SEQUENEREN VAN 15 VOLLEDIGE DOOFHEIDSGENEN MET DE ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx

Transcriptie

1 FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Biotechnologie Academiejaar SEQUENEREN VAN 15 VOLLEDIGE DOOFHEIDSGENEN MET DE ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx Apr. Nathalie VANDERSTRAETEN Master na master in de Industriële Farmacie Promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce Co-promotor Prof. Dr. P. Coucke

2

3 FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische biotechnologie Academiejaar SEQUENEREN VAN 15 VOLLEDIGE DOOFHEIDSGENEN MET DE ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx Apr. Nathalie VANDERSTRAETEN Master na master in de Industriële Farmacie Promotor Prof. Dr. Apr. D. Deforce Co-promotor Prof. Dr. P. Coucke

4 De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef. Datum: Auteur: Nathalie Vanderstraeten Datum: Promotor: Prof. D. Deforce

5 Dankwoord De thesis zou niet tot stand gekomen zijn zonder de steun van een aantal mensen die ik hier graag zou willen bedanken. In de eerste plaats wil ik mijn promotor Prof. Dieter Deforce en co-promotor Prof. Paul Coucke danken voor het leveren van een extreem boeiend onderwerp. Bedankt voor de kans die ik gekregen heb om ervaring op te doen over next-generation sequencing. Filip Van Nieuwerburgh, bedankt voor de algemene begeleiding en voor het leveren van constructieve commentaar en suggesties. Speciale dank gaat uit naar Bram De Wilde voor de dagelijkse begeleiding, de vele uren die je in dit onderzoeksproject geïnvesteerd hebt en de talloze tips van onschatbare waarde. Valerie Vanderstraeten wil ik speciaal bedanken omdat we een zo n goed team vormden bij het uitvoeren van dit onderzoeksproject. Teamwork is the key to succes is nu eenmaal een uitspraak met een hoog waarheidsgehalte. De personeelsleden van het Centrum Medische Genetica Gent, in het bijzonder Sarah, Hendrik en Bieke. Bedankt voor de raad die jullie mij gegeven hebben en de aangename sfeer die er op het labo heerste. Het laatste dankwoord is gericht aan mijn ouders en vriend Tom die tijd maakten om te luisteren en mij moed gaven om door te zetten.

6 INHOUDSOPGAVE Auteursrecht Dankwoord Inhoudsopgave Lijst met gebruikte afkortingen Inleiding 1. LITERATUURSTUDIE DOOFHEID Erfelijke niet-syndromale gehoorstoornisse Autosomaal recessief Autosomaal dominant X-gen gebonden Mitochondriaal Erfelijke gehoorstoornissen als onderdeel van een syndroom Complexe of multifactoriële aandoeningen en congenitale virale syndromen Verworven aandoeningen GENOME SEQUENCER FLX VAN ROCHE LIFE SCIENCES (454 SEQUENCING) Aanmaken van een library Emulsie PCR Pyrosequencing ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx OBJECTIEVEN MATERIALEN EN METHODEN BESCHRIJVING VAN DNA-STALEN KWANTIFICATIE VAN DS DNA Quant-it TM Picogreen dsdna kit Principe Procedure Nanodrop 1000 Spectrofotometer Principe Procedure DNA-OPZUIVERING QIAquick PCR Purification Kit Principe Procedure MinElute PCR Purification Kit AGILENT BIOANALYZER Principe Procedure AGAROSEGELELEKTROFORESE.26

7 Principe Procedure FRAGMENTATIE NEBNext dsdna Fragmentase Principe Procedure Covaris Adaptive Focused Acoustics TM (AFA) Principe Procedure RESULTATEN FRAGMENTATIE MET DS DNA FRAGMENTASE Fragmentatie van genomisch DNA van Roche en kwaliteitscontrole met agarosegelektroforese Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met agarosegelektroforese Fragmentatie van genomisch DNA van Roche en size selectie met de Double. SPRI methode Fragmentatie Size selectie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met Picogreen Fragmentatie van geligeerde amplicons Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met Picogreen Fragmentatie van verschillende concentraties genomisch DNA Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met Picogreen Fragmentatie van geligeerde amplicons in een hogere concentratie Ligatie en opzuivering met de Double SPRI methode Kwaliteitscontrole van de ligatie met de Agilent Bioanalyzer Kwaliteitscontrole van de opzuivering met de Agilent Bioanalyzer Kwaliteitscontrole van de opzuivering met Picogreen Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer Fragmentatie van PCR-amplicons Opzuivering en Nanodropmeting Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer FRAGMENTATIE MET COVARIS Fragmentatie van controle genomisch DNA van Roche.50

8 Bereiding van de stalen genomisch DNA Fragmentatie Kwaliteitscontrole van fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer Fragmentatie van een geligeerd-amplicon-staal Bereiding van een geligeerd-amplicon-staal Kwaliteitscontrole van de opzuivering met de Agilent Bioanalyzer Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer Fragmentatie van PCR-amplicons Genereren van amplicons via een qpcr-reactie Fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer CONCLUSIE LITERATUURLIJST 7. BIJLAGEN Bijlage 1: Resultaten van de kalibratie van het lot AMPure beads Bijlage 2: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie genomisch DNA van Roche en size selectie met de Double SPRI methode ( ) Bijlage 3: Gebruikte formule voor de berekening van de volumes van de reagentia voor de ds DNA Fragmentase reactie van het geligeerde staal hl ir bij het experiment: Fragmentatie van geligeerde amplicons ( ) Bijlage 4: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie van geligeerde amplicons ( ) Bijlage 5: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie van verschillende concentraties genomisch DNA ( ) Bijlage 6: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie van geligeerde amplicons in een hogere concentratie ( ) Bijlage 7: Resultaten van de Nanodropmeting bij het experiment: Fragmentatie van PCRamplicons ( )

9 LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN % Procent C Graden Celcius A Adenine AD Autosomaal dominant AFA Adaptive Focused Acoustics APS Adenosine 5 fosfosulfaat AR Autosomaal recessief ATP Adenosine triphosphate AUC Area Under the Curve BOR syndroom Branchio-oto-renaal syndroom bp basenparen BSA Bovine Serum Albumin Buffer EB Elutiebuffer Buffer PB Binding buffer Buffer PE Wash buffer Bv. Bijvoorbeeld C Cytosine CCD camera Charge-coupled device camera CHARGE Coloboma - Heart defects - Atresia - Genital abnormalities - Ear abnormalities CMGG Centrum voor Medische Genetica Gent CMV Cytomegalovirus Cx26 gen Connexine 26 gen DFNA loci Deafness autosomal dominant loci DFNB loci Deafness autosomal recessive loci DNA Deoxyribonucleic acid dntp's Deoxyribonucleotide trifosfaten Double SPRI methode Double Solid Phase Reversible Immobilisation methode dsdna Double stranded DNA E. Coli DNA-polymerase Escherichia Coli DNA-polymerase EDTA Ethyleendiaminetetra-azijnzuur empcr Emulsion Polymerase Chain Reaction G Guanine g gram g gravitatiekracht gdna Genomisch DNA GJB2 Gap junction protein beta 2 GS-FLX Genome Sequencer FLX H 2 O Dihydrogen Monoxide HMW High Molecular Weight Hz Hertz K + kb khz LMW M Kalium Kilobasen kilohertz Low Molecular Weight Molariteit

10 m.a.w. met andere woorden g microgram l microliter ml milliliter mm millimeter mm millimolair m micrometer MPC Magnetic Particle Concentrator MTRNR1 gen Mitochondrial 12S rrna gen NaOH Natriumhydroxide ng nanogram NGS Next Generation Sequencing nl. namelijk nm nanometer NS Niet syndromaal NS-AD Niet syndromaal autosomaal dominant NS-AR Niet syndromaal autosomaal recessief NS-M Niet syndromaal mitochondriaal NS-X Niet syndromaal X gebonden o.a. onder andere OD 260/280 Optical Density 260/280 PCR Polymerase Chain Reaction pg picogram ph Potentia hydrogenii of zuurtegraad PPi Pyrofosfaat QPCR Quantitative Polymerase Chain Reaction RFU Relative Fluorescence rpm Revolutions per minute RT-PCR Real Time Polymerase Chain Reaction S Syndromaal S-AD Syndromaal autosomaal dominant sample ID Sample Identification S-AR Syndromaal autosomaal recessief ssdna Single stranded DNA S-X Syndromaal X gebonden T Thymine t.h.v. ter hoogte van T4 PNK T4 polynucleotide kinase TBE-buffer Tris/Borate/EDTA buffer TE-buffer Tris/EDTA buffer Tris buffer Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer Tris-Cl Tris(hydroxymethyl)aminomethane buffer hydrogen chloride UV Ultraviolet V volt vol:vol volume/volume ratio W/O emulsie Water in olie emulsie WFS1 gen Wolfram syndrome 1 gen X X-gebonden

11 INLEIDING Slechthorendheid is een zeer frequente handicap die verreikende sociale en psychologische gevolgen kan hebben. Congenitale slechthorendheid komt in Vlaanderen voor bij ongeveer 1 op 1000 pasgeborenen. In meer dan de helft van de gevallen wordt de slechthorendheid veroorzaakt door een mutatie in één enkel gen (monogeen). Op dit moment zijn ongeveer 40 verschillende genen voor nietsyndromale monogene slechthorendheid gekend, maar een meerderheid van de verantwoordelijke genen blijft nog ongekend. Erfelijke slechthorendheid is dan ook een extreem voorbeeld van genetische heterogeniciteit. Het merendeel van deze genen codeert voor eiwitten die meewerken aan het functioneren van de trilhaartjes (stereocilia) van het slakkenhuis (cochlea) in het binnenoor. Gehoorverlies dat ontstaat op latere leeftijd is nog veel frequenter dan slechthorendheid bij jonge kinderen. In tegenstelling tot erfelijke slechthorendheid bij kinderen, die vrijwel steeds monogeen is, omvat slechthorendheid met aanvang op latere leeftijd een diverse groep van complexe aandoeningen veroorzaakt door een samenspel van genen en omgeving. De onderzoeksmethode die gebruikt wordt voor het opsporen van mutaties is DNAsequencing. De eerste bruikbare sequentiemethodes, Maxam-Gilbert en Sanger, dateren van eind de jaren zeventig. De Sangermethode groeide uit tot de populairste van de twee en werd in 1980 bekroond met een Nobelprijs. De methode van Sanger wordt vandaag nog steeds gebruikt. De nieuwe generatie sequeneringstechnologieën (NGS) laten toe DNA veel sneller in kaart te brengen dan de klassieke technologieën. Het zijn zogenaamde massief parallelle sequencing technieken. Massief omdat het heel veel DNA-fragmenten kan analyseren en parallel omdat dat allemaal tegelijk gaat. Dit zijn essentiële aanwinsten, want DNA-analyses bevatten de sleutel voor het opsporen en behandelen van genetische aandoeningen, zoals doofheid. NXTGNT beschikt over twee nieuwe generatie sequeneringstechnologieën, namelijk de Genome Analyzer IIx van Illumina en de Genome Sequencer FLX (GS-FLX) van Roche Life Sciences (454 sequencing). NXTGNT is een uniek serviceplatform voor genoomanalyse dat op 8 mei 2009 werd gelanceerd door de Universiteit van Gent. Dit platform richt zich voornamelijk op de implementatie van de nieuwe generatie sequeneringstechnologieën in het genetisch onderzoek in het algemeen en de moleculaire diagnostiek in het bijzonder. Amplicon sequencing gebeurt vooralsnog met de Genome Sequencer FLX van Roche. Deze technologie heeft het voordeel dat het grote sequentiestukken produceert van de in kaart te brengen genomen: de leeslengte bedraagt basenparen (bp). De technologie is echter wel duur: de kost per basenpaar is honderd keer hoger dan bij de Illumina Genome Analyzer IIx. Daarom streeft men naar DNA-sequenering met de Illumina Genome Analyzer IIx. Het knelpunt hierbij is echter dat amplicon sequencing niet ondersteund wordt door Illumina. De amplicons zijn langer dan dat de Illumina sequeneringstechnologie kan lezen, namelijk 2 x 100 bp bij de paired end module. Met de Illumina sequeneringstechnologie zouden m.a.w. alleen de uiteinden van de amplicons gelezen worden. De nadruk van dit onderzoeksproject ligt op het ontwikkelen en optimaliseren van een protocol

12 om sequencing van lange amplicons mogelijk te maken op de Illumina Genome Analyzer IIx, een short read sequencer. Na deze inleiding volgt een literatuurstudie waarin de verschillende vormen van doofheid kort beschreven worden. In dit hoofdstuk staan ook de nieuwe generatie sequeneringstechnologiëen van Roche en Illumina gedetailleerd beschreven. Hoofdstuk 2 schetst het objectief van de studie. In hoofdstuk 3 wordt de methodologie toegelicht. Om amplicon sequencing mogelijk te maken op de Illumina Genome Analyzer IIx werd een protocol uitgewerkt van ligeren en ad random shearen. De resultaten zijn opgenomen in hoofdstuk 4. In het laatste hoofdstuk staan de conclusies van deze onderzoeksstage geformuleerd. Het praktisch werk werd uitgevoerd in het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) dat deel uitmaakt van het Universitair Ziekenhuis Gent. Het vertegenwoordigt één van de acht genetische centra in België waar erfelijkheidsonderzoek wordt uitgevoerd. Dit onderzoeksproject werd samen met Apr. Valerie Vanderstraeten uitgevoerd. In deze scriptie staan de fragmentatie-experimenten beschreven en becommentarieerd. De uitgevoerde experimenten ter optimalisatie van de ligatiereactie en de size selectie staan uitvoerig beschreven in de thesis Genetische diagnostiek van 15 volledige doofheidsgenen via second generation sequencing.

13 1. LITERATUURSTUDIE 1.1. DOOFHEID In Figuur 1.1. staat een overzicht weergegeven van de verschillende oorzaken van doofheid. Concreet zijn er vier hoofdgroepen: 1. Erfelijk en Niet-Syndromaal (NS) 2. Erfelijk en Syndromaal (S) 3. Niet-Erfelijk 4. Verworven De nummers in Figuur 1.1. hebben betrekking op de vier hoofdcategorieën. Aangeboren Verworven Erfelijk Niet-Erfelijk Niet-Syndromaal (75 %) Syndromaal (25 %) NS-AR (80 %) S-AR NS-AD (20 %) S-AD NS-X S-X NS-M Multifactorieel Virale syndromen FIGUUR 1.1.: OVERZICHT VAN DE VERSCHILLENDE CATEGORIEÊN OORZAKEN VAN DOOFHEID EN SLECHTHORENDHEID 1 Wanneer doofheid aanwezig is bij de geboorte spreekt men van congenitale of aangeboren doofheid. Congenitale doofheid kan zowel erfelijk als niet-erfelijk zijn. Ongeveer de helft van aangeboren doofheid heeft een erfelijke oorzaak. Erfelijke doofheid kan al dan niet deel uitmaken van een syndroom. De wijze van overerving kan autosomaal dominant (AD), autosomaal recessief (AR), X- gebonden (X) of mitochondriaal (M) zijn. De andere helft van congenitale doofheid wordt veroorzaakt door niet-erfelijke oorzaken zoals infecties (bv. Rubellavirus of Cytomegalovirus) en multifactoriële syndromen. Daarnaast kunnen gehoorstoornissen ook verworven zijn. Intoxicaties (bv. ototoxische aminoglycosiden) van de moeder tijdens de zwangerschap, anoxie of kernicterus van het kind tijdens de geboorte kunnen aan de basis liggen. 1

14 Erfelijke doofheid treft ongeveer 1 op 1000 kinderen. Bij de meeste dove kinderen is de doofheid de enige klinische afwijking, maar in sommige gevallen komen er nog andere symptomen voor, zoals pigment-, oog- of nierafwijkingen. Men spreekt dan van syndromale doofheid. Een voorbeeld is het Ushersyndroom dat doofheid en blindheid (door retinitis pigmentosa) combineert. De meerderheid van de gevallen is echter niet-syndromaal. In meer dan de helft van de gevallen van doofheid bij kinderen ligt de oorzaak in een mutatie in één gen (monogeen). Er zijn echter veel verschillende genen die erfelijke doofheid kunnen veroorzaken. Op dit moment zijn een 40-tal genen gekend, maar er blijven echter nog vele genen ongekend. Erfelijke doofheid is dan ook een extreem voorbeeld van genetische heterogeniciteit. 2 Slechthorendheid op volwassen leeftijd is nog veel frequenter dan slechthorendheid bij kinderen. De meest voorkomende vorm is ouderdomsslechthorendheid, een aandoening die ongeveer 50% van mensen ouder dan 80 treft. Veruit de meeste gevallen van slechthorendheid bij volwassenen kennen een complexe oorzaak, waarbij zowel omgevingsfactoren als verschillende genen interageren. Over de genen betrokken bij ouderdomsslechthorendheid is op dit moment nog veel minder geweten dan over de genen voor monogene vormen van doofheid. Een overzicht van de genen betrokken bij doofheid wordt gegeven op de Hereditary Hearing Loss Homepage, welke wordt beheerd door een Antwerpse onderzoeksgroep. 2, Erfelijke niet-syndromale gehoorstoornissen Autosomaal recessief Van de niet-syndromale gehoorstoornissen wordt 80% autosomaal recessief erfelijk overgedragen. De meeste autosomaal recessieve loci veroorzaken een zeer ernstig aangeboren gehoorverlies aan beide kanten, meestal zonder verdere progressie. In principe kan een hele reeks DFNB loci (deafness autosomal recessive) verantwoordelijk zijn, maar men denkt dat de aandoening gerelateerd is aan mutaties in het GJB2 gen ( gap junction beta 2 gen, locus DFNB1, locatie 13q11-12). Dit gen is ook bekend als het connexine 26 gen (Cx26). Connexine 26 is een transmembranair eiwit dat er voor zorgt dat de celmembranen in het binnenoor voldoende doorgankelijk zijn voor het transport van K + van de ene cel naar de andere. Algemeen wordt aangenomen dat het GJB2 gen verantwoordelijk is voor de helft van de gevallen van niet-syndromale autosomaal recessief erfelijke doofheid. Daarnaast én in incidentele gevallen spelen andere genen een rol. Enkele mutaties van dit gen kunnen ook autosomaal dominant worden overgedragen Autosomaal dominant Van de niet-syndromale gehoorstoornissen is 20 % autosomaal dominant. Het merendeel van de erfelijke niet-syndromale autosomaal dominante gehoorstoornissen is postlinguaal en van progressieve aard. Het gehoor is gedurende de eerste levensjaren nog (nagenoeg) normaal, maar er ontwikkelt zich een gehoorverlies, hetzij vanuit de lage frequenties, hetzij vanuit het middenfrequentiegebied, hetzij vanuit de hoge frequenties. Het is nog niet bekend welke locus of welk gen uit de reeks van kandidaten voor dit type progressief gehoorverlies verantwoordelijk is. 1

15 Slechts een zeer klein deel van deze autosomaal dominante gehoorstoornissen is prelinguaal (de loci DFNA3, DFNA6, DFNA14 en DFNA38). Locus DFNA3 van deze reeks wordt beschreven als een al bij de geboorte aanwezig matig tot ernstig perceptief gehoorverlies in de hoge tonen, van progressieve aard en is een gevolg van mutaties in de genen GJB2 en GJB6. De loci DFNA6, DFNA14 en DFNA38 zijn geassocieerd met een aangeboren perceptief en progressief gehoorverlies in de lage tonen (<2000 Hz). In 75% van deze gevallen is een mutatie van het gen WFS1 verantwoordelijk X-gen gebonden X-gen gebonden niet-syndromale gehoorstoornissen komen niet vaak voor (< 1%). Een goed onderzochte locus is DFN3 (POU3F4, locatie Xq21.1). De aandoening wordt gekenmerkt door een reeds bij de geboorte aanwezig gehoorverlies Mitochondriaal Niet-syndromale mitochondriale gehoorstoornissen zijn nog weinig onderzocht, vooral omdat de penetrantie van deze loci gering is. Men denkt dat gehoorverlies als gevolg van ototoxiciteit door aminoglycosiden veroorzaakt wordt door het MTRNR1 gen Erfelijke gehoorstoornissen als onderdeel van een syndroom Inmiddels zijn er meer dan 450 syndromen beschreven waarbij een gehoorstoornis optreedt. In Tabel 1.1. staan enkele relatief vaak voorkomende syndromen weergegeven volgens het type erfelijke overdracht. 1 TABEL 1.1.: OVERZICHT VAN VAAK VOORKOMENDE ERFELIJKE SYNDROMALE GEHOORSTOORNISSEN VOLGENS HET TYPE ERFELIJKE OVERDRACHT 1 Categorie Syndroom Autosomaal recessief Usher Pendred Jervell Lange-Nielsen Biotinidase deficiëntie Autosomaal dominant Waardenburg BOR Stickler Neurofibromatose 2 Treacher Collins X-gen gebonden Alport Voor eenzelfde syndroom kunnen meerdere genen verantwoordelijk zijn, kan de expressie van de genen sterk variëren en spelen omgevingsfactoren, zoals lawaai en leefpatroon, een belangrijke rol. 1

16 Complexe of multifactoriële aandoeningen en congenitale virale syndromen Syndromen, die een gevolg zijn van meerdere, meestal onbekende, factoren en waarbij de wijze van overerving niet duidelijk is, worden complexe of multifactoriële aandoeningen genoemd (zie Tabel 1.2.). 1 TABEL 1.2.: COMPLEXE OF MULTIFACTORIËLE AANDOENINGEN 1 Categorie Multifactorieel Syndroom Goldenhar CHARGE CMV (als geheel) Auditieve neuropathie Behalve de multifactoriële aandoeningen waarbij een gehoorverlies optreedt, zijn er congenitale virale syndromen die slechthorendheid of doofheid tot gevolg (kunnen) hebben. De voornaamste virale syndromen zijn Cytomegalie en het Congenitaal Rubella Syndroom Verworven aandoeningen De voornaamste oorzaken van verworven slechthorendheid en doofheid zijn labyrinthitis, meningitis, kernicterus, anoxie tijdens de geboorte en slechthorendheid als gevolg van geneesmiddelen, chemicaliën en genotmiddelen. Een gekend voorbeeld van ototoxische geneesmiddelen zijn de aminoglycosiden GENOME SEQUENCER FLX VAN ROCHE LIFE SCIENCES (454 SEQUENCING) De Genome Sequencer FLX van Roche Life Sciences behoort tot de nieuwe generatie sequeneringstechnologieën. De technologie is gebaseerd op een combinatie van emulsie PCR (empcr) en pyrosequencing. De leeslengte van bp is uniek en maakt de Genome Sequencer FLX geschikt voor zowel shotgun sequencing van ongekende genomen als amplicon sequencing. 4 Er zijn twee technologieën mogelijk op de Genome Sequencer FLX: een standaard technologie en een titanium technologie. Met de titanium technologie kunnen er in één run, die ongeveer 10 uur duurt, simultaan tot 1 miljoen fragmenten gesequeneerd worden over een lengte van 400 bp. Dit resulteert in een totale throughput van 400 tot 600 miljoen bp per run. Bij de standaard technologie is de gemiddelde leeslengte en het aantal reads per run lager dan bij de titanium technologie (zie Tabel 1.3.). 4

17 TABEL 1.3.: VERGELIJKING VAN DE TITANIUM TECHNOLOGIE MET DE STANDAARD TECHNOLOGIE OP DE GENOME SEQUENCER FLX VAN ROCHE LIFE SCIENCES 4 Technologie Roche GS-FLX Titanium Roche GS-FLX Standaard Throughput million high-quality bp per run > 100 million bp per run Run Time 10 hours 7,5 hours Read Length Modal length = 500 bases, Average length = 400 bases bases Reads per run > 1 million high-quality reads reads Het volledige sequeneringsproces van de Genome Sequencer FLX bestaat uit drie belangrijke stappen. Dit zijn achtereenvolgens: 1. Aanmaken van een library 2. Emulsie PCR 3. Pyrosequencing in de Genome Sequencer FLX Aanmaken van een library De eerste stap van het sequeneringsproces met de Genome Sequencer FLX bestaat uit het aanmaken van een library van enkelstrengige DNA-fragmenten, geflankeerd door een A en B adaptor. Adaptor A en B zijn sequenties van een 30-tal basen lang die doorheen het proces een belangrijke rol zullen spelen. Aan adaptor A annealen verschillende primertypes (amplificatie-, enrichment- en sequeneringsprimer), adaptor B is verantwoordelijk voor het aanhechten van verschillende types beads. Bij het aanmaken van een library zijn verschillende strategieën mogelijk: - PCR-strategie voor amplicon sequencing Fusion primers Om een amplicon library aan te maken wordt een PCR-reactie (Polymerase Chain Reaction) uitgevoerd met speciale fusion primers. Fusion primers zijn samengesteld uit twee delen: een targetspecifieke primer aan het 3 -uiteinde (groen stuk) en een adaptorsequentie aan het 5 -uiteinde (blauw/paars, rood en eventueel oranje/geel stuk) (zie Figuur 1.2.). De resulterende amplicons zijn klaar voor empcr en sequencing. 5

18 FIGUUR 1.2.: AMPLIFICATIE MET FUSION PRIMERS 5 M13 strategie Er kan ook een amplicon library aangemaakt worden door het uitvoeren van twee PCRreacties. Eerst wordt er een PCR-reactie uitgevoerd met primers die bestaan uit een target-specifieke sequentie aan het 3 -uiteinde en een M13 staart aan het 5 -uiteinde. Vervolgens wordt er een tweede PCR-reactie uitgevoerd met primers die bestaan uit een M13 staart aan het 3 -uiteinde en een adaptorsequentie aan het 5 -uiteinde. De resulterende amplicons zijn klaar voor empcr en sequencing. 5 - Shotgun methode voor whole genome sequencing In Figuur 1.3. staat een overzicht weergegeven van de verschillende stappen die bij het aanmaken van een library voor shotgun sequencing worden doorlopen. FIGUUR 1.3.: OVERZICHT VAN HET AANMAKEN VAN EEN LIBRARY VOOR SHOTGUN SEQUENCING 6 a) DNA-fragmentatie door nebulisatie Het DNA wordt door nebulisatie gefragmenteerd in fragmenten van bp. 7

19 b) Selecteren van de optimale fragmentlengten De optimale fragmentlengte voor sequencing met de GS-FLX titanium technologie varieert tussen de 500 en 800 bp. Langere fragmenten amplificeren niet goed bij empcr-amplificatie terwijl kortere fragmenten geen voordeel halen uit de lange leeslengtecapaciteit van de GS-FLX titanium technologie. Voor het selecteren van fragmenten met een lengte van 500 tot 800 bp zijn er twee mogelijkheden: de Gel Cut methode en de Double SPRI (Solid Phase Reversible Immobilization) methode. 7 Bij de Gel Cut methode worden de fragmenten met een lengte van 500 tot 800 bp geselecteerd door de genebuliseerde DNA-fragmenten te scheiden volgens lengte met gelelektroforese en vervolgens de bp bandjes uit de agarosegel te snijden. Bij deze methode is er 5-10 g input DNA vereist. 7 Met de Double SPRI methode kunnen alleen DNA-fragmenten met een lengte boven een bepaalde size cut-off waarde opgezuiverd worden. Voor de GS-FLX titanium technologie is de aanbevolen cut-off waarde 400 bp. Bij deze methode is er 3-5 g input DNA vereist. 7 FIGUUR 1.4.: DOUBLE SPRI METHODE 8 In Figuur 1.4. staat de procedure van de Double SPRI Methode schematisch weergegeven. In eerste instantie worden er AMPure beads toegevoegd aan het DNA-staal. AMPure beads hebben een bepaalde affiniteit voor DNA en binden de lange DNA-fragmenten. Vervolgens worden de beads aan de wand geconcentreerd met behulp van een Magnetic Particle Concentrator (MPC). In de daaropvolgende wasstap wordt het ongebonden laag moleculair gewicht DNA weggewassen met ethanol. Na de wasstap worden de DNA-fragmenten die gebonden zijn aan de beads geëlueerd met een waterige oplossing. 7 Er wordt het best gebruik gemaakt van de Gel Cut methode omdat bij de Double SPRI methode de zeer lange fragmenten die ontstaan bij nebulisatie niet verwijderd worden. Deze fragmenten amplificeren niet goed gedurende empcr-amplificatie en produceren daardoor gedurende sequencing reads met een klein signaal. De Double SPRI methode is echter wel sneller en minder arbeidsintensief dan de Gel Cut methode. De Double SPRI methode is daarom vooral geschikt wanneer verschillende bibliotheken simultaan worden aangemaakt. Bij de Double SPRI methode is er ook minder input DNA (ongeveer de helft minder) vereist in vergelijking met de Gel Cut methode. 7

20 c) Bepaling van de DNA-kwaliteit De kwaliteit van het DNA-staal wordt gecontroleerd door middel van een DNA 7500 labchip op de Agilent 2100 Bioanalyzer. 7 d) Fragment end polishing Nebuliseren van DNA zorgt voor fragmenten met overhangs. Deze fragmentuiteinden worden blunt gemaakt door de activiteit van T4 DNA-polymerase en T4 polynucleotide kinase (T4 PNK). De 5 3 polymerase activiteit van T4 DNA-polymerase vult de 5 -overhangs van DNA aan, terwijl de 3 5 exonuclease activiteit van T4 DNA-polymerase de 3 -overhangs verwijdert. De kinase activiteit van T4 PNK voegt fosfaatgroepen toe aan de 5 -hydroxyleinden. 7 e) Blunt end ligatie van adaptoren Na fragmentatie en polishing van de library worden primersequenties (adaptoren) aan de uiteinden van de DNA-fragmenten geligeerd. Er is een A adaptor en een B adaptor. Ze bevatten allebei een 4 basen lange sleutelsequentie. Deze sequentie wordt door de software gebruikt om de start van de sequentie aan te geven en te basecallen. Adaptor B bevat een biotine tag op zijn 5 - streng. 7 De adaptoren zijn zo ontwikkeld dat ze directioneel geligeerd worden aan de polished dubbelstrengige DNA-fragmenten. Elke adaptor bevat een 5 -overhang aan de amplificatie- en sequencingprimeruiteinden en een 3 -blunt end sleutelregio. Het is enkel deze 3 -blunt end sleutelregio die kan ligeren aan het blunt end double stranded DNA (dsdna) fragment. Bij de ligatie worden er verschillende producten gevormd (zie g). 7 f) Verwijdering van de kleine fragmenten Bij adaptorligatie kunnen adaptoren aan elkaar geligeerd worden, waardoor adaptordimeren gevormd worden. In deze stap worden adaptordimeren verwijderd met AMPure beads. 7 g) Immobilisatie van de library In deze stap worden de fragmenten die een B adaptor bevatten geligeerd via de biotine tag aan magnetische streptavidine gecoate beads. Bij de ligatiereactie worden er verschillende producten gevormd: - adaptor A DNA-fragment - adaptor A: deze fragmenten zullen niet binden aan de streptavidine beads en zullen verwijderd worden tijdens de wasstappen. - adaptor A DNA-fragment: deze fragmenten zullen eveneens niet binden aan de streptavidine beads en zullen weggewassen worden tijdens de wasstappen. - adaptor A DNA-fragment - adaptor B: deze fragmenten zullen uiteindelijk de enkelstrengige DNA library worden. De gebiotinileerde B adaptor zal binden aan de beads.

21 - adaptor B DNA-fragment - adaptor B: Deze fragmenten zullen eveneens binden aan de beads, maar beide strengen zullen blijven hangen aan de beads na het enkelstrengig maken. Deze fragmenten zullen dus geen deel uitmaken van de enkelstrengige DNAbibliotheek. - adaptor B DNA-fragment: deze fragmenten zullen binden aan de streptavidine beads, maar zullen niet geamplificeerd worden tijdens de empcr omdat de A amplificatieprimer niet kan binden. 7 h) Fill-in reactie Omdat de adaptoren niet gefosforyleerd zijn, zijn er gaten aanwezig aan de 3 -verbindingen met de DNA-fragmenten. Deze twee gaten worden hersteld door gebruik te maken van een stranddisplacing DNA-polymerase die de nicks herkent en de gaten opvult. Op deze manier worden fragmenten gemaakt die over de volledige lengte dubbelstrengig zijn. 7 i) Isoleren van de single stranded DNA (ssdna) library In deze stap worden de niet-gebiotinileerde strengen afgesmolten van de dubbelstrengige DNA-fragmenten door middel van een smeltoplossing (NaOH). Fragmenten met aan beide uiteinden een B adaptor zullen blijven hangen aan de beads. Er wordt een bibliotheek gevormd die bestaat uit enkelstrengige DNA-moleculen met een Adaptor A aan het 5 -einde en een Adaptor B aan het 3 - einde. 7 j) Kwaliteitscontrole van de ssdna library De kwaliteit van de DNA-library wordt gecontroleeerd door middel van een RNA Pico 6000 labchip op de Agilent 2100 Bioanalyzer. Volgende zaken zijn van belang: de range van de fragmentlengten en het voorkomen van adaptordimeren. Na deze ruwe bepaling wordt de concentratie van de stalen gemeten door middel van de RiboGreen methode Emulsie PCR Bij het proces van emulsie PCR worden de DNA-fragmenten van de library geïmmobiliseerd op beads. Het is de bedoeling om één DNA-fragment per bead te krijgen. Er wordt een W/O emulsie (water in olie emulsie) gemaakt waarbij de beads geïsoleerd worden in de waterdruppels. De waterduppels worden van elkaar gescheiden door een oliefase en fungeren als microreactoren voor de PCR-reactie. Het is de bedoeling dat elke waterdruppel één bead bevat zodat clonale amplificatie mogelijk is. Bij emulsie PCR worden er van de stukjes DNA meer dan 10 miljoen identieke kopieën gemaakt. In een laatste stap wordt de emulsie gebroken om de beads met geamplificeerd DNA uit de emulsie te halen (zie Figuur 1.5.). 9

22 FIGUUR 1.5.: OVERZICHT EMULSIE PCR 8 a) Immobilisatie van de ssdna library De ssdna-fragmenten van de bibliotheek worden geïmmobiliseerd op beads. Het is de bedoeling dat er één DNA-fragment aanwezig is per bead. Om te weten welk volume van de ssdna library moet toegevoegd worden aan de beads om 1 molecule per bead te krijgen wordt het aantal moleculen in de ssdna library berekend met onderstaande formule. 9 Molecules/ l = (concentratie library in ng/ l) x (6,022 x ) (328,3 x 10 9 ) x (gemiddelde fragmentlengte in nucleotiden) - 6,022 x : getal van Avogadro (molecules/mol) - 328,3 x 10 9 : gemiddeld moleculair gewicht van de nucleotiden (gram/mol) - concentratie van de library: waarde van de RiboGreenmeting - gemiddelde fragmentlengte: waarde uit de analyse met de Agilent Bioanalyzer De DNA-fragmenten binden aan de beads doordat Adaptor B, die zich aan het 3 -uiteinde van elk DNA-fragment bevindt, hybridiseert met complementaire nucleotiden die covalent gebonden zijn aan de beads. 9 b) Aanmaken van de W/O emulsie Om de water in olie emulsie aan te maken worden eerst de verschillende ingrediënten (geïmmobiliseerde DNA-library, amplificatiemix en emulsie-olie) samengevoegd. Vervolgens wordt het mengsel krachtig geschud met een TissueLyser homogenisator. Hierbij worden er waterdruppels (microreactoren) gevormd met een diameter van m die zich bevinden in een oliefase. Elke microreactor bevat één bead en de reagentia die nodig zijn voor amplificatie. Per ml emulsie bevinden er zich ~10 6 microreactoren. 9

23 c) Amplificatie Om het DNA in elke microreactor te amplificeren, wordt er een PCR-reactie uitgevoerd in een PCR-toestel. Hiervoor wordt de emulsie uitverdeeld in een 96-well thermocycler plaat. Er worden twee primers gebruikt: primer A en primer B. Primer B is gebonden aan de beads. Deze primer fungeerde eerder als capture primer om de DNA-fragmenten te binden aan de beads (zie a). Primer A bevindt zich in oplossing en bevat biotine. Er worden ± x 10 6 identieke kopieën gemaakt per bead. 9 d) Breken van de emulsie Na de amplificatiestap wordt de emulsie gebroken met isopropanol om de beads met geamplificeerd DNA (dubbelstrengig op dit moment) uit de emulsie te halen. 9 e) Enrichment van de beads met geamplificeerd DNA In deze stap is het de bedoeling om beads zonder DNA te verwijderen. In eerste instantie wordt het DNA enkelstrengig gemaakt met een smeltoplossing. Vervolgens wordt er een enrichment primer met biotine toegevoegd. Deze primer bindt met adaptor A van de geamplificeerde DNAfragmenten, waarmee het complementair is. Door de aanwezigheid van biotine op de enrichment primer kunnen deze beads in een volgende stap binden aan magnetische beads die gecoat zijn met streptavidine. Met een magneet kunnen deze beads gescheiden van beads zonder DNA. De beads met geamplificeerd DNA kunnen terug losgemaakt worden van de magnetische beads door gebruik van een smeltoplossing (zie Figuur 1.6.). 9 FIGUUR 1.6.: ISOLATIE VAN BEADS MET GEAMPLIFICEERD DNA 8

24 f) Annealen van de sequencing primer In deze stap wordt de sequencing primer geannealed aan de geïmmobiliseerde DNAfragmenten (zie Figuur 1.7.). 9 FIGUUR 1.7.: ANNEALING VAN DE SEQUENCING PRIMER Pyrosequencing Na amplificatie worden de DNA capture beads, die miljoenen kopijen bevatten van een enkelstrengige DNA-template, overgebracht in de 1,6 miljoen wells van een picotiterplaat. In deze wells vindt de pyrosequencingreactie plaats. Pyrosequencing is gebaseerd op chemiluminescente enzymatische reacties. Telkens als een nucleotide wordt toegevoegd aan de DNA-keten, zorgt een cascade aan enzymatische reacties voor lichtemissie. 10 FIGUUR 1.8.: OVERZICHT SEQUENCING 8 a) Laden van de beads in een picotiterplaat Om de beads te laden in de wells van een picotiterplaat wordt gebruik gemaakt van een Bead Deposition Device. De diameter van een well van een picotiterplaat is 29 m. De diameter van een bead met geamplificeerd DNA is 20 m. Dit maakt het mogelijk om per well één bead te laden. 11 Er worden 4 types beads geladen in de wells van een picotiterplaat (zie Figuur 1.9.). - DNA-beads: deze beads bevatten de DNA-library. - Enzym beads: deze beads bevatten geïmmobiliseerde enzymen voor de chemiluminescente enzymatische reactie (luciferase en sulfurylase).

25 - PPiase beads: deze beads binden anorganisch pyrofosfaat, dat bij het inbouwen van een complementair nucleotide wordt vrijgesteld, om interferentie tussen de wells tijdens elke nucleotideflow te minimaliseren. - Packing beads: deze beads houden al de componenten op hun plaats in de wells van de picotiterplaat tijdens de sequencing run. 11 FIGUUR 1.9.: VERSCHILLENDE TYPES BEADS 8 Nadat de verschillende types beads geladen zijn in de picotiterplaat, worden de picotiterplaat en de cassette met sequencingreagentia (met o.a. apyrase en nucleotiden) geladen in de Genome Sequencer FLX (zie Figuur 1.10.). Apyrase breekt na elke flow niet-ingebouwde nucleotiden af. 11 FIGUUR 1.10.: GENOME SEQUENCER FLX 8 b) Sequencing Pyrosequencing is gebaseerd op het principe van sequencing-by-synthesis. De sequentie van een template enkelstrengig DNA wordt m.a.w. bepaald door synthese van de complementaire streng. De pyrosequencingreactie vindt plaats in de wells van een picotiterplaat. Men laat over de plaat een reactiemengsel stromen met één van de vier basen, zodat een koppelingsreactie kan plaatsvinden. Als er een complementair nucleotide wordt ingebouwd, komt er een serie chemische reacties op gang die eindigt met de omzetting van luciferine in oxyluciferine (zie Figuur 1.11.). Dat gaat gepaard met een lichtflits, die wordt geregistreerd door een sensor. Daarna leidt men een mengsel met de volgende base over de plaat en begint het proces opnieuw. Van alle 1,6 miljoen DNA-fragmenten wordt zo parallel en automatisch de volgorde bepaald. 10,11

26 Concreet gebeurt er het volgende: Wanneer het DNA-polymerase één van de vier deoxynucleotidetrifosfaten (dntps) inbouwt, wordt pyrofosfaat (PPi) vrijgesteld. ATP sulfurylase zet PPi om in adenosine trifosfaat (ATP) in de aanwezigheid van adenosine 5 fosfosulfaat (APS). In een volgende stap zet luciferase met behulp van ATP luciferine om naar oxyluciferine. Hierbij wordt een hoeveelheid licht geproduceerd die evenredig is met de hoeveelheid gevormd ATP en dus met het aantal geïncorporeerde nucleotiden. Een CCD camera neemt een foto van de picotiterplaat na elke flow van nucleotiden. 10,11 FIGUUR 1.11.: PYROSEQUENCING 8 De software plaatst de genomen foto s in volgorde na elkaar. Per well en flowcyclus wordt gekeken of er al dan niet een reactie is opgetreden (zie Figuur 1.12.). De eerste vier nucleotiden die worden gesequeneerd zijn deze van de sleutelsequentie. De sleutelsequentie is een gekende sequentie van vier nucleotiden die onmiddellijk naast de sequencing primer is gelokaliseerd. Deze sequentie wordt door de software gebruikt om de start van de sequentie aan te geven en te basecallen. 11 FIGUUR 1.12.: DATAVERWERKING 8 Dataverwerking levert voor elke well een flowgram op (zie Figuur 1.13.). Hierin wordt de intensiteit van het signaal voor elke nucleotideflow in kaart gebracht in functie van de flowvolgorde. De intensiteit van het signaal is evenredig met het aantal toegevoegde basen. Er is m.a.w. sprake van een lineair verband. Als er bij een bepaalde nucleotideflow geen base wordt ingebouwd, is het signaal zeer

27 laag (backgroundsignaal). Als er één nucleotide wordt ingebouwd, dan is de intensiteit van dit signaal gelijk aan de intensiteit van een signaal van de sleutelsequentie. Als er meer dan één nucleotide wordt toegevoegd, is het signaal groter. 11 FIGUUR 1.13.: FLOWGRAM EN BASE CALLING 8 Pyrosequencing kan problemen geven met homopolymeren: DNA met repeterende kopieën van een bepaalde base, bijvoorbeeld tienmaal A (adenine) naast elkaar. In dat geval worden bij de inbouwreactie meerdere basen tegelijk gekoppeld. Het lichtflitsje waarmee dit gepaard gaat is evenredig sterker bij het inbouwen van twee basen is het nagenoeg twee keer zo intens, maar het verschil bij zeven of acht basen is niet groot. De analyse van zo n DNA-fragment is daardoor onnauwkeurig ILLUMINA GENOME ANALYZER IIx Bij de Illumina sequeneringstechnologie worden de ad random gefragmenteerde DNAstrengen gebonden aan het oppervlak van een microscopisch plaatje (flowcell). De DNA-strengen worden ter plaatse bridge geamplificeerd. Dit resulteert in een flowcell met een hoge densiteit van clusters, die elk ongeveer 1000 kopieën bevatten van dezelfde template. De templates worden simultaan gesequeneerd met de reversible terminator-based sequencing technologie en digitaal opgeslagen waarna, via bioinformaticatools de code kan ontcijferd worden. Homopolymeren kunnen hiermee, in tegenstelling tot 454 sequencing, nauwkeurig geanalyseerd worden. De leeslengte van de Illumina sequeneringstechnologie bedraagt 2 x 100 bp (paired end module). 12 Voor een gedetailleerde beschrijving van de Illumina sequeneringstechnologie wordt verwezen naar de scriptie Genetische diagnostiek van 15 volledige doofheidsgenen via second generation sequencing.

28 2. OBJECTIEVEN Dit onderzoeksproject heeft als doel om een methode te ontwikkelen om sequencing van lange amplicons mogelijk te maken op de Illumina Genome Analyzer IIx, een short read sequencer. Amplicon sequencing gebeurt vooralsnog met de Genome Sequencer FLX van Roche. Er wordt gestreefd naar amplicon sequencing met de Illumina sequeneringstechnologie omwille van een hogere throughput en lagere kostprijs per basenpaar in vergelijking met 454 sequencing. Meer specifiek is het de bedoeling om vijftien doofheidsgenen bij vijf patiënten te sequeneren met de Illumina Genome Analyzer IIx. Het heikel punt bij de Illumina sequeneringstechnologie is dat de amplicons langer zijn dan dat het Illumina toestel kan lezen, namelijk 2 x 100 bp. Met de Illumina sequeneringstechnologie zouden m.a.w. enkel de uiteinden van de amplicons gelezen worden. Om dit probleem op te lossen werd een protocol bedacht van ligeren en ad random fragmenteren. Het ziet er als volgt uit: a. Opzuivering van de qpcr-producten b. End repair van de amplicons c. Ligeren van de amplicons d. Size selectie van het geligeerde DNA e. Ad random shearen van het geligeerde DNA f. Library preparation voor Illumina sequencing De studie bestaat erin om de verschillende stappen van dit protocol te optimaliseren. Voor het ligeren van de amplicons, de size selectie van het geligeerde DNA en de shearing worden verschillende strategieën met elkaar vergeleken. Uit de resultaten van deze vergelijkende studies worden de beste condities geselecteerd voor het finale protocol voor amplicon sequencing met de Illumina Genome Analyzer IIx. Het onderzoeksproject gebeurde in samenwerking met Apr. Valerie Vanderstraeten. In deze scriptie ligt de nadruk op de ad random shearing van het hoog moleculair gewicht (HMW) geligeerde DNA. In de scriptie Genetische diagnostiek van 15 volledige doofheidsgenen via second generation sequencing van Valerie staan de resultaten van de experimenten ter optimalisatie van de ligatie en size selectie beschreven.

29 # Amplicons 3. MATERIALEN EN METHODEN 3.1. BESCHRIJVING DNA-STALEN We beschikken over DNA-stalen van 5 patiënten met erfelijke doofheid. De stalen hebben de volgende code: - Staal 1: sh5 S1 - Staal 2: Staal 3: Staal 4: hl ir Staal 5: hl ir2 35 Het is de bedoeling om bij elk van deze 5 patiënten 15 volledige doofheidsgenen te sequeneren met de Illumina Genome Analyzer IIx. Deze 15 doofheidsgenen bevatten in totaal 628 exonen. De lengtedistributie van deze amplicons staat weergegeven in Figuur 3.1. De totale lengte van de amplicons bedraagt basenparen Lengte (bp) FIGUUR 3.1.: LENGTEDISTRIBUTIE VAN DE AMPLICONS Het praktisch werk van dit onderzoeksproject werd samen met Apr. Valerie Vanderstraeten uitgevoerd. In deze scriptie staan de fragmentatie-experimenten beschreven en becommentarieerd. De uitgevoerde experimenten ter optimalisatie van de ligatiereactie en de size selectie staan uitvoerig beschreven in de thesis van Valerie. De eerste belangrijke stap die werd uitgevoerd is de amplificatie van de exonen van de vijftien te sequeneren doofheidsgenen met een qpcr-reactie. In een volgend stadium werden de PCRproducten opgezuiverd, waarna de uiteinden blunt werden gemaakt voor ligatie in een end-repair reactie. De ligatiereactie werd getest met drie verschillende inputhoeveelheden (relatieve inputconcentratie 1, 10 en 39) op twee stalen, nl. de stalen hl ir2 27 en hl ir2 35. Om de HMW geligeerde DNA-fragmenten op te zuiveren uit de ligatiereactie werden twee methodes getest, namelijk de Double SPRI methode en de Chroma Spin 1000 kolom.

30 In een volgende stap is het de bedoeling om de opgezuiverde HMW geligeerde DNAfragmenten ad random te shearen. In dit deel van het onderzoeksproject worden twee shearing methodes met elkaar vergeleken, namelijk het enzyme NEBNext TM dsdna Fragmentase en Covaris. Hieronder volgt een bespreking van de verschillende technieken, met uitzondering van de ligatie, end-repair en size selectie, die gebruikt werden bij de fragmentatie-experimenten. De ligatie, end-repair en size selectie methoden staan gedetailleerd beschreven in de scriptie Genetische diagnostiek van 15 volledige doofheidsgenen via second generation sequencing KWANTIFICATIE VAN DS DNA Quant-it TM Picogreen dsdna kit Principe Het principe van de Quant-iT TM PicoGreen dsdna kit steunt op fluorimetrie. Dubbelstrengig DNA wordt fluorescerend gemaakt door gebruik te maken van Picogreen, een kleurstof die bindt aan de kleine groeve van dubbelstrengig DNA. Picogreen levert op deze wijze een directe methode voor kwantificering van dubbelstrengig DNA. 13 Zoals het geval is bij veel andere kwantitatieve technieken, moet men bij fluorimetrie een kalibratie uitvoeren, dit is een ijklijn opstellen. De ijklijn wordt opgesteld met standaarden met een gekende concentratie dsdna. Door gebruik te maken van interpolatie kan de concentratie van het staal bepaald worden, na meting van de intensiteit van fluorescentie van het staal. De intensiteit van fluorescentie wordt gemeten met een fluorescence microplate reader Procedure a) Voorbereiding In deze stap worden de 1 x TE-buffer, het PicoGreen Reagens, de standaarden voor het opstellen van de ijklijn en (eventuele) verdunningen van de stalen klaargemaakt. 1 x TE-buffer 1. Leng 1 ml 20xTE aan met 19 ml steriel, gedestilleerd DNAse-vrij water (1/20 verdunning). 2. Vortex. PicoGreen Reagens 1. Laat het Quant-iT TM PicoGreen reagens op kamertemperatuur komen voor 15 minuten. 2. Leng 10 l Quant-iT TM PicoGreen reagens aan met 1990 l TE-buffer (1/200 verdunning). 3. Vortex. Het PicoGreen Reagens wordt klaargemaakt in een plastic tube omdat PicoGreen kan adsorberen aan glas. Het PicoGreen Reagens wordt ten allen tijde afgeschermd van licht (met aluminiumfolie) omdat PicoGreen onderhevig is aan fotodegradatie.

31 Standaarden voor ijklijn Uitgaande van een Lambda DNA standaardoplossing (100 g/ml in TE-buffer), worden twee stockoplossingen gemaakt met een concentratie van respectievelijk 2 g/ml en 20 ng/ml. 2 g/ml stockoplossing 1. Leng 20 l van de Lambda DNA standaardoplossing aan met 980 l TE-buffer (1/50 verdunning van de Lambda DNA standaardoplossing). 2. Vortex. 20 ng/ml stockoplossing 1. Leng 10 l van de 1/50 verdunning (2 g/ml stockoplossing) aan met 990 l TE-buffer (1/100 verdunning van de 2 g/ml stockoplossing). 2. Vortex. b) Quant-it Picogreen meting dsdna Negen ijklijnpunten Er wordt een ijklijn opgesteld met 9 standaarden. De standaarden hebben een concentratie gaande van 0 ng/ l tot 30 ng/ l. De standaarden worden rechtstreeks bereid in wells van een 384-well plaat (zie Tabel 3.1.). Hierbij wordt eerst TE-buffer in de wells gepipetteerd en daarna het DNA. De standaarden worden in tweevoud bereid en gemeten. De gemiddelde Rfu-waarden worden gebruikt voor het opstellen van de ijklijn. TABEL 3.1.: BEREIDING VAN DE IJKLIJNPUNTEN Hoeveelheid DNA Volume ( l) van DNA stockoplossingen 0 ng 0 l 50 l 0,25 ng 12,5 l van 20 ng/ml 37,5 l 0,5 ng 25 l van 20 ng/ml 25 l 1 ng 50 l van 20 ng/ml 0 l 5 ng 2,5 l van 2 g/ml 47,5 l 10 ng 5 l van 2 g/ml 45 l 15 ng 7,5 l van 2 g/ml 42,5 l 20 ng 10 l van 2 g/ml 40 l 30 ng 15 l van 2 g/ml 35 l Volume ( l) van TE-buffer Te meten stalen Van elk staal wordt 1 l gepipetteerd in een well van de 384-well plaat, na het pipetteren van 49 l TE-buffer in de wells.

32 Toevoegen van PicoGreen Reagens Het is heel belangrijk dat het PicoGreen Reagens pas op het einde (dit wil zeggen vlak voor de fluorescentiemeting) wordt toegevoegd, zowel voor de standaarden als voor de te meten stalen. Na deze stap is in elke well een volume van 100 l aanwezig. 1. Voeg aan elke well 50 l PicoGreen Reagens toe. 2. Centrifugeer de 384-well plaat. 3. Incubeer voor 2-5 minuten bij kamertemperatuur, afgeschermd van licht. Fluorescentiemeting Voor de fluorescentiemeting wordt gebruik gemaakt van de fluorescence microplate reader Fluostar optima, waarin de 384-well plaat wordt geladen. Na het opstarten van de software Fluostar Optima (administrator ok) dient de volgende procedure te worden gevolgd: 1. Setup: reader configuration => fluorescentie => ok 2. Test setup: test protocol => picogreen: dubbelklikken => lay-out => stalen en standaarden ingeven => ok 3. Measure: Select protocol picogreen => ok => gain adjustment (op hoogste standaard) => ok => start measurement => results => raw data Nanodrop 1000 Spectrofotometer Principe Dubbelstrengig DNA vertoont een maximale absorptie bij 260 nm. In een spectrofotometer wordt het staal blootgesteld aan UV-licht met een golflengte van 260 nm waarna een fotodetector de transmissie meet. Hoe meer licht het staal absorbeert, hoe hoger de DNA-concentratie in het staal. Met behulp van de Wet van Lambert Beer kan de hoeveelheid geabsorbeerd licht gerelateerd worden aan de DNA-concentratie in het staal. 14 De Nanodrop 1000 Spectrofotometer maakt het mogelijk om kleine staalvolumes (1 µl) te analyseren. Het staal wordt gepipetteerd in het onderste contactpunt, waarna het toestel wordt gesloten (sampling arm naar beneden). Op die manier wordt de druppel samengedrukt en vormt het staal als het ware een kolom die door de oppervlaktespanning op zijn plaats wordt gehouden (zie Figuur 3.2.). In tegenstelling tot een klassieke spectrofotometer zijn er geen cuvetten nodig, wat een snelle reiniging toelaat. 14 FIGUUR 3.2.: KOLOMVORMING OP DE NANODROP 1000 SPECTROFOTOMETER 14

33 De opname van het absorptiespectrum (tussen 220 nm 750 nm) gebeurt bij een weglengte van 10 mm. De analyse gebeurt door het Nanodrop 1000 software pakket Procedure 1. Open de software Nanodrop 1000 en selecteer nucleic acid. 2. Reinig het toestel (de contactpunten) met een vezelvrij doekje (Kimwipes). 3. Laad 1,5 l sigmawater. 4. Klik op OK. 5. Selecteer DNA 50 bij sample type. 6. Reinig het toestel. 7. Laad 1,5 l elutiebuffer (Buffer EB). 8. Klik op blank. 9. Inspecteer de basisabsorptielijn. 10. Reinig het toestel. 11. Laad 1,5 l elutiebuffer (Buffer EB) en typ bij sample ID: BLANK. 12. Klik op measure. 13. Reinig het toestel. 14. Laad 1,5 l van het staal. Typ bij sample ID de naam van het staal. Klik op measure. Reinig het toestel na de meting. 15. Meet de volgende stalen. 16. Laad, ter controle, nogmaals 1,5 l elutiebuffer (Buffer EB). Typ bij sample ID: BLANK. Klik op measure. 17. Klik op Show Report voor een overzicht van de resultaten van de metingen. 18. Klik op Plots om de absorptiespectra te bekijken DNA-OPZUIVERING QIAquick PCR Purification Kit Om DNA-stalen op te zuiveren kan gebruik gemaakt van de QIAquick PCR Purification Kit. DNA-fragmenten met een lengte van 100 bp tot 10 kb adsorberen aan een silicamembraan van een QIAquick spin kolom in de aanwezigheid van een hoge zoutconcentratie, terwijl contaminanten zoals primers, nucleotiden, polymerasen en zouten verwijderd worden. Het DNA wordt geëlueerd met Tris Buffer of water. De maximale bindingscapaciteit van de kolom bedraagt 10 g. Het reservoir van de kolom heeft een capaciteit van 800 l. 15

34 Principe De adsorptie van DNA aan een QIAquick membraan is zout- en ph- afhankelijk. DNA bindt op silica in de aanwezigheid van chaotropische zouten. Deze zouten veranderen de structuur van water. Ze verminderen de hydrofiliciteit van water door waterstofbruggen, die moleculen in water vormen, te verbreken. Ze veroorzaken ook een denaturatie van het DNA. Door deze effecten kan het DNA binden op silica. Dit is een specifiek bindingsproces waardoor DNA gescheiden kan worden van onzuiverheden. De adsorptie van DNA aan silica hangt ook af de ph. 95 % van het DNA adsorbeert aan silica als de ph 7,5. Dit reduceert drastisch bij hogere ph (zie Figuur 3.3.). 15 Gedurende de adsorptie van DNA aan de silicamembraan zullen primers en andere onzuiverheden zoals zouten, enzymen en nucleotiden niet binden aan de silicamembraan maar doorheen de kolom vloeien. Zouten worden weggewassen door een wasstap met Buffer PE die ethanol bevat. Residuen van Buffer PE, die kunnen interfereren bij een enzymatische reactie, worden verwijderd door een additionele centrifugatiestap. 15 In een laatste stap wordt het DNA geëlueerd. De efficiëntie van elutie hangt sterk af van de zoutconcentratie en de ph van de elutiebuffer. In tegenstelling tot adsorptie, is elutie het meest efficiënt bij een basische ph en lage zoutconcentratie. DNA wordt geëlueerd met 50 of 30 l Buffer EB (10 mm Tris-Cl, ph 8,5) of water. 15

35 FIGUUR 3.3.: PH-AFHANKELIJKHEID VAN DE ADSORPTIE VAN DNA AAN DE QIAQUICK MEMBRAAN Procedure Belangrijke opmerkingen voor het starten van de procedure: - Voeg ethanol (96-100%) toe aan Buffer PE voor gebruik. - Voer alle centrifugatiestappen uit bij 17,900 x g (13,000 rpm) in een standaard microcentrifugator bij kamertemperatuur. - Er wordt geen ph-indicator gebruikt omdat deze mogelijks kan storen bij een enzymatische reactie. Dit levert normaal geen problemen op aangezien er 5 volumina PE-Buffer worden toegevoegd met de juiste ph Voeg 5 volumes PB-Buffer toe aan 1 volume PCR-product. Vortex kort om te mengen. 2. Plaats de QIAquick spin kolom in een 2 ml collection tube. 3. Pipetteer het DNA-staal over in de QIAquick spin kolom en centrifugeer voor seconden om het DNA te binden op de membraan. 4. Verwijder de flow-through uit de collection tube. Plaats de QIAquick spin kolom terug in dezelfde collection tube. 5. Voeg 750 l Buffer PE toe aan de QIAquick spin kolom en centrifugeer voor seconden. 6. Verwijder de flow-through uit de collection tube. Plaats de QIAquick spin kolom terug in dezelfde collection tube. Centrifugeer de kolom voor 1 minuut. 7. Plaats de QIAquick kolom in een nieuw 1,5 ml microcentrifuge buisje. 8. Voeg, om het DNA te elueren, 50 l Buffer EB (10 mm Tris-Cl, ph 8,5) of water (ph 7,0-8,5) toe in het midden van de QIAquick membraan en centrifugeer de kolom voor 1 minuut. Controleer of het gemiddelde volume van het eluaat ongeveer 48 l bedraagt MinElute PCR Purification Kit Het principe en de de procedure van de MinElute PCR Purification Kit zijn volledig analoog aan deze van de QIAquick PCR purification kit. De belangrijkste verschillen met de QIAquick PCR Purification kit zijn:

36 - Opzuivering van 80 % van DNA-fragmenten met een lengte van 70 bp tot 4 kb. - Kleiner elutievolume, nl.10 l. - De maximale bindingscapaciteit van de kolom bedraagt 5 g AGILENT BIOANALYZER Principe De werking van de Agilent 2100 Bioanalyzer berust op capillaire gelelektroforese, waarmee DNA-fragmenten gescheiden worden volgens grootte. Agilent DNA-kits bevatten chips en reagentia voor het analyseren van DNA-fragmenten. Een Agilent DNA-chip bestaat uit een netwerk van microkanalen en reservoirs. Door de kanalen met een gelmatrix te vullen en de reservoirs met staal, is er elektroforese mogelijk op miniatuurschaal. Er is slechts 1 l staal nodig per analyse. De reagentia van de kit zijn: - DNA-ladder - DNA-markers - DNA-dye concentrate - DNA-gel matrix 17 FIGUUR 3.4.: AGILENT 2100 BIOANALYZER 17 Met een High Sensitivity DNA kit is kwantificatie en scheiding van DNA-fragmenten volgens grootte mogelijk voor DNA-stalen met een concentratie in de pg/ l range (5-500 pg/ l). Op een High Sensitivity DNA chip kunnen er maximaal 11 stalen geladen worden. 17 FIGUUR 3.5.: AGILENT HIGH SENSITIVITY DNA KIT 17

37 Procedure Stap 1: Decontamineren van de elektroden 1. Vul een van de wells van de elektrode cleaner met RNAseZap. 2. Open de klep van de Agilent 2100 Bioanalyzer en plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer. 3. Sluit de klep en laat ze gedurende 1 minuut dicht. 4. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner. 5. Vul een van de wells van een andere electrode cleaner met RNase-vrij water. 6. Plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer. 7. Sluit de klep en laat het gedurende 10 seconden dicht. 8. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner. Stap 2: Aanmaken van een gel-dye mix. De gel-dye mix heeft een houdbaarheidstermijn van 1 maand. 1. Laat het dye concentraat en de gel matrix gedurende 30 minuten op kamertemperatuur equilibreren. 2. Voeg 15 l van het dye concentraat toe aan de gel matrix. 3. Vortex goed en breng het mengsel over in een spin filter. 4. Centrifugeer het mengsel aan 2240 g gedurende 10 minuten. 5. Bescherm de oplossing van licht en bewaar de oplossing bij 4 C. Stap 3: Laden van de gel-dye mix. 1. Breng een nieuwe High Sensitivity DNA chip in het Chip Priming Station. 2. Pipetteer 9,0 l van de gel-dye mix in de well gemarkeerd met. 3. Sluit het Chip Priming Station. Zorg ervoor dat de duiker van de spuit op 1 ml staat. 4. Druk de hendel aan totdat de clip van de spuit vastzit. 5. Wacht gedurende 60 seconden en laat de clip dan los. 6. Wacht nog 5 seconden en breng dan de duiker van de spuit langzaam terug op 1 ml. 7. Open het Chip Priming Station en pipetteer 9,0 l van de gel-dye mix in de wells die aangeduid zijn met. Stap 4: Laden van de merker. 1. Pipetteer 5 µl van de merker in alle sample wells en de well gemarkeerd met een ladder. Stap 5: Laden van de stalen en de ladder. 1. Pipetteer 1 l van de DNA-ladder in de well gemarkeerd met een ladder. 2. Pipetteer 1 l sample in één van de 11 wells. 3. Pipetteer 1 l merker in elke ongebruikte well. 4. Vortex de chip gedurende 1 minuut aan 2400 rpm. 5. Run de chip in de Agilent 2100 Bioanalyzer binnen de 5 minuten.

38 Stap 6: Reinigen van de Agilent 2100 Bioanalyzer 1. Vul een van de wells van een andere electrode cleaner met RNase-vrij water. 2. Plaats de elektrode cleaner in de Agilent 2100 Bioanalyzer. 3. Sluit de klep en laat het gedurende 10 seconden dicht. 4. Open de klep en verwijder de elektrode cleaner AGAROSEGELEKTROFORESE Principe Met gelelektroforese kunnen DNA-fragmenten gescheiden worden op basis van hun grootte. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van de negatieve lading die DNA bezit, veroorzaakt door de negatief geladen fosfaatgroepen in DNA. Het spanningsverschil dat zal worden aangebracht over de gel zorgt ervoor dat aan de bovenkant de gel negatief geladen wordt en aan de onderkant de gel positief geladen wordt. DNA-fragmenten worden aangetrokken door de positieve pool en zullen zich van boven naar beneden in de gel gaan bewegen. De kleine fragmenten hebben een hogere mobiliteit doorheen gelstructuren dan grote fragmenten. Hierdoor zullen op het moment dat het spanningsverschil wordt opgeheven, de kleine fragmenten verder naar beneden zijn gelopen dan de grotere fragmenten. In de gel wordt een patroon van smalle bandjes zichtbaar. Elk streepje bevat miljoenen of miljarden stukjes DNA die even lang zijn. De desgewenste bandjes kunnen vervolgens uit de gel gesneden worden. 18 Praktisch wordt de gel, na het maken van de gel op basis van poeder en water, in een reservoir gelegd met een bufferoplossing. Het te scheiden mengsel wordt in de uitsparingen t.h.v. de kathode in de gel geïnjecteerd en de spanning wordt aangelegd. Door in de andere rijen (lanes) gebruik te maken van oplossingen met DNA-fragmenten met een gekende grootte (basenparenladders), kan men de fragmentgrootte bepalen. 18 Om de DNA-moleculen zichtbaar te maken kan men DNA fluorescent labelen. Een methode van labeling is het gebruik van intercalators. Intercalators zijn moleculen die in de DNA-dubbelhelix verankeren en zo een fluorescerend DNA-intercalator complex vormen. In niet-gecomplexeerde vorm fluoresceren intercalators nauwelijks. Een scala aan intercalators is beschikbaar, bijvoorbeeld ethidium bromide (optimum in UV-gebied) of Sybr Green Procedure Stap1: Bereiden van een 1,2 % agarose gel 1. Weeg 3 g agarose af en breng over in een erlenmeyer. 2. Voeg 250 ml 1 x TBE-buffer toe aan de erlenmeyer en zwenk een aantal keer om. 3. Verwarm de agarose-oplossing in een microgolfoven totdat de agarose helemaal opgelost is (heldere oplossing). 4. Laat de agarose-oplossing afkoelen onder koud stromend water tot ongeveer 50 C (handwarmte). 5. Voeg 4 druppels ethidiumbromide toe aan de agarose-oplossing en zwenk de erlenmeyer een aantal keer om om te mengen.

39 6. Plaats een kam in de gietvorm. De kam dient ervoor om, na het stollen, kleine gleufjes (slotjes) in de gel te doen onstaan, waarin het staal kan worden gebracht. De onderkant van de kam mag de bodem niet raken, omdat anders het staal onder de agarosegel zou kunnen terecht komen. 7. Giet de gel in de gietvorm en verwijder de aanwezige luchtbellen. 8. Spoel de erlenmeyer meteen na het uitgieten een aantal keer uit met water. 9. Laat de gel stollen gedurende minuten bij kamertemperatuur. Stap 2: Bereiding van de stalen 1. Pipetteer bij elk DNA-staal (6 l) 3 l Orange-G en 1 l H 2 O (eindvolume = 10 l). Vortex en centrifugeer. 2. Twee markers: Pipetteer 6,3 l H 2 O in een epje. Pipetteer hierbij 3 l Orange-G en 0,7 l van een 1kb DNA-ladder (eindvolume = 10 l). Vortex en centrifugeer. Stap 3: Laden van de stalen & run van de gel 1. Verwijder voorzichtig de kam uit de gel. 2. Breng de gel over naar een elektroforesebak die gevuld is met 1 x TBE-buffer (de gel moet ondergedompeld zijn in 1 x TBE-buffer). De TBE-buffer zorgt voor een goede geleiding van de stroom. 3. Pipetteer voorzichtig de stalen (10 l) in de slotjes van de gel. Laad de DNA-ladders in de eerste en laatste laan van de gel. 4. Noteer waar je welk monster hebt gepipetteerd. 5. Plaats het deksel op de elektroforesebak. 6. Sluit de elektroden aan op de spanningsbron. 7. Stel de spanningsbron in op 140 V. 8. Kijk of er luchtbelletjes gevormd worden aan de anode en kathode (door elektrolyse). Stap 4: Bekijken van de gel onder UV-licht & fotograferen van de gel 1. Schakel de spanningsbron uit. 2. Verwijder het deksel van de elektroforesebak. 3. Haal het bakje met de gel uit de buffer. Doe dit voorzichtig aangezien de gel los in het bakje ligt. Droog de onderkant van het bakje af. 4. Schuif de gel uit het bakje en leg de gel op de transilluminator. Doe dit voorzichtig, anders kan de gel breken. 5. Schakel de UV-lamp aan. 6. Maak een foto van de gel met behulp van een camera die boven de gel wordt geplaatst FRAGMENTATIE Voor paired-end sequencing (2x100 bp) met de Illumina Genome Analyzer IIx zijn DNAfragmenten nodig van 300 bp. Het is de bedoeling om enerzijds het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA en anderzijds de originele amplicons te fragmenteren. Het is van cruciaal belang dat deze fragmentatie ad random gebeurd. In dit onderzoeksproject worden twee shearing methodes met elkaar vergeleken, nl. het enzyme NEBNext TM dsdna Fragmentase en Covaris.

40 NEBNext dsdna Fragmentase Principe NEBNext TM dsdna Fragmentase fragmenteert dsdna op een tijdsafhankelijke manier in fragmenten van 100 tot 800 bp (zie Figuur 3.6.). De uiteindelijke lengte van de fragmenten is afhankelijk van de reactietijd. NEBNext TM dsdna Fragmentase bevat twee enzymen. Eén enzyme genereert ad random nicks in de DNA dubbelstreng; het andere enzyme herkent de geknipte streng en knipt de andere streng recht tegenover de nick door, waardoor een dubbelstrengige breuk wordt gegenereerd. De resulterende DNA-fragmenten bevatten korte overhangs. 19 FIGUUR 3.6.: SHEARING VAN DS DNA MET NEBNEXT DS DNA FRAGMENTASE 19 NEBNext TM dsdna Fragmentase bevat twee endonucleasen, geïsoleerd uit twee verschillende E. Coli stammen. Eén construct brengt een fusie-eiwit tot expressie dat bestaat uit een E. coli maltose bindend proteïne en Vibrio vulnificus nuclease mutant proteïne. De andere E. Coli stam brengt een fusie-eiwit van een maltose bindend proteïne en een T7 endonuclease mutant proteïne tot expressie. 19 Er bestaan 4 verschillende protocollen voor het NEBNext TM dsdna Fragmentase. Het protocol dat in dit onderzoek wordt gebruikt is dit voor fragmentatie van RT-PCR- en PCR-producten. In Tabel 3.3. staan de aanbevolen reactietijden weergegeven om RT-PCR- of PCR-producten te fragmenteren in de gewenste lengte. 19 TABEL 3.3.: NEBNext dsdna Fragmentase reactietijden voor RT-PCR- en PCR-producten 20 Desired Fragment Size (bp) Incubation Time (min) In onderstaande grafiek staat een overzicht van de relatieve fragmentgrootte in functie van verschillende incubatietijden (zie Figuur 3.7.).

41 FIGUUR 3.7.: DISTRIBUTIE VAN RT-PCR PRODUCTEN (5,8 KB) GEPRODUCEERD MET DS DNA FRAGMENTASE EN GEANALYSEERD MET DE BIOANALYZER Procedure 1. Zet de digestiereactie op bij kamertemperatuur (zie Tabel 3.4.). Op dit punt moet dsdna Fragmentase nog niet toegevoegd worden. TABEL 3.4: dsdna FRAGMENTASE REACTIECONDITIES VOOR RT-PCR- EN PCR- PRODUCTEN 20 Reaction Components Starting DNA Amount PCR or RT-PCR product ( g) X Fragmentase Reaction Buffer ( l) X BSA ( l) 0,2 0,4 0,6 0,8 1 dsdna Fragmentase ( l) sterile H 2 O ( l) variable variable variable variable variable Final Volume ( l) Vortex en centrifugeer. 3. Incubeer op ijs voor 5 minuten. 4. Voeg dsdna Fragmentase toe. Vortex kort en centrifugeer. 5. Incubeer bij 37 C. 6. Stop de reactie door toevoeging van 5 l 0,5 M EDTA. 7. Zuiver het DNA-staal op. In dit onderzoek wordt hiervoor gebruik gemaakt van QIAquick PCR Purification Kit en van de MinElute PCR Purification Kit. 20

42 Covaris Adaptive Focused Acoustics TM (AFA) Principe Net zoals sonicatie is Covaris AFA TM een proces gebaseerd op akoestische energie. Bij covaris worden extreem hoge ultrasone geluidsgolven (460 khz), opgewekt door een transducer, gefocusseerd in een klein oppervlak (focale zone). In deze focale zone vindt energietransfer plaats naar het sample (zie Figuur 3.8.). In essentie laat covaris toe om gecontroleerd en isotherm mechanische energie te transfereren op een sample, zonder direct contact met het sample. Het sample kan zich bevinden in gesloten buizen, epjes of micro-titer platen. 21 FIGUUR 3.8.: PRINCIPE VAN COVARIS 21 Een transducer bestaat uit een piëzo-elektrisch kristal. Dit kristal vibreert onder invloed van elektrische spanning met een hoge frequentie waardoor ultrasone geluidsgolven (niet hoorbaar met het menselijk oor) geproduceerd worden (zie Figuur 3.9.). Als de intensiteit van de ultrasone geluid laag is, kan dit een gecontroleerde menging van het sample veroorzaken. Bij hoge energie-intensiteit, kan dit een zodanige shock teweegbrengen in het sample, dat het sample uiteenvalt. 21 FIGUUR 3.9.: TRANSDUCER MET ULTRASONE GELUIDSGOLVEN 21 Adaptive Focused Acoustics of AFA is een vorm van mechanische energie. Wanneer deze akoestische/mechanische energie getransfereerd wordt op het sample, zorgt dit voor afwisselende compressie- en expansiefasen van het medium die op hun beurt ervoor kunnen zorgen dat er microscopische bellen ontstaan. Dit wordt cavitatie genoemd. De bellen die hierbij ontstaan worden zelf ook beïnvloed door de compressie en expansie en ze kunnen daardoor al of niet stabiel zijn. Noninertiële cavitatie is het ontstaan van stabiele bellen, deze krimpen en groeien ongeveer evenveel gedurende compressie en expansie. De microbellen kunnen echter ook instabiel zijn, dit wordt inertiële cavitatie genoemd. Deze bellen imploderen vrij snel, waarbij zeer grote hoeveelheden energie vrijkomen. Wanneer er zeer veel bellen op een korte tijd (microseconden) collaberen, heeft dit proces een zeer grote meng- en disruptiecapaciteit. 21

43 De implosie van de microbellen en de druk die daarbij ontstaat oefenen zelf ook kracht uit op de vloeistof. Deze krachten, eerst inwaarts gericht gedurende implosie en daarna naar buiten gericht gedurende de terugkaatsing na de implosie, bewegen de vloeistof met zich mee in een longitudinale golfbeweging. Deze golf, of beter, schokgolf, kan lokaal zeer grote snelheden bereiken en veroorzaken op zichzelf ook weer, al dan wel kleinere, druk- en temperatuurverschillen. Daarnaast zorgen de schokgolven ook voor botsing van objecten in de vloeistof en zeer grote schuifspanningen. Deze schuifspanning is een spanning die materialen vervormen parallel aan de richting van de kracht. Deze schuifspanning is zeer schadelijk voor vaste structuren in de vloeistof en vooral microscopische structuren, zoals DNA. 21 Wanneer dubbelstrengig DNA wordt blootgesteld aan de energie van AFA, zal dubbelstrengig DNA worden gefragmenteerd. Deze shearing gebeurt ad random. Het volledige proces gebeurt computergestuurd. Eens het proces geoptimaliseerd is voor een bepaalde size range, is het proces gemakkelijk te herhalen. Daarenboven is het met AFA mogelijk om een groot aantal samples te fragmenteren op korte tijd. Samengevat heeft Covaris volgende karakteristieken: - ad random fragmentatie - GC/AT ratio onafhankelijke fragmentatie - isotherm proces - non-contact, in een gesloten vat geen risico op cross-contaminatie - zeer weinig startmateriaal vereist (1 ng genomisch DNA vereist voor Illumina) - compatibel met en gevalideerd voor alle next-generation sequencing platforms (Roche/454, Illumina, ) - nauwe size-distributie en sterk reproduceerbaar - automatiseerbaar voor groot aantal samples (vb. 24 of 96 sample formaat) - snel en gemakkelijk te gebruiken 21 Covaris onderscheidt zich van sonicatie op een aantal vlakken. Een belangrijk verschil tussen covaris en sonicatie is de golflengte van het ultrasonegeluid. Bij covaris heeft men een golflengte van 1 mm, bij sonicatie gebruikt men een golflengte van tientallen centimeters (zie Figuur 3.10.). Met dergelijke golflengtes is het onmogelijk de energie precies te focussen in het sample. Het resultaat hiervan is dat de energie zich ongefocusseerd verspreid, gereflecteerd wordt en dat er zich hot spots kunnen vormen, welke mogelijks het sample beschadigen. De golflengtes die bij AFA gebruikt worden zijn daarentegen wel in staat om precies gefocusseerd te worden in een gelokaliseerd deel van het sample. 21 FIGUUR 3.10.: VERSCHIL IN GOLFLENGTE TUSSEN SONICATIE EN COVARIS 21 Covaris is in tegenstelling met sonicatie een isotherm proces. Bij sonicatie warmt het sample een aantal graden op. Een ander voordeel van covaris is dat gecontroleerde convergentie van

44 mechanische energie mogelijk is. Door de kortere golflengte is het mogelijk dat de energie de sample tube doorkruist. Op die manier wordt een piek van energiedensiteit bereikt in de sample tube. In Figuur staat afbeelding van het Covaris S2 toestel weergegeven. 21 FIGUUR 3.11.: COVARIS S2 TOESTEL Procedure 1. Breng 120 l van het DNA-staal (in TE-buffer) over in een Covaris microbuisje met septum (zie Figuur 3.12.) FIGUUR 3.12.: COVARIS MICROBUISJES MET SEPTUM 21 - Prik met de pipettip doorheen het pre-split septum. Het pre-split septum sluit vanzelf na het verwijderen van de pipet. - Breng de pipettip tot aan het midden van het buisje en plaats de pipettip tegen de binnenwand. - Pipetteer langzaam het DNA-staal in het Covaris microbuisje. - Zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn aan de bodem van het buisje. 2. Bevestig het Covaris microbuisje op de houder. 3. Laad de houder in het Covaris instrument. 4. Stel de condities in om het DNA-staal te fragmenteren en klik op Run. 5. Haal, na afloop van de run, de houder uit het toestel. Check of er geen luchtbel aanwezig is op de bodem van het buisje. 6. Verwijder het Covaris microbuisje van de houder. 22

45 4. RESULTATEN Het is de bedoeling om het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA te fragmenteren in fragmenten van 300 bp, geschikt voor paired-end sequencing (2x100 bp) met de Illumina Genome Analyzer IIx. Hiervoor worden er twee shearing methodes getest, nl. het enzyme NEBNext TM dsdna Fragmentase en Covaris FRAGMENTATIE MET DS DNA FRAGMENTASE Fragmentatie van genomisch DNA van Roche en kwaliteitscontrole met agarosegelelektroforese Vooraleer enerzijds de geligeerde, opgezuiverde stalen en anderzijds de originele amplicons te fragmenteren met het dsdna Fragmentase wordt eerst met genomisch DNA (gdna) getest of het dsdna Fragmentase wel degelijk werkt en wat de invloed is van de incubatietijd op de bekomen fragmentlengte. Met agarosegelektroforese worden de DNA-fragmenten na fragmentatie zichtbaar gemaakt en gescheiden volgens grootte. Na elektroforese worden de bekomen patronen van bandjes voor de verschillende incubatietijden met dsdna Fragmentase aan de hand van de DNA-ladder met elkaar vergeleken Fragmentatie Concreet wordt hiervoor een 40 l dsdna Fragmentase reactie opgezet met 2 g genomisch DNA van Roche. De reactie wordt gestopt na 10, 20, 30, 60, 90, 180, 240, 300 en 600 minuten door telkens een 4 l uit het totaal reactievolume te pipetteren en daaraan 2 l 0,5 M EDTA toe te voegen. De reactiecondities staan weergegeven in Tabel 4.1. TABEL 4.1.: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASE REACTIE VAN GENOMISCH DNA Reactiecomponent gdna (200 ng/ l) 10x Fragmentase Reactiebuffer 100x BSA dsdna Fragmentase Steriel H 2 O Totaal Volume Test 10 l 4 l 0,4 l 4 l 21,6 l 40 l Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met agarosegelelektroforese De DNA-fragmenten worden zichtbaar gemaakt en gescheiden volgens grootte door middel van agarosegelelektroforese. In Figuur 4.1. staat de foto weergegeven van de agarosegel na elektroforese.

46 FIGUUR 4.1.: FOTO VAN DE AGAROSEGEL NA ELEKTROFORESE Aan de linkerkant van de gel is een 1 kb DNA-ladder te zien waarbij voor een aantal bandjes de lengte in basenparen is weergegeven. In laan 2 bevindt zich een negatieve controle. De negatieve controle levert na gelelektroforese een zeer heldere band op. Het genomisch DNA is hoog moleculair gewicht DNA en bestaat voornamelijk uit DNA-fragmenten met een lengte > 12 kb. Laan 3 tot en met laan 12 bevatten gdna dat bekomen is door inwerking van het dsdna Fragmentase gedurende respectievelijk 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240, 300 en 600 minuten. Uit de bekomen patronen is duidelijk te zien dat naarmate de incubatietijd toeneemt, de fragmentlengte alsmaar afneemt. Na een incubatietijd van 10 minuten is het gdna gefragmenteerd tot DNAfragmenten met een lengte van 500 bp tot 10 kb. Bij langere incubatietijden verschuift de piek van DNA-fragmenten naar kortere fragmentlengtes. Na een incubatietijd van 20 minuten worden fragmenten gevormd met een lengte van 1 kb tot 300 bp. Na een incubatietijd van 30 minuten bekomt men fragmenten met een lengte van 500 bp tot 300 bp en nog kleinere fragmentlengte. Wat ook opvalt op de foto is dat de intensiteit van het bandenpatroon alsmaar afneemt bij langere incubatietijd. Dit wijst erop dat er bij de fragmentatiereactie heel wat DNA verloren gaat of afgebroken wordt tot kleine DNA-fragmenten met een lengte < 75 bp. Na 2 uur incubatie is er helemaal niets meer te zien op gel. Het gdna is m.a.w. volledig afgebroken door het enzyme.

47 Fragmentatie van genomisch DNA van Roche en size selectie met de Double SPRI methode De bedoeling van dit experiment is om de incubatietijd van de fragmentatiereactie te bepalen waarbij de grootste fractie van fragmenten van 300 bp bereikt wordt. Vervolgens worden de fragmenten met een fragmentlengte van 300 bp opgezuiverd met de Double SPRI methode. Uit het vorige experiment en uit het protocol van het dsdna Fragmentase blijkt dat men de fragmentatiereactie 20 tot 30 minuten moet laten doorgaan om fragmenten te bekomen met een fragmentlengte van 300 bp. Uit het vorige experiment blijkt ook dat het gelbandje met de hoogste intensiteit (500 bp) verschuift naar kortere fragmentlengtes naarmate men langer incubeert. Daarom wordt in dit experiment nog een derde incubatietijd getest, nl. 40 minuten. Dit experiment, bedoeld om de incubatietijd te optimaliseren (grootste opbrengst fragmenten van 300 bp), is in feite een herhaling van het vorige experiment op gel met dit verschil dat de analyse gebeurt op de Agilent Bioanalyzer 2100 met een High Sensitivity DNA Labchip Fragmentatie Concreet worden drie 20 l fragmentatiereacties opgezet met als incubatietijd 20, 30 en 40 minuten. De starthoeveelheid gdna is 1 g. Er wordt gebruik gemaakt van een stockoplossing gdna van Roche met als concentratie 200 ng/ l. Dit betekent dat er 5 l gdna en 10,8 l steriel water nodig zijn in elke fragmentatiereactie (zie Tabel 4.2.). TABEL 4.2..: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASE REACTIE VAN GENOMISCH DNA Reactiecomponent gdna (200 ng/ l) 10x Fragmentase Reactiebuffer 100x BSA dsdna Fragmentase Steriel H 2 O Totaal Volume Test 5 l 2 l 0,2 l 2 l 10,8 l 20 l Size selectie Voor de size selectie wordt de Double SPRI methode gebruikt. De opzuivering van de fragmenten van 300 bp gebeurt in 2 stappen. Eerst worden de zeer korte fragmenten (< 300 bp) verwijderd. Vervolgens worden de zeer lange fragmenten (> 300 bp) verwijderd. De bead/dna ratio s die hiervoor gebruikt worden, worden afgeleid uit de kalibratie van de AMPure beads (zie Bijlage 1). Om DNA-fragmenten korter dan 300 bp te verwijderen wordt een bead/dna ratio van 0,70 (vol:vol) gebruikt. Bij deze ratio binden theoretisch alle DNA-fragmenten die 300 bp aan de beads. Na elutie met 24 l EB-buffer, wordt het volume met EB-buffer aangelengd tot 30 l. Vervolgens wordt van elk staal 1 l geladen op een High Sensitivity DNA Labchip.

48 In een volgende stap wordt het eluaat opgezuiverd om DNA-fragmenten te isoleren met een lengte van 300 bp. Hiervoor wordt een bead/dna ratio gebruikt van 0,55. Bij deze ratio binden lange DNA-fragmenten (> 300 bp) aan de beads. Fragmenten met een lengte van 300 bp binden niet en bevinden zich in de EB-buffer (volume ± 150 l). Aanconcentratie gebeurt met een opzuiveringskolom van de QIAquick PCR Purification Kit (elutievolume 30 l). Om de lengte van opgezuiverde DNAfragmenten te controleren, wordt een bioanalyzer run uitgevoerd met een High Sensitivity DNA Labchip Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 In Figuren 4.2., 4.3. en 4.4. staan de elektroferogrammen weergegeven na respectievelijk 20, 30 en 40 minuten fragmentatie, dit voor en na de twee opzuiveringen met de Double SPRI methode. FIGUUR 4.2.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE 20 MIN FRAGMENTASEREACTIE: VOOR OPZUIVERING, NA DE EERSTE OPZUIVERING EN NA DE TWEEDE OPZUIVERING FIGUUR 4.3.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE 30 MIN FRAGMENTASEREACTIE: VOOR OPZUIVERING, NA DE EERSTE OPZUIVERING EN NA DE TWEEDE OPZUIVERING

49 FIGUUR 4.4.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE 40 MIN FRAGMENTASEREACTIE: VOOR OPZUIVERING, NA DE EERSTE OPZUIVERING EN NA DE TWEEDE OPZUIVERING Bij de 20 minuten fragmentatiereactie is er met de run vóór opzuivering iets fout gelopen is. De oppervlakte onder de curve (AUC) vóór opzuivering is veel lager dan deze na beide opzuiveringen, wat theoretisch onmogelijk is. Bij de 30 en 40 minuten fragmentatiereacties lijkt de evolutie van de AUC s wel te kloppen. Na 30 minuten fragmentatie ligt de piek van fragmenten bij bp. Na 40 minuten fragmentatie zien we de piek verschuiven naar kortere fragmentlengtes, nl. bij bp. Kwantitatief heeft men de grootste opbrengst van 300 bp fragmenten na 30 min fragmentatie. De efficiëntie van de opzuiveringen met de Double SPRI methode wordt geëvalueerd aan de hand van elektroferogrammen na 30 minuten fragmentatie. De eerste opzuivering met als doel de korte fragmenten kwijtspelen (< 300 bp), is tamelijk goed gelukt. Niettegenstaande dat er een klein deel van de gewenste fragmenten van 300 bp verloren gaat, zien we een veel sterker verlies van de fragmenten < 300 bp. De tweede opzuivering daarentegen lijkt minder geslaagd. Bij deze opzuivering gaan er veel fragmenten van 300 bp verloren en houden we nog veel lange DNA-fragmenten over Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met Picogreen Met een picogreenmeting wordt de concentratie van elk staal bepaald. In Bijlage 2 staan de resultaten van de fluorescentiemeting weergegeven voor de standaarden (in tweevoud) en de stalen. De gemiddelde Rfu-waarden worden voor elk van de standaarden berekend en gebruikt om de ijklijn op te stellen. Door extrapolatie van de ijklijn wordt de DNA-concentratie van de stalen berekend. De resultaten staan weergegeven in Tabel 4.3.

50 TABEL 4.3.: CONCENTRATIE (ng/ l) VAN DE STALEN Stalen Concentratie (ng/ l) 20 min voor opzuivering 19,86 30 min voor opzuivering 12,63 40 min voor opzuivering 7,94 20 min opzuivering 1 13,46 30 min opzuivering 1 5,79 40 min opzuivering 1 2,79 20 min opzuivering 2 8,77 30 min opzuivering 2 3,34 40 min opzuivering 2 1,46 Uit Tabel 4.3. blijkt dat er een enorm verlies van DNA optreedt bij de fragmentatiereactie. Dit verlies aan DNA wordt alsmaar groter naarmate men de fragmentatiereactie langer laat doorgaan. Vertrekkende van een theoretische concentratie van 33,33 ng/ l (1000 ng/ 30 l) houden we na 20 min incubatie nog 59,58 % over, na 30 min 37,89 % en na 40 min slechts 23,82 %. Bovendien verliezen we nog heel wat DNA bij de 2 daaropvolgende opzuiveringen met de Double SPRI methode. In het geval van 40 min incubatie bijvoorbeeld, houden we, vertrekkende van 1000 ng, slechts 43,8 ng (1,46 ng/ l x 30 l) over Fragmentatie van geligeerde amplicons In dit experiment worden de geligeerde amplicons van het staal hl ir gefragmenteerd met het dsdna Fragmentase Fragmentatie Door het uitvoeren van een aantal kwaliteitscontroles na size selectie met de Double SPRI methode (elutievolume 24 l), houden we van staal hl ir nog 17 l over. De concentratie van dit staal, gemeten met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer, bedraagt 9,6 ng/ l. Het volledige staal wordt aangeboden in de fragmentatiereactie. De volumes van de andere reagentia worden aangepast zodat ze in dezelfde eindconcentratie aanwezig zijn als deze die in het protocol vermeld staan (zie Tabel 4.4.). De volumes van de reagentia worden berekend door het oplossen van een vergelijking (zie Bijlage 3). De finale DNA-concentratie in het reactiemengsel bedraagt 7,59 ng/ l ((9,6 ng/ l x 17 l) / 21,515 l)).

51 TABEL 4.4.: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASE REACTIE VAN HET STAAL HL IR Reactiecomponent Protocol Test PCR of RT-PCR product 1 g 17 l 10x Fragmentase Reactiebuffer 2 l 2,15 l 100x BSA 0,2 l 0,215 l dsdna Fragmentase 2 l 2,15 l Steriel H 2 O variabel - Totaal Volume 20 l 21,515 l Na 20 minuten incubatie bij 37 C wordt de helft van de reactie gestopt door toevoegen van 2,5 l 0,5 M EDTA. In de andere helft van het reactiemengsel laat men de fragmentatiereactie 10 minuten langer doorgaan (in totaal 30 minuten). Vervolgens worden beide DNA-stalen (20 en 30 minuten fragmentatie) opgezuiverd met een MinElute kolom (elutievolume 10 l) Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Van elk gefragmenteerd staal wordt 1 l geladen op een High Sensitivity DNA Labchip. De resultaten van de run staan weergegeven in Figuur 4.5. VOOR FRAGMENTATIE NA FRAGMENTATIE FIGUUR 4.5.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN STAAL HL IR VOOR EN NA FRAGMENTATIE MET DS DNA FRAGMENTASE

52 Uit de elektroferogrammen blijkt dat de geligeerde amplicons nagenoeg niet gefragmenteerd zijn. De piek bij 100 seconden vóór fragmentatie is nagenoeg niet verschoven na 20 en 30 minuten fragmentatie. De piek is enkel afgenomen in Rfu-waarde, wat er opnieuw op wijst dat er een groot deel van het DNA verloren gaat bij de fragmentatie Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met Picogreen De concentratie van de gefragmenteerde DNA-stalen wordt gemeten met een Picogreenmeting. Theoretisch zou de DNA-concentratie van elk staal 8,16 ng/ l moeten bedragen {((9,6 ng/ l x 17 l) / 2) / 10 l}. In Bijlage 4 staan de resultaten van de fluorescentiemeting weergegeven voor de standaarden (in tweevoud) en de stalen. De gemiddelde Rfu-waarden worden voor elk van de standaarden berekend en gebruikt om de ijklijn op te stellen. Door extrapolatie van de ijklijn wordt de DNAconcentratie van de stalen berekend (zie Tabel 4.5.). TABEL 4.5.: CONCENTRATIE (ng/ l) VAN DE STALEN NA FRAGMENTATIE Stalen Concentratie (ng/ l) hl ir : 20 min fragmentatie 4,85 hl ir : 30 min fragmentatie 2,13 Uit deze resultaten kan men besluiten dat de fragmentatiereactie met het dsdna Fragmentase gepaard gaat met een enorm verlies aan DNA. Na 20 minuten blijft 59,44 % over, na 30 minuten incubatie slechts 26,10 % Fragmentatie van verschillende concentraties genomisch DNA Aangezien de fragmentatie van geligeerde amplicons met het dsdna Fragmentase mislukt is en de DNA-concentratie (7,59 ng/ l) hierbij veel lager is dan deze in het protocol van het enzyme (50 ng/ l), wordt de fragmentatiereactie getest met drie verschillende concentraties gdna. Deze zijn: - 5 ng/ l: dit is een 10 x lagere concentratie dan deze in het protocol ng/ l: dit is een 2 x lagere concentratie dan deze in het protocol ng/ l: dit is de concentratie die het protocol vooropstelt. Voor elke DNA-concentratie worden drie fragmentatiereacties uitgevoerd. De incubatietijden zijn 10, 30 en 60 minuten Fragmentatie In totaal worden, inclusief de 3 negatieve controles, 12 reacties opgezet. Om reagentia te besparen worden 5 l reacties opgezet. Om de fouten bij het pipetteren van kleine hoeveelheden te reduceren, wordt een mastermix (foutenmarge 15 %) bereid (zie Tabel 4.6.). Elk reactiemengsel bevat 0,55 l mastermix.

53 TABEL 4.6.: MASTERMIX Mastermix Volume ( l) 1 reactie Volume ( l) 12 reacties 10x Fragmentase Reactiebuffer 0,5 6,9 100x BSA 0,05 0,69 Achteraf moet aan elke reactie gdna, dsdna Fragmentase (behalve bij de negatieve controles) en steriel water toegevoegd worden. Als gdna wordt gebruik gemaakt van Roche gdna met een concentratie van 200 ng/ l. De specifieke reactiecondities voor elk staal staan weergegeven in Tabel 4.7. De volumes aangeduid met een sterretje (*) worden gepipetteerd uit een 1/10 verdunning van het gdna. De 1/10 verdunning wordt bereid door 2 l van de stockoplossing aan te lengen met 18 l steriel water. De reacties worden gestopt door toevoegen van 2,5 l 0,5 M EDTA. Vervolgens wordt elk staal opgezuiverd met een MinElute kolom (elutievolume 10 l). TABEL 4.7.: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASE REACTIE VAN VERSCHILLENDE CONCENTRATIES GENOMISCH DNA Staal Mastermix ( l) gdna ( l) dsdna Fragmentase ( l) Steriel H 2 O ( l) 25 ng/5 l - 10 min 0,55 1,25* 0,5 2,7 25 ng/5 l - 30 min 0,55 1,25* 0,5 2,7 25 ng/5 l - 60 min 0,55 1,25* 0,5 2,7 125 ng/5 l - 10 min 0,55 0,625 0,5 3, ng/5 l - 30 min 0,55 0,625 0,5 3, ng/5 l - 60 min 0,55 0,625 0,5 3, ng/5 l - 10 min 0,55 1,25 0,5 2,7 250 ng/5 l - 30 min 0,55 1,25 0,5 2,7 250 ng/5 l - 60 min 0,55 1,25 0,5 2,7 25 ng/5 l neg. controle 0,55 1,25* 0 3,2 125 ng/5 l neg. controle 0,55 0, , ng/5 l neg. controle 0,55 1,25 0 3, Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Van elke staal wordt 1 l geladen op een High Sensitivity DNA Labchip. Figuren 4.6., 4.7. en 4.8. tonen de resultaten van de run.

54 FIGUUR 4.6.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE DS DNA FRAGMENTASEREACTIE VAN HET STAAL GENOMISCH DNA MET EEN CONCENTRATIE VAN 25 ng/5 l FIGUUR 4.7.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE DS DNA FRAGMENTASEREACTIE VAN HET STAAL GENOMISCH DNA MET EEN CONCENTRATIE VAN 125 ng/5 l

55 FIGUUR 4.8.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE DS DNA FRAGMENTASEREACTIE VAN HET STAAL GENOMISCH DNA MET EEN CONCENTRATIE VAN 250 ng/5 l Bij de laagste DNA-concentratie (25 ng/5 l) zien we dat, ongeacht de incubatietijd, er nagenoeg geen verschuiving optreedt van de piek. Net zoals in het vorig fragmentatie-experiment met geligeerde amplicons merken we enkel een toenemend DNA-verlies naarmate de fragmentatiereactie langer doorgaat. Bij een 5-voudig hogere concentratie daarentegen zien we wel een verschuiving van de piek naar kortere fragmentlengtes bij langere incubatietijden. De fragmentatiereactie lijkt het best te zijn doorgegaan bij een concentratie van 250 ng/5 l, de aanbevolen concentratie in het protocol. Bovendien zijn de bekomen fragmentlengtes na een bepaalde incubatietijd verschillend tussen concentratie 125 ng/5 l en 250 ng/5 l. Na 10 minuten is de fragmentlengte korter bij 250 ng/5 l dan bij 125 ng/5 l. Dit is ook het geval na 30 en 60 minuten. Het lijkt erop dat de fragmentatiereactie met een lagere DNA-concentratie langer moet doorgaan om een bepaalde fragmentlengte te bekomen Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met Picogreen Door opzuivering met de MinElute kolom (elutievolume 10 l) wordt de concentratie van elk staal (5 l reactie) gehalveerd. Aangezien er in de negatieve controles geen fragmentatie is opgetreden, kan de concentratie ervan na opzuivering eenvoudig berekend worden: - 25 ng/5 l - negatieve controle: 25 ng/10 l of 2,5 ng/ l na opzuivering ng/5 l - negatieve controle: 125 ng/10 l of 12,5 ng/ l na opzuivering ng/5 l - negatieve controle: 250 ng/10 l of 25 ng/ l na opzuivering De concentratie van de gefragmenteerde stalen wordt bepaald met een picogreenmeting. In Bijlage 5 staan de resultaten van de fluorescentiemeting weergegeven voor de standaarden (in tweevoud) en de stalen. De gemiddelde Rfu-waarden worden voor elk van de standaarden berekend

56 en gebruikt om de ijklijn op te stellen. Door extrapolatie van de ijklijn wordt de DNA-concentratie van de stalen berekend (zie Tabel 4.8.). TABEL 4.8.: CONCENTRATIE (ng/ l) VAN DE STALEN Stalen Concentratie (ng/ l) 25 ng/5 l - 10 min 0,52 25 ng/5 l - 30 min 0,55 25 ng/5 l - 60 min 0, ng/5 l - 10 min 5, ng/5 l - 30 min 1, ng/5 l - 60 min 0, ng/5 l - 10 min 6, ng/5 l - 30 min 1, ng/5 l - 60 min 0,25 Uit de evolutie van de concentraties valt opnieuw het enorm DNA-verlies op bij de fragmentatiereactie. Na 60 minuten incubatie is bij elke concentratierange nagenoeg al het DNA verdwenen Fragmentatie van geligeerde amplicons in een hogere concentratie Uit het vorige experiment blijkt dat de DNA-concentratie in de fragmentatiereactie cruciaal is voor het slagen ervan. De te lage DNA-concentratie bij de fragmentatie van geligeerde amplicons ligt waarschijnlijk aan de basis van de mislukking van de fragmentatie. Om die reden wordt de fragmentatie van geligeerde amplicons herhaald maar ditmaal met een hogere DNA-concentratie Ligatie en opzuivering met de Double SPRI methode In plaats van de fragmentatiereactie uit te voeren met DNA afkomstig van 1 ligatiereactie (staal hl ir ) wordt de fragmentatie nu uitgevoerd met DNA afkomstig van 5 ligatiereacties. Theoretisch zou dit een 5 keer hogere DNA-concentratie moeten opleveren, als de opzuivering van het hoog moleculair gewicht geligeerd DNA met de Double SPRI methode tenminste in één keer gebeurt. Om na te gaan of de bindingscapaciteit van de AMPure beads hierbij niet overschreden wordt, wordt de opzuivering met de Double SPRI methode in tweevoud uitgevoerd. De opzuivering van 5 ligaties in één keer wordt vergeleken met de opzuivering van elk van de 5 ligaties afzonderlijk (5 opzuiveringen in parallel). Hiervoor maken we gebruik van de ge-end repairde en geligeerde stalen en 481. Voor zowel staal en 481 werd reeds 5 g blunt end gemaakt in een reactievolume van 50 l. Maximaal kunnen er dus 5 ligaties met een relatieve inputconcentratie van 10 uitgevoerd worden. Voor staal worden de 5 ligaties samengevoegd en in één keer opgezuiverd met de gebruikelijke bead/dna ratio van 0,5 (vol:vol) (elutievolume 24 l). De 5 ligaties van staal 481 worden elk afzonderlijk opgezuiverd met een bead/dna ratio van 0,5 (vol:vol) en nadien samen gepipetteerd in één epje (totaal elutievolume 5 x 24 l).

57 Kwaliteitscontrole van de ligatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Na ligatie wordt 1 l van elk staal geladen op een High Sensitivity DNA Labchip. De resultaten van de run staan weergegeven in Figuur 4.9. Zoals we reeds concludeerden uit vorige experimenten is de ligatiereactie sterk reproduceerbaar. FIGUUR 4.9.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN STAAL 481 EN STAAL NA LIGATIE Kwaliteitscontrole van de opzuivering met de Agilent Bioanalyzer 2100 Na opzuivering wordt 1 l van elk eluaat (24 l bij staal en 5 x 24 l bij staal 481) geladen op een High Sensitivity DNA Labchip. De resultaten van de run staan weergegeven in Figuur FIGUUR 4.10.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN STAAL 481 EN STAAL NA OPZUIVERING MET DE DOUBLE SPRI METHODE Uit Figuur blijkt dat er iets misgelopen is met de run van staal Het lijkt er wel op dat de opzuivering van de 5 ligaties in één stap minder efficiënt is in vergelijking met de opzuivering van elke ligatiereactie afzonderlijk aangezien er nog een resterende piek van originele amplicons aanwezig is bij staal Kwaliteitscontrole van de opzuivering met Picogreen De concentratie van de stalen voor en na opzuivering wordt bepaald met een picogreenmeting. In Bijlage 6 staan de resultaten van de fluorescentiemeting weergegeven voor de standaarden (in tweevoud) en de stalen. De gemiddelde Rfu-waarden worden voor elk van de standaarden berekend en gebruikt om de ijklijn op te stellen (zie Bijlage 6). Door extrapolatie van de ijklijn wordt de DNA-concentratie van de stalen berekend (zie Tabel 4.9.).

58 TABEL 4.9.: CONCENTRATIE (ng/ l) VAN DE STALEN Stalen Concentratie (ng/ l) 481 voor opzuivering (5 x 15 l) 26, opgezuiverd met beads (5 x 24 l) 4, voor opzuivering (5 x 15 l) 27, opgezuiverd met beads (1 x 24 l) 27,69 De concentratie van het staal dat in één keer werd opgezuiverd (27,69 ng/ l) is ongeveer 5 keer hoger dan de concentratie van het staal 481 (4,53 ng/ l) waarbij vijf opzuiveringen in parallel werden uitgevoerd. Rekening houdend met de resultaten van de Bioanalyzer run (zie Figuur 4.38.) betekent dit dat er relatief minder hoog moleculair gewicht geligeerd DNA aanwezig is in het opgezuiverde staal dan in het opgezuiverde staal 481. Alhoewel dit resultaat nog moet gevalideerd worden met meerdere testen, lijkt het erop dat de te verkiezen methode voor de opzuivering van hoog moleculair geligeerd DNA met de Double SPRI methode, een opzuivering van elk ligatiereactie afzonderlijk is. Om staal 481 (5 x 24 l) te fragmenteren, moet dit staal eerst aangeconcentreerd worden. Aangezien er geen kolomzuivering bestaat om hoog moleculair geligeerd DNA (2 20 kb) aan te concentreren door elutie met een klein elutievolume (bovendien gaat dit steeds gepaard met een beperkt verlies) en aangezien indampen geen optie is met het oog op contaminatierisico, wordt de fragmentatie uitgevoerd op staal Fragmentatie Concreet wordt een 26 l reactie opgezet met 20 l van het geligeerd en opgezuiverd staal als inputvolume. De concentratie van dit staal, gemeten met picogreen, bedraagt 27,69 ng/ l. De reactiecondities staan weergegeven in Tabel TABEL 4.10.: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASEREACTIE VAN HET GELIGEERD STAAL Reactiecomponent PCR of RT-PCR product 10x Fragmentase Reactiebuffer 100x BSA dsdna Fragmentase Steriel H 2 O Totaal Volume Test 20 l 2,6 l 0,26 l 2,6 l 0,54 l 26 l De DNA-concentratie in het reactiemengsel voor fragmentatie bedraagt 21,3 ng/ l ((27,69 ng/ l x 20 l) / 26 l)). Dit is nog steeds een veel lagere concentratie dan deze in het protocol (50 ng/ l), maar zoals het experiment met gdna aantoont, werkt de fragmentatie ook met een concentratie van dergelijke grootte-orde. Omdat met dergelijke concentratie de fragmentatietijd om 300 bp fragmenten te bekomen onduidelijk is, worden verschillende tijdspunten getest. Na 20, 25, 30 en 35

59 minuten wordt 5 l uit de reactie gepipetteerd en wordt de reactie gestopt door toevoegen van 2,5 l 0,5 M EDTA. Als positieve controle wordt gdna van Roche gefragmenteerd onder dezelfde reactiecondities (zie Tabel 4.11.). Om een concentratie van 21,3 ng/ l te bekomen, is 2,769 l van de gdna-stockoplossing (200 ng/ l) nodig. TABEL 4.11.: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASEREACTIE VAN DE POSITIEVE CONTROLE MET GENOMISCH DNA Reactiecomponent gdna (200 ng/ l) 10x Fragmentase Reactiebuffer 100x BSA dsdna Fragmentase Steriel H 2 O Totaal Volume Test 2,769 l 2,6 l 0,26 l 2,6 l 17,771 l 26 l Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Na fragmentatie wordt 1 l van elk tijdspunt geladen op een High Sensitivity DNA Labchip. De elektroferogrammen staan weergegeven in Figuur Aangezien tijdens de run de upper en lower marker niet gedetecteerd worden, gebeurt de interpretatie aan de hand van de ladder (zie Figuur 4.12.). FIGUUR 4.11.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN STAAL NA FRAGMENTATIE MET DS DNA FRAGMENTASE

60 Piek Size (bp) FIGUUR 4.12.: LADDER Aan de hand van de ladder kunnen we afleiden dat na 20 minuten de piek zich bevindt bij 7000 bp, na 25 minuten bij bp en na 30 en 35 minuten bij 200 bp. Langer dan 30 minuten incuberen betekent enkel meer DNA-verlies en levert geen kortere fragmentlengtes op. De ideale incubatietijd met dergelijke DNA-concentratie lijkt dus 25 minuten Fragmentatie van PCR-amplicons In dit experiment is het de bedoeling om na te gaan of het mogelijk is om amplicons rechtstreeks te fragmenteren met het dsdna Fragmentase. Aangezien we over voldoende DNA beschikken, is het wel mogelijk om de concentratie van het protocol nl. 50 ng/ l toe te passen Opzuivering en Nanodropmeting Concreet wordt 400 l van het gepoolde staal sh5 S1 opgezuiverd met de QIAquick PCR Purification kit (elutievolume 4 x 30 l). De concentratie wordt gemeten met de Nanodrop 1000 Spectrofotometer. De resultaten van de meting staan weergegeven in Tabel In Bijlage 7 staan de absorptiespectra van deze meting afgebeeld. TABEL 4.12.: CONCENTRATIE VAN DE POOL SH5 S1 NA OPZUIVERING Sample ID Concentratie (ng/ l) blanco 0,22 sh5 S1 pool 75,44 blanco 0,46

61 Fragmentatie Er wordt een 20 l dsdna Fragmentase reactie opgezet met 1 g DNA als inputhoeveelheid. De enzymatische reactie wordt gestopt na 15, 20, 25, 30, 35 en 40 minuten door telkens 3 l uit het totale reactievolume te pipetteren en daaraan 1 l 0,5 M EDTA toe te voegen. TABEL 4.13.: REACTIECONDITIES VAN DE DS DNA FRAGMENTASEREACTIE VAN DE AMPLICONS VAN POOL SH5 S1 Reactiecomponent Sh5 S1 pool (75,44 ng/ l) 10x Fragmentase Reactiebuffer 100x BSA dsdna Fragmentase Steriel H 2 O Totaal Volume Test 13,26 l 2 l 0,2 l 2, l 2,54 l 20 l Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Het lengteprofiel van het DNA wordt geanalyseerd d.m.v. een bioanalyzer run met een High Sensitivity DNA chip (zie Figuur 4.13.). FIGUUR 4.13.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN STAAL SH5 S1 VOOR EN NA FRAGMENTATIE MET DS DNA FRAGMENTASE Het elektroferogram vertoont een reproduceerbaar patroon na 15, 20, 25, 30, 35 en 40 minuten inwerking van het enzym. Het lijkt er m.a.w. op dat het enzyme, naast DNA in grote hoeveelheid afbreken, niets doet. Op basis van deze resultaten kan voorzichtig geconcludeerd worden dat het enzyme er niet in slaagt om PCR-producten te fragmenteren.

62 4.2. FRAGMENTATIE MET COVARIS Op woensdag 2 december 2009 kwam Niels Kruize van de firma KBioscience naar het MRB om het Covaris S2 toestel te demonstreren. Tijdens deze demonstratie werden PCR-amplicons, een geligeerd-amplicon-staal en controle genomisch DNA van Roche gefragmenteerd. Deze stalen werden voor verschillende tijdsduren en aan verschillende intensiteiten van fragmentatie blootgesteld om daarna het lengteprofiel van het DNA te vergelijken Fragmentatie van controle genomisch DNA van Roche Bereiding van de stalen met genomisch DNA In eerste instantie worden er twee stalen met gdna bereid met een concentratie van 650 ng/120 l. Deze concentratie bevindt zich in de concentratierange, vooropgesteld in het protocol voor DNA-shearing met Covaris (100 ng - 3 g DNA in 120 l). 1. Aliquoteer in het pre-pcr-laboratorium 8 l gdna van Roche (200 ng/ l) in een epje. De volgende stappen worden uitgevoerd in het post-pcr-laboratorium. 2. Pipetteer in twee epjes 116,75 l TE-buffer. 3. Voeg aan elk epje met TE-buffer 3,25 l gdna van het aliquot met gdna van Roche toe. 4. Vortex en centrifugeer Fragmentatie In Tabel staat een samenvatting weergegeven van de geteste fragmentatie-condities op twee stalen met genomisch DNA van Roche. Op één staal worden de fragmentatie-condities 1 tot en met 3 getest, op het andere staal condities 4 en 5. Elk van de stalen wordt gesampeled in functie van de tijd. Op verschillende tijdspunten wordt er een aantal l uit het covaris epje gepipetteerd. De shearing wordt telkens verdergezet op het het resterend volume in het covaris epje. TABEL 4.14.: GETESTE FRAGMENTATIE-CONDITIES OP GENOMISCH DNA VAN ROCHE Fragmentatie-condities Target Base Pair (peak) Duty cycle 5% 5% 5% 10% 10% Intensity Cycles per Burst Time (seconds) Temperature 6,1 C Power mode Frequency sweeping Degassing mode Continuous Volume 120 l Buffer TE-buffer, ph 8 Mass (DNA) 650 ng Water level (RUN) S2 - max height

63 Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Het lengteprofiel van het DNA wordt geanalyseerd d.m.v. een bioanalyzer run met een High Sensitivity DNA chip. Hieronder staan de verschillende elektroferogrammen weergegeven van een aantal geteste fragmentatie-condities op gdna. In het elektroferogram hebben de verschillende geteste fragmentatie-condities een andere kleur. De rode curve is niet-gefragmenteerd gdna. De blauwe, groene, lichtblauwe en roze curve stellen respectievelijk het DNA voor getarget op 600 bp, 300 bp, 200 bp en 150 bp. De testresultaten van de fragmentatie met covaris zijn zeer goed. In de figuur is er, zoals vooropgesteld volgens de fragmentatie-condities, bij 600 bp, 300 bp, 200 bp en 150 bp een duidelijke piek waar te nemen. De test toont aan dat het Covaris S2 toestel in staat is om gdna te fragmenteren in fragmenten met de gewenste lengte. FIGUUR 4.14.:ELEKTROFEROGRAMMEN VAN EEN AANTAL GETESTE FRAGMENTATIE- CONDITIES OP GENOMISCH DNA Fragmentatie van een geligeerd-amplicon-staal Bereiding van het geligeerd-amplicon-staal 1. Opzuivering van 400 l van de pool met qpcr-amplicons van het staal sh5 S1. Hiervoor worden er 4 QIAquick PCR Purification kolommen gebruikt waarmee telkens 100 l pool wordt opgezuiverd. 2. Aanconcentratie van de pool met een vacuümcentrifuge RC Concentratiemeting van de pool met Nanodrop: 222,3 ng/ l, OD 260/280 = 1, End-repair reactie: In een 50 l-end-repair reactie wordt 5 g pool (22,49 l) blunt end gemaakt. 5. Ligatie van de amplicons: Hiervoor worden er vijf 15 l-ligatiereacties (SH5-1, SH5-2, SH5-3, SH5-4 en SH5-5) in parallel uitgevoerd met elk 10 l DNA als inputvolume. 6. Opzuivering van geligeerd DNA met AMPure beads: Hiervoor worden er vijf opzuiveringsreacties in parallel uitgevoerd met een bead/dna ratio van 0,50. Het elutievolume van 1 opzuiveringsreactie bedraagt 24 l.

64 Kwaliteitscontrole van de opzuivering met de Agilent Bioanalyzer 2100 Van elke ligatie- en opzuiveringsreactie wordt 1 l geladen op een High Sensitivity DNA chip. In Figuur staan enerzijds de elektroferogrammen weergegeven van de vijf in-parallel geligeerde stalen vóór opzuivering (sh5-1, sh5-2, sh5-3, sh5-4 en sh5-5 ligatie) en anderzijds de elektroferogrammen van de vijf geligeerde stalen ná opzuivering met de AMPure beads (sh5-1, sh5-2, sh5-3, sh5-4, sh5-5 opzuivering). FIGUUR 4.15.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN DE VIJF GELIGEERDE STALEN VOOR EN NA OPZUIVERING MET AMPURE BEADS Uit de elektroferogrammen blijkt dat de opzuivering van het hoog moleculair gewicht DNA geslaagd is. Na opzuivering is de piek van de originele amplicons zo goed als verdwenen. Bovendien toont dit experiment ook aan dat de ligatie en opzuivering in sterke mate reproduceerbaar zijn Fragmentatie In Tabel staat een samenvatting weergegeven van de geteste fragmentatie-condities op het geligeerd-amplicon-staal. Om op zeker te spelen worden eerst de settings getest waarbij het DNA gefragmenteerd wordt in fragmenten tot 500 bp (fragmentatie-condities 1,2 en 3) en wordt het bekomen lengteprofiel geanalyseerd d.m.v. een bioanalyzer run met een High Sensitivity DNA chip. Als uit deze resultaten blijkt dat de shearing van het geligeerd-amplicon staal werkt, wordt er verder gefragmenteerd in fragmenten van 300 bp.

65 Bij het testen van fragmentatie-condities 1 tot en met 3 wordt er opnieuw op verschillende tijdspunten een aantal l uit het covaris epje gepipetteerd en verder gefragmenteerd op het resterend volume in het covaris epje. TABEL 4.15.: GETESTE FRAGMENTATIE-CONDITIES OP HET GELIGEERD-AMPLICON- STAAL Fragmentatie-condities Target Base Pair (peak) Duty cycle 5% 5% 5% 5% Intensity Cycles per Burst Time (seconds) Temperature 6,1 C Power mode Frequency sweeping Degassing mode Continuous Volume 110 l Buffer TE-buffer, ph 8 Mass (DNA) 605 ng Water level (RUN) S2 - max height Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Het lengteprofiel van het DNA wordt geanalyseerd d.m.v. een bioanalyzer run met een High Sensitivity DNA chip. De rode curve in Figuur stelt het geligeerd-amplicon staal voor vóór fragmentatie. De blauwe en groene curve zijn het resultaat van fragmentatie van het geligeerdamplicon staal waarbij de covariscondities ingesteld worden op respectievelijk 700 bp en 500 bp. Na fragmentatie met covaris zien we een piek verschijnen bij 700 bp. Om fragmenten van 300 bp te bekomen wordt er nog 90 seconden verder gesheared aan dezelfde condities. Er wordt een piek bereikt bij exact 300 bp (zie Figuur 4.17.).

66 FIGUUR 4.16.: ELEKTROFEROGRAM VAN NIET-GEFRAGMENTEERD GELIGEERD DNA EN ELEKTROFEROGRAMMEN VAN GEFRAGMENTEERD GELIGEERD DNA GETARGET OP 700 BP EN 500 BP FIGUUR 4.17.: ELEKTROFEROGRAM VAN GEFRAGMENTEERD GELIGEERD DNA GETARGET OP 300 BP Om na te gaan of dit staal geschikt is voor een library preparation voor paired-end sequencing met de Illumina Genome Analyzer IIx wordt de concentratie van de fragmenten van 300 bp bepaald door manuele integratie van oppervlakte onder de curve van 234 tot 367 bp (zie Figuur 4.18.). De concentratie bedraagt 938,84 pg/ l. Aangezien we van dit staal ongeveer 100 l overhouden, betekent dit dat we over 93,884 ng DNA met de gewenste lengte beschikken. We beschikken dus over voldoende DNA aangezien 50 tot 100 ng nodig is voor het Illumina protocol.

67 FIGUUR 4.18.: MANUELE INTEGRATIE VAN DE AUC VAN 267 TOT 334 BP Fragmentatie van PCR-amplicons Genereren van de amplicons via een qpcr-reactie In deze test is het de bedoeling om na te gaan of het met Covaris mogelijk is om PCRproducten ad random te shearen in fragmenten van bp. Concreet worden hiervoor in eerste instantie amplicons gegenereerd met een qpcr-reactie. De amplicons hebben een lengte van 200 bp, 330 bp, 480 bp en 590 bp. Er wordt ook een mix gemaakt van deze amplicons. 1. Pipetteer het volume uit de wells van de QPCR-plaat in een epje. 2. Meet het volume van elk epje (ongeveer 100 l). 3. Bereid de mix van amplicons: Pipetteer uit elk epje 20 l in een nieuw epje. 4. Leng elk epje aan met TE-buffer tot een volume van 120 l Fragmentatie Op elk van de PCR-amplicons en op de mix van amplicons worden er vervolgens verschillende fragmentatie-condities getest (zie Tabel 4.16.). Net zoals bij de voorgaande experimenten met Covaris wordt er op verschillende tijdspunten telkens een aantal l uit het totale reactievolume gepipetteerd en verder gesheared op het resterend reactievolume.

68 TABEL 4.16.: GETESTE FRAGMENTATIE-CONDITIES OP ELK VAN DE PCR-AMPLICONS EN DE AMPLICON MIX Fragmentatie-condities Target Base Pair (peak) Minimaal ( bp) Duty cycle 5% 5% 5% 5% Intensity Cycles per Burst Time (seconds) Temperature 6,1 C Power mode Frequency sweeping Degassing mode Continuous Volume 120 l Buffer TE-buffer, ph 8 Mass (DNA) not measured Water level (RUN) S2 - max height Kwaliteitscontrole van de fragmentatie met de Agilent Bioanalyzer 2100 Het lengteprofiel van het DNA wordt geanalyseerd d.m.v. een bioanalyzer run met een High Sensitivity DNA chip. In Figuur staan de elektroferogrammen weergegeven van een aantal geteste fragmentatie-condities op het staal met het PCR-product met een lengte van 200 bp. Bij de rode curve werd er gedurende 3 minuten gesheared, bij de blauwe curve gedurende 7 minuten en bij de groene curve gedurende 9 minuten. In de elektroferogrammen is duidelijk te zien dat de piek van het originele PCR-product bij 200 bp alsmaar kleiner wordt en de piek bij 100 bp alsmaar groter wordt naarmate er langer gefragmenteerd wordt met covaris. FIGUUR 4.19.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN EEN AANTAL GETESTE FRAGMENTATIE- CONDITIES OP HET STAAL MET 200 BP AMPLICON

69 Dezelfde evolutie is op te merken in Figuren 4.20., en waarin de elektroferogrammen staan afgebeeld van dezelfde fragmentatie-condities op respectievelijk de stalen met PCR-product met een lengte van 330 bp, 590 bp en het staal met de mix van amplicons. De mix bevat amplicons met een lengte van 200 bp, 330 bp, 480 bp en 590 bp. Wat ook opvalt is dat de piek van de originele amplicons veel langzamer verdwijnt bij een kort amplicon in vergelijking met een lang amplicon. Voor een kort amplicon moet er, met het oog op het bereiken van equimolariteit, m.a.w. langer gecovarist worden om de piek van de originele amplicons volledig weg te shearen tot bp fragmenten. FIGUUR 4.20.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN EEN AANTAL GETESTE FRAGMENTATIE- CONDITIES OP HET STAAL MET 330 BP AMPLICON FIGUUR 4.21.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN EEN AANTAL GETESTE FRAGMENTATIE- CONDITIES OP HET STAAL MET 590 BP AMPLICON

70 FIGUUR 4.22.: ELEKTROFEROGRAMMEN VAN EEN AANTAL GETESTE FRAGMENTATIE- CONDITIES OP DE MIX VAN AMPLICONS De ideale condities om de pools met PCR-amplicons van de 5 doofheidsstalen te fragmenteren zijn waarschijnlijk: Duty cycle: 5 %, Intensity: 5, Cycles per burst: 200, Time: 12 min. Er wordt ervoor gekozen om 3 minuten langer te shearen om equimolariteit van de amplicons te bekomen. Als we de elektroferogrammen van de fragmentatie met het enzyme vergelijken met de elektroferogrammen van de fragmentatie van gdna met covaris valt het op dat de distributie van fragmentlengtes bij fragmentatie met Covaris veel nauwer is dan bij fragmentatie met het enzyme. Bovendien gaat de fragmentatie met het enzyme gepaard met een groot verlies aan DNA waardoor de opbrengst van DNA met de gewenste fragmentlengte erg laag is.

71 5. CONCLUSIE De Next Generation Sequencing (NGS) technologie vormt een krachtig diagnostisch platform om mutaties op te sporen in specifieke ziektegenen bij genetisch heterogene aandoeningen zoals doofheid. Met deze technologie kunnen onderliggende genetische defecten opgespoord worden en kan de overerving van het verantwoordelijke ziektegen binnen families met een erfelijke aandoening nauwkeurig in kaart gebracht worden. Deze kennis draagt bovendien bij tot de ontrafeling van pathofysiologische mechanismen die leiden tot gehoorverlies en opent perspectieven voor mogelijke behandelingsstrategieën. In deze onderzoeksstage was het de bedoeling om vijftien volledige doofheidsgenen van vijf verschillende patiënten te sequeneren met de Illumina Genome Analyzer IIx. Er wordt gestreefd naar amplicon sequencing met de Illumina sequeneringstechnologie omwille van een hogere throughput en lagere kostprijs per basenpaar in vergelijking met 454 sequencing. Om sequencing van lange amplicons mogelijk te maken met een short read sequencer werd een protocol ontwikkeld van ligeren en ad random shearen. De studie bestond eruit om de verschillende stappen van het protocol te optimaliseren. Voor het ligeren van de amplicons, de size selectie van het geligeerde DNA en de shearing werden verschillende strategieën met elkaar vergeleken. De eerste belangrijke stap bij het gebruik van een NGS-platform voor moleculaire diagnostiek is de amplificatie van de exonen van de vijftien te sequeneren doofheidsgenen met een PCR-reactie. In een volgend stadium worden de PCR-producten opgezuiverd, waarna de uiteinden blunt worden gemaakt voor ligatie in een end-repair reactie. De ligatiereactie werd getest met drie verschillende inputhoeveelheden. Uit de resultaten van deze vergelijkende studie kan besloten worden dat de ligatiereactie extreem concentratie-afhankelijk is. De opbrengst van HMW geligeerd DNA is het hoogst bij de ligatiereactie met als relatieve inputconcentratie 10. Om de HMW geligeerde DNA-fragmenten op te zuiveren uit de ligatiereactie werden twee methodes getest, namelijk de Double SPRI methode en de Chroma Spin 1000 kolom. Uit de resultaten van dit vergelijkend experiment blijkt dat voor de scheiding van het LMW DNA van het HMW DNA de te verkiezen strategie de Double SPRI methode is. In dit onderzoeksproject werden twee shearing methodes met elkaar vergeleken, namelijk het enzyme NEBNext TM dsdna Fragmentase en Covaris. Hiervoor werden er verschillende vergelijkende experimenten opgezet. Uit de resultaten bleek dat de distributie van fragmentlengtes bij de fragmentatie met Covaris veel nauwer is dan bij fragmentatie met het enzyme. Bij de fragmentatie met het enzyme gaat de meerderheid van het DNA verloren waardoor de opbrengst van DNA met de gewenste fragmentlengte laag is. Bovendien is de fragmentatiereactie met het enzyme moeilijk te controleren. De reactie is afhankelijk van de DNA-concentratie, de enzyme concentratie, de incubatietijd en de temperatuur. Voor de shearing gaat de voorkeur uit naar de veel duurdere Covaris technologie.

72 Uit de resultaten van al deze vergelijkende studies werden de beste condities geselecteerd voor het finale protocol voor amplicon sequencing met de Illumina Genome Analyzer IIx. Deze werden toegepast op de vijf patiëntenstalen. Het finale protocol ziet er als volgt uit: 1) Opzuivering van de qpcr-producten: QIAquick PCR Purification kit. 2) End repair van de amplicons: End-It TM DNA End-Repair Kit (Epicentre Biotechnologies). De end repair reactie is standaard een 50 l reactie waarbij 5 g DNA blunt end kan gemaakt worden. 3) Ligeren van de amplicons: Fast-Link TM DNA Ligation Kit (Epicentre Biotechnologies). De ligatiereactie is standaard een 15 l reactie. Er worden vijf ligatiereacties in parallel uitgevoerd met als inputvolume 10 l. 4) Size selectie van het geligeerde DNA met de Double SPRI methode. Er worden vijf size selecties in parallel uitgevoerd met een bead:dna ratio van 0,5 (deze ratio wordt bepaald na voorafgaandelijke kalibratie van het lot AMPure beads). De elutievolumes worden finaal samengevoegd in een covarisepje voor fragmentatie. 5) Ad random shearen van het geligeerde DNA in fragmenten van 300 bp met het Covaris S2 toestel. De aanbevolen fragmentatie-condities zijn: Duty cycle: 5 %- Intensity: 5 - Cycles per burst: Time: 180 sec. In een verdere follow-up van deze studie kan nagegaan worden of dit protocol tot de beoogde effecten geleid heeft (o.a. op het vlak van equimolariteit). Het grote voordeel van dit protocol is dat de procedure PCR-gebaseerd is, waardoor het zo vaak als nodig kan herhaald worden. In een bijkomend experiment werden ook de PCR-amplicons van de vijf patiëntenstalen rechtstreeks gefragmenteerd met het Covaris S2 toestel. De gebruikte fragmentatie-condities zijn: Duty cycle: 5 %, Intensity: 5, Cycles per burst: 200, Time: 12 min. In een verdere follow-up van deze studie kan worden nagegaan welke procedure, namelijk het protocol van ligeren en ad random shearen of het rechtstreeks shearen van PCR-amplicons, de beste sequencingresultaten oplevert.

73 6. LITERATUURLIJST GS FLX Customer Presentation Overview 7. GS FLX Titanium General Library Preparation Method Manual 8. GS Titanium Customer Overview 9. GS FLX Titanium empcr Method Manual GS FLX Titanium Sequencing Method Manual

74 6. BIJLAGEN Bijlage 1: Resultaten van de kalibratie van het lot AMPure beads In Figuur 1.1. staan de resultaten van de kalibratie van de AMPure beads weergegeven. De getallen boven elke laan verwijzen naar het volume beads dat gebruikt werd in de kalibratie. In het elektroforesepatroon ziet men duidelijk dat de size cut-off stijgt als de bead/dna ratio daalt. FIGUUR 1.1..: ELEKTROFORESEPATROON VAN DE KALIBRATIE VAN DE AMPURE BEAD

75 Relatieve Fluorescentie (Rfu) Bijlage 2: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie genomisch DNA van Roche en size selectie met de Double SPRI methode TABEL 2.1.: RFU-WAARDEN VAN DE STANDAARDEN Standaarden (ng/ l) Rfu 1 Rfu 2 Gemiddelde Rfu , , , , , , , y = 1.927,68x + 377, Concentratie (ng/ l) FIGUUR 2.1.: IJKLIJN: RELATIEVE FLUORESCENTIE (RFU) IN FUNCTIE VAN DE CONCENTRATIE (ng/ l)

76 TABEL 2.2.: RFU-WAARDEN VAN DE STALEN Stalen Rfu 20 min voor opzuivering min voor opzuivering min voor opzuivering min opzuivering min opzuivering min opzuivering min opzuivering min opzuivering min opzuivering

77 Bijlage 3: Gebruikte formule voor de berekening van de volumes van de reagentia voor de ds DNA Fragmentase reactie van het geligeerde staal hl ir bij het experiment: Fragmentatie van geligeerde amplicons = x 17 + x + x + (x/10) <=> x 17 + (21/10) x <=> x <=> x <=> 0,79 x <=> x = = = = = 0,1 0,1 1,7 + (21/100) x 1,7 + 0,21 x 1,7 2,15 met x: met (x/10): volume 10x Fragmentase Reactiebuffer volume dsdna Fragmentase volume 100x BSA FIGUUR 3.1.: BEREKENING VAN DE VOLUMES VAN DE REAGENTIA VOOR DE DS DNA FRAGMENTASE REACTIE VAN HET GELIGEERDE STAAL HL IR

78 Relatieve Fluorescentie (Rfu) Bijlage 4: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie van geligeerde amplicons TABEL 4.1.: RFU-WAARDEN VAN DE STANDAARDEN Standaarden (ng/ l) Rfu 1 Rfu 2 Gemiddelde Rfu , , y = 1903,1x + 162, Concentratie (ng/ l) FIGUUR 4.1.: IJKLIJN: RELATIEVE FLUORESCENTIE (RFU) IN FUNCTIE VAN DE CONCENTRATIE (ng/ l) TABEL 4.2.: RFU-WAARDEN VAN DE STALEN NA FRAGMENTATIE Stalen Rfu hl ir : 20 min fragmentatie 9401 hl ir : 30 min fragmentatie 4215

79 Relatieve Fluorescentie (Rfu) Bijlage 5: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie van verschillende concentraties genomisch DNA TABEL 5.1.: RFU-WAARDEN VAN DE STANDAARDEN Standaarden (ng/ l) Rfu 1 Rfu 2 Gemiddelde Rfu , , , , , , , y = 1.927,68x + 377, Concentratie (ng/ l) FIGUUR 5.1.: IJKLIJN: RELATIEVE FLUORESCENTIE (RFU) IN FUNCTIE VAN DE CONCENTRATIE (ng/ l)

80 TABEL 5.2.: RFU-WAARDEN VAN DE STALEN Stalen Rfu 25 ng/5 l - 10 min ng/5 l - 30 min ng/5 l - 60 min ng/5 l - 10 min ng/5 l - 30 min ng/5 l - 60 min ng/5 l - 10 min ng/5 l - 30 min ng/5 l - 60 min 867

81 Relatieve Fluorescentie (Rfu) Bijlage 6: Resultaten van de Picogreenmeting bij het experiment: Fragmentatie van geligeerde amplicons in een hogere concentratie TABEL 6.1.: RFU-WAARDEN VAN DE STANDAARDEN Standaarden (ng/ l) Rfu 1 Rfu 2 Gemiddelde Rfu ,5 0, ,2 0, , , , , , y = 1999,1x + 438, Concentratie (ng/ l) FIGUUR 6.1.: IJKLIJN: RELATIEVE FLUORESCENTIE (RFU) IN FUNCTIE VAN DE CONCENTRATIE (ng/ l)

82 TABEL 6.2.: RFU-WAARDEN VAN DE STALEN Stalen Rfu 481 voor opzuivering (5 x 15 l) opgezuiverd met beads (5 x 24 l) voor opzuivering (5 x 15 l) opgezuiverd met beads (1 x 24 l) 55803

83 Bijlage 7: Resultaten van de Nanodropmeting bij het experiment: Fragmentatie van PCR amplicons TABEL 7.1.: CONCENTRATIE VAN DE POOL SH5 S1 NA OPZUIVERING Sample ID Concentratie (ng/ l) OD 260/280 blanco 0,22 / sh5 S1 pool 75,44 1,87 blanco 0,46 / FIGUUR 7.2.: ABSORPTIESPECTRA VAN DE POOL SH5 S1 NA OPZUIVERING