTT AACTAAAGTGTTGCCATGGGA TECTA ex 6-1 ATGTGCTGGTCTCCACAGC GCTGTGGAGACCAGCACAT OTOF ex 26 ATCCAGGGCTGGCTCTCT AGAGAGCCAGCCCTGGAT PCDH15 ex 1-7 CTTCCTCCACCACCTCCTTC GAAGGAGGTGGTGGAGGAAG MYO7A ex 21 GGTGATGCATGGACACTCCT AGGAGTGTCCATGCATCACC MYO7A ex 27 TAGGTTGACAGAGGCACCAC GTGGTGCCTCTGTCAACCTA TECTA ex 16 GATGCATCAAGGTCGTTCCC GGGAACGACCTTGATGCATC

87 Bijlage 4: Schematische voorstelling van de 96-well platen met het reverse complement van de forward en backward primers A A B C D E F G H I J K L B M N O P Q R S T U V W X C A B C D E F G H I J K L D M N O P Q R S T U V W X E A B C D E F G H I J K L F M N O P Q R S T U V W X G A B C D E F G H I J K L J M N O P Q R S T U V W X FIGUUR 4.1.: 96-WELL PLAAT MET REVERSE COMPLEMENT VAN FORWARD PRIMERS A A B C D E F G H I J K L B M N O P Q R S T U V W X C B C D E F G H I J K L A D N O P Q R S T U V W X M E C D E F G H I J K L A B F O P Q R S T U V W X M N G D E F G H I J K L A B C H P Q R S T U V W X M N O FIGUUR 4.2.: 96-WELL PLAAT MET REVERSE COMPLEMENT VAN BACKWARD PRIMERS

88 Bijlage 5: Tabel met de codes van de primers TABEL 5.1.: CODES VAN DE PRIMERS Code Primer A TMCI ex 7-2 B TMPRSS 3 ex 1-1 C PJVK ex 4-1 D MYO15A ex 29-1 E CDH23 ex 50 F OTOF ex 26 G MYO7A ex 29 H TECTA ex 6-1 I MYO15A ex 38 J CDH23 ex 15-2 K PCDH15 ex 1-7 L MYO7A ex 27 M TMPRSS3 ex 4 N TECTA ex 9-1 O OTOF ex 9-1 P CDH23 ex 47-2 Q TECTA ex 10-4 R PCDH 15 ex 1-2 S PJVK ex 3 T MYO7A ex 21 U MYO15A ex 58-1 V PCDH15 ex 1-11 W MYO15A ex 51-2 X TECTA ex 16

89 Bijlage 6: Offset 0, offset 4 en offset 8 plaat A AA BB CC DD EE FF GG HH II IJ KK LL B MM NN OO PP QQ RR SS TT UU VV WW XX C AB BC CD DE EF FG GH HI IJ JK KL LA D MN NO OP PQ QR RS ST TU UV VW WX XM E AC BD CE DF EG FH GI HJ IK JL KA LB F MO NP OQ PR QS RT SU TV UW VX WM XN G AD BE CF DG EH FI GJ HK IL JA KB LC H MP NQ OR PS QT RU SV TW UX VM WN XO FIGUUR 6.1.: OFFSET 0 PLAAT A AE BF CG DH EI FJ GK HL IA JB KC LD B MQ NR OS PT QU RV SW TX UM VN WO XP C AF BG CH DI EJ FK GL HA IB JC KD LE D MR NS OT PU QV RW SX TM UN VO WP XQ E AG BH CI DJ EK FL GA HB IC JD KE LF F MS NT OU PV QW RX SM TN UO VP WQ XR G AH BI CJ DK EL FA GB HC ID JE KF LG H MT NU OV PW QX RM SN TO UP VQ WR XS FIGUUR 6.2.: OFFSET 4 PLAAT A AI BJ CK DL EA FB GC HD IE JF KG LH B MU NV OW PX QM RN SO TP UQ VR WS XT C AJ BK CL DA EB FC GD HE IF JG KH LI D MV NW OX PM QN RO SP TQ UR VS WT XU E AK BL CA DB EC FD GE HF IG JH KI LJ F MW NX OM PN QO RP SQ TR US VT WU XV G AL BA CB DC ED FE GF HG IH JI KJ LK H MX NM ON ON QP RQ SR TS UT VU WV XW FIGUUR 6.3.: OFFSET 8 PLAAT

90 Bijlage 7: 96-well plaat met mastermixen A B C D E F G J FIGUUR 7.1.: 96-WELL PLAAT MET MASTERMIXEN

91 Bijlage 8: 384-well qpcr plaat A B C D E F G H I J K L M N O P FIGUUR 8.1.: 384-WELL QPCR PLAAT

92 Relatieve Fluorescentie (Rfu) Bijlage 9: Picogreenmeting van de pools TABEL 9.1.: RFU-WAARDEN VAN DE STANDAARDEN Standaarden (ng/ l) Rfu 1 Rfu 2 Rfu 3 Gemiddelde Rfu , , y = 1933,75x + 253, Concentratie (ng/ l) FIGUUR 9.1.: IJKLIJN: RELATIEVE FLUORESCENTIE (RFU) IN FUNCTIE VAN DE CONCENTRATIE (ng/ l) TABEL 9.2.: RFU-WAARDEN VAN DE STALEN Stalen Rfu onverdund Rfu 1/10 verdunning Rfu 1/100 verdunning Sh5S ir ir

93 Bijlage 10: Absorptiespectra van de pools na opzuivering en aanconcentratie FIGUUR 10.1.: ABSORPTIESPECTRA VAN DE POOLS NA OPZUIVERING EN AANCONCENTRATIE