Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen

Transcriptie

1 Stage Eindwerk Studiegebied: Bachelor Gezondheidszorg Biomedische Laboratoriumtechnologie Afstudeerrichting Farmaceutische en Biologische Laboratoriumtechnologie Academiejaar Student Filip Slabbinck Thema Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Stageplaats Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG)

2 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Woord vooraf In de eerste plaats zou ik graag Kathleen Claes bedanken. Dankzij Kathleen heb ik de mogelijkheid gekregen om mijn stage door te brengen op het DNA-labo in het Centrum voor Medische Genetica aan het Universitair Ziekenhuis te Gent. Ondanks haar drukke agenda heeft ze tijd vrijgemaakt om dit eindwerk door te nemen. Bedankt voor alle hulp. Mijn grootste dankwoord gaat uit naar Kim DeLeeneer. Tussen haar drukke agenda door heeft zij tijd vrijgemaakt om mij te begeleiden op het vlak van zowel stage als eindwerk. Dankzij jouw geduld en kritische opmerkingen is dit eindwerk geworden tot wat het nu is. Bedankt voor alle uitleg, steun en vertrouwen die je me gegeven hebt. Ik wil ook graag alle medewerkers van het DNA-labo in het CMGG bedanken, in het bijzonder Ilse en Justine voor de leuke en aangename samenwerking op praktisch vlak. Dankzij deze personen heb ik een zeer aangename en ontspannende stageperiode gekend. Ik zou ook graag Eveline en Charlotte, de mede-stagiars, bedanken voor de toffe periode die we samen beleefd hebben. Mijn dank gaat ook uit naar de lectoren van de opleiding Biomedische Laboratoriumtechnologie van de Hogeschool West-Vlaanderen departement Simon Stevin. Speciaal wil ik Mieke Demeyere, mijn promotor, bedanken voor de steun, de hulp en de nuttige tips bij het schrijven van dit eindwerk. Als laatste wil ik mijn ouders en broers bedanken voor alle steun die ze me gegeven hebben tijdens de afgelopen jaren. 1

3 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Samenvatting Borstkanker is de op één na grootste doodsoorzaak bij vrouwen. Het is tevens één van de meest voorkomende vormen van kanker bij vrouwen. Het is een aandoening waarbij zowel genetische als niet-genetische factoren een rol spelen. Één van de belangrijkste factoren zijn de familiale voorgeschiedenis en de genetische gevoeligheid. Bij de genetische gevoeligheid wordt er een onderscheid gemaakt tussen erfelijke en familiale borstkanker. De erfelijke borstkanker wordt voornamelijk veroorzaakt door twee genen, BRCA1 en BRCA2. Defecten in deze genen geven een verhoogd risico op borstkanker. Neurofibromatose type 1 (NF1) is een autosomaal dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. De aandoening heeft een variabele expressie en wordt gekenmerkt door pigment abnormaliteiten en/of de vorming van tumoren of neurofibromen. Dit zijn complexe goedaardige tumoren en worden opgedeeld in twee grote types, de plexiforme en de discrete neurofibromen. Tot op heden worden beide aandoeningen in het CMGG gescreend op sequentievariaties. Voor borstkanker wordt BRCA1/2 mutatiedetectie uitgevoerd met behulp van High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA). Door het polymorf karakter van beide genen dient er nog een groot aantal sequentievariaties gesequeneerd te worden. NF1 wordt volledig gescreend op cdna-niveau. Met deze methode wordt na PCR het volledige fragment gesequeneerd. Omdat voor beide methoden er nog steeds veel dient te worden gesequeneerd, wordt getracht om snellere, goedkopere en minder arbeidsintensieve alternatieven in te voeren en te optimaliseren. Beide nieuwe technieken zijn HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes (borstkanker) en mutatiescanning (NF1). Beide toepassingen worden uitgevoerd op de LightScanner. HRMCA is een post-pcr methode gebaseerd op het uiteensmelten van DNA. Bij het uiteensmelten van het DNA komt de vooraf ingebouwde fluorescerende kleurstof (LCGreen Plus) vrij. De vrijgekomen fluorescentie resulteert in een specifieke smeltcurve. Bij genotypering worden de heteroduplexen en de homoduplexen (wild types en varianten) weergegeven. Bij mutatiescanning vertonen de wild types en sequentievariaties een verschillende smeltcurve. De analyse van beide methodes gebeurt met de software (Call-IT) horend bij de LightScanner. De analyse is gebaseerd op de visuele inspectie van de data en gebeurt in drie stappen. 2

4 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Voor BRCA1/2 wordt de genotypering van drie verschillende SNP s geoptimaliseerd in vier verschillende fragmenten met behulp van ongelabelde probes, namelijk SNP c C>T (BRCA1 exon 8), SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 8 en 9) en SNP c.7470 A>G (BRCA2 exon 14 fragment 2). Voor SNP c.2201 C>T in BRCA1 exon 11 fragment 8 en 9 wordt dezelfde probesequentie gebruikt. Om de optimalisatie te valideren, wordt een blinde screening uitgevoerd met 95 stalen en één blanco. Alle homo- en heterozygoten worden correct geïdentificeerd. Voor BRCA1 c C>T was de kwaliteit van de analyse voor twee DNA stalen te laag om correct te identificeren. Bijkomende experimenten dienen te gebeuren om de oorzaak hiervan te achterhalen. De methode is geschikt voor de detectie van frequente BRCA1/2 SNP s, maar een sterke inspanning voor de optimalisatie is vereist. Voor mutatie onderzoek van het NF1 gen worden in het kader van deze thesis twaalf fragmenten van de 60 geoptimaliseerd. Voor alle fragmenten kon de amplificatie gebeuren met eenzelfde PCR programma. De validatie van de optimalisatie gebeurt door een test uit te voeren met positieve en negatieve controles en toont 100% sensitiviteit. Eenmaal beide technieken geoptimaliseerd zijn, zullen ze opgenomen worden in de diagnostiek. HRMCA is een eenvoudige techniek, snel in analyse, goedkoop en weinig arbeidsintensief. De optimalisatie van de techniek vergt enige inspanning maar loont gezien het groot aantal patiënten dat in het labo dient onderzocht te worden voor deze grote genen. Hierdoor zal in de toekomst het dure sequeneren sterk gereduceerd kunnen worden. 3

5 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Lijst met afkortingen en symbolen ART Aerosol Resistant Tips Bp base pair BRCA Breast Cancer Gene cdna copy- of complement DNA CMGG Centrum voor Medische Genetica Gent ddntp dideoxy ribonucleotide triphosphate DGGE Denaturerende Gradiënt Gel Elektroforese DMSO dimethylsulfoxide DNA Deoxyribonucleïnezuur dsdna dubbelstrengig DNA ssdna enkelstrengig DNA HBOC Hereditary Breast and Ovarian Cancer HRM High Resolution Melting HRMCA High Resolution Melting Curve Analysis mrna messenger RNA NF1 Neurofibromatose type 1 NIH National Institute of Health PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleïnezuur SNP Single Nucleotide Polymorphism Ta annealing temperatuur TBE Tris Borate EDTA TSG tumorsuppressorgen UV ultraviolet 4

6 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Verklarende woordenlijst Amplicon Genotyperen Hybridisatie Primerdimeren Pseudogen Sequeneren Tumorsuppressorgen een klein DNA-fragment dat wordt bekomen door de binding van primers aan de DNA-strengen. Na PCR verkrijgt men kleinere DNA-fragmenten of amplicons. het bepalen van het genetisch patroon van een organisme het samenvoegen van twee enkele complementaire DNAstrengen tot een dubbele helix bijproducten ontstaan door binding tussen de primers onderling kopie van een functioneel gen dat door bepaalde structurele veranderingen geen (functioneel) eiwit meer produceert het nagaan van de basenvolgorde in het DNA een gen dat onbeperkte deling van de cel voorkomt, en daarmee het ontstaan van een tumor verhindert 5

7 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Lijst van figuren en tabellen Figuren Figuur 2.1 links: vader is drager van een afwijkend gen (pijl)...19 Figuur 2.2 links: plaats van het BRCA1 gen op chromosoom 17 (gele pijl) [2]...19 Figuur 2.3 links: de plaats van het BRCA2 gen op chromosoom 13 (gele pijl) [3]...20 Figuur 2.4 Knudson's 2 hit model voor tumorontwikkeling [33]...21 Figuur 2.5 links: Plexiforme neurofibroom...22 Figuur 2.6 voorstelling van het NF1 gen...24 Figuur 2.7 SNP: single nucleotide polymorphism [14]...25 Figuur 2.8 nonsense mutatie [44]...26 Figuur 2.9 missense mutatie [44]...26 Figuur 2.10 links: insertie...27 Figuur 2.11 links: wild-type...27 Figuur 2.12 splice-site mutaties [38]...28 Figuur 2.13 links: niet-homologe crossing-over [18]...29 Figuur 2.14 DGGE proces [5]...30 Figuur 2.15 DNA-sequenering volgens de methode van Sanger [39]...32 Figuur 2.16 resultaat automatische DNA-sequencing [10]...32 Figuur 2.17 links: SYBR Green gebonden op het dsdna...34 Figuur 2.18 verschil tussen SYBR Green en LCGreen Plus. SYBR Green detecteerd de heteroduplex in de heterozygote mutatie niet in tegenstelling tot LCGreen Plus. F508del regio is bij cystic fibrosis een voorbeeld van een heterozygote mutatie.[45]34 Figuur 2.19 genormaliseerde smeltcurve [20]...35 Figuur 2.20 HRM analyse: difference plot. De verschillende genotypes worden van elkaar onderscheiden [17]...36 Figuur 2.21 asymmetrische PCR met een ongelabelde probe [28]...37 Figuur 3.1 PCR reactie [42]...40 Figuur 3.2 principe gelelektroforese...47 Figuur 3.3 Lightscanner (Idaho technology Inc) [45]...49 Figuur 3.4 software Call-IT beginscherm...50 Figuur 3.5 start run scherm...51 Figuur 3.6 plate image fluorescentiemeting van de wells

8 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Figuur 3.7 aanmaken van een subset...53 Figuur 3.8 normaliseren van de smeltcurves...54 Figuur 3.9 grouping...55 Figuur 3.10 difference curven...55 Figuur 3.11 normaliseren van de curven...56 Figuur 3.12 grouping...56 Figuur 4.1 gradiënt PCR BRCA1 fragment 11.8 en BRCA2 fragment Figuur 4.2 verschil in DNA-concentratie: links 50 ng/µl, rechts 100 ng/µl...60 Figuur 4.3 SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 8)...61 Figuur 4.4 SNP c.2201 C>T (BRCA1 exon 11 fragment 9)...61 Figuur 4.5 BRCA2 SNP c.7470 A>G...62 Figuur 4.6 eindresultaat BRCA1 SNP c C>T op een Ta van 53 C...62 Figuur 4.7 het effect van het aantal cycli in de PCR-reactie...63 Figuur 4.8 het effect van DMSO op BRCA1 c C>T...63 Figuur 4.9 verschil in resultaat tussen verschillende ampliconlengtes...64 Figuur 4.10 resultaat blinde test BRCA2 c.7470 A>G...65 Figuur 4.11 resultaat blinde test BRCA1 c.2201 C>T...65 Figuur 4.12 resultaat blinde test BRCA1 c C>T...65 Figuur 4.13 controle van de specificiteit van vijf NF1 fragmenten met positieve en negatieve controles...67 Figuur 4.14 resultaat LightScanner PCR Figuur 4.15 positief resultaat na PCR55 voor exon Figuur 4.16 sequentiedeel exon 2 verkregen na sequenering...71 Figuur 4.17 resultaat met een plat profiel (exon 34)...72 Figuur 4.18 profiel met een afwijkende curve (exon 28)...73 Figuur 4.19 positief resultaat waarvoor geen mooie piek verkregen is...73 Figuur 5.1 nagaan van de cross-complementary tussen primers onderling en tussen primers en probe...75 Figuur 5.2 aanwezigheid van een aspecificiteit in SNP c C>T...76 Figuur 5.3 twee SNP s onder één probe

9 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Tabellen Tabel 2.1 diagnostische criteria voor erfelijke borstkanker...17 Tabel 2.2 diagnostische criteria voor familiale borstkanker...18 Tabel 2.3 diagnostische criteria voor NF1 volgens NIH (National Institute of Health)...22 Tabel 3.1 probes BRCA1/ Tabel 3.2 primers BRCA1/ Tabel 3.3 mastermix asymmetrische PCR met een totaal volume van 15 µl...43 Tabel 3.4 mastermix gradiënt PCR met een totaal volume van 25 µl...43 Tabel 3.5 mastermix PCR met heteroduplex stap met een totaal volume van 25 µl...44 Tabel 3.6 basisprogramma (PROBE) asymmetrische PCR...45 Tabel 3.7 PCR programma NF1_grad...45 Tabel 3.8 PCR programma NF1_HD...46 Tabel 4.1 protocol genotypering van BRCA1/2 SNP s met behulp van ongelabelde probes...60 Tabel 4.2 condities NF1 voor een totaal volume van 25 µl...68 Tabel 4.3 primerdimeren...68 Tabel 4.4 resultaat agarosegel PCR Grafiek Grafiek 2.1 aantal vrouwelijke borstkankerpatiënten per leeftijdscategorie in België in 2003 (gegevens [17]

10 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Inhoudsopgave Woord vooraf... 1 Samenvatting... 2 Lijst met afkortingen en symbolen... 4 Verklarende woordenlijst... 5 Lijst van figuren en tabellen... 6 Inhoudsopgave Inleiding, situatieschets en probleemstelling Situering Inleiding Doelstelling Literatuurstudie Borstkanker Incidentie Risicofactoren Geslacht Leeftijd Gynaecologische of hormonale invloeden Geologie, leefstijl en omgeving Familiale voorgeschiedenis Genetische gevoeligheid voor borstkanker Erfelijk borstkankersyndroom Familiaal borstkankersyndroom BRCA1/BRCA Inleiding BRCA BRCA BRCA1/BRCA2 als tumorsuppressorgenen Neurofibromatose type Klinische aspecten en diagnostische criteria

11 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Neurofibromen De genetische aspecten van het NF1 gen Mutaties Inleiding Puntmutaties Nonsense mutatie Missense mutatie Inserties en deleties Silent mutatie/substitutie Splice-site mutatie Duplicatie/grote deleties Mutatiedetectietechnieken Denaturerende gradiënt gel elektroforese (DGGE) DNA-sequenering High resolution melting curve analysis (HRMCA) LCGreen Plus Mutatiedetectie met HRMCA Genotypering met ongelabelde probes Materialen en methoden Polymerase chain reaction Principe PCR Asymmetrische PCR Gradiënt PCR Materiaal Methode PCR voorbereiding PCR uitvoering Agarosegelelektroforese Principe Materiaal Methode

12 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen Gieten van de gel Voorbereiden van de stalen en het laden van de gel LightScanner Voorbereiding mutatiedetectie en genotypering met behulp van ongelabelde probes op de LightScanner Loopprogramma LightScanner Analyse Voorbereidend werk analyse Verdere analyse mutatiedetectie Analyse genotypering met behulp van ongelabelde probes Materiaal Resultaten Genotypering van frequente BRCA1/2 SNP s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner Voorbereidende gradiënt Genotypering met behulp van HRMCA en ongelabelde probes Conditiebepaling Hoeveelheid DNA Annealing temperatuur Aantal cycli DMSO Primers Blinde screening Mutatiescreening van het NF1 gen Voorbereidende testen Conditiebepaling Primerdimeren PCR Sequeneren Opsplitsen exon en/of nieuwe primers Gradiënt PCR Discussie

13 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen 5.1 Genotypering van frequente BRCA1/2 SNP s met behulp van HRMCA en ongelabelde probes op de LightScanner Mutatiescanning van het NF1 gen Conclusie...79 Literatuurlijst...80 Bijlagen...85 Bijlage 1 Resultaten PCR55 (LightScanner en agarosegel)...85 Colofon...88 Voor akkoord verklaring

14 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 1.1 Situering Het Centrum Medische Genetica Gent (CMGG) maakt deel uit van het Universitair Ziekenhuis Gent. Het vertegenwoordigt één van de acht genetische centra in België waar erfelijkheidsonderzoek wordt uitgevoerd. In haar werking worden drie grote opdrachten onderscheiden. In de eerste plaats vervult het CMGG een dienstverlenende rol voor patiënten of personen met vragen rond erfelijkheid. Een tweede opdracht is het uitvoeren van wetenschappelijk onderzoek. Een derde opdracht is het geven van onderwijs. De professoren en stafleden werkzaam op het CMGG geven les aan studenten uit verschillende faculteiten. Het CMGG staat onder leiding van Professor Dr. A. De Paepe. In het CMGG zijn twee verschillende labo afdelingen aanwezig. Er is het labo Cytogenetica dat zowel het cytogenetisch als het moleculair cytogenetisch onderzoekswerk uitvoert, in diagnostisch en onderzoeksverband. En er is het labo Moleculaire Genetica, opgesplitst in het DNA- en het bindweefsel-labo. Het DNA-labo verzorgt de moleculaire diagnostiek van erfelijke aandoeningen als mucoviscidose, fragiele X-syndroom, ziekte van huntington, enzovoort en er gebeurt onderzoek naar onder andere erfelijke en familiale kankersyndromen en oftalmogenetische aandoeningen. Het bindweefsel-labo verzorgt de moleculaire bindweefselaandoeningen en voert onderzoek uit naar erfelijk bindweefsel-, cardiovasculaire en skeletale aandoeningen. 1.2 Inleiding Borstkanker is een aandoening veroorzaakt door genetische en niet-genetische factoren en is tevens de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen. NF1 is een autosomale dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. De aandoening heeft een variabele expressie en wordt uiterlijk gekenmerkt door pigment abnormaliteiten. De genen geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker worden gescreend door middel van High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA). HRMCA is een techniek 13

15 Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde probes in BRCA1/2 SNP s en mutatiescanning van het NF1 gen gebaseerd op analyse van het smeltprofiel dat ontstaat bij het uiteensmelten van DNA. Door middel van mutatiescanning kunnen patiënten met een verhoogd risico geïdentificeerd worden. De methode gebeurt op de LightScanner en maakt gebruik van een fluorescente verzadigde kleurstof (LCGreen Plus) die na smelten een specifieke smeltcurve weergeeft. Het NF1 gen wordt gescreend door middel van directe sequenering op cdna niveau. Deze methode is tijdrovend en arbeidsintensief. 1.3 Doelstelling In het kader van erfelijk en familiaal borstkankeronderzoek wordt in het CMGG mutatiedetectie van de BRCA1/2 genen uitgevoerd met behulp van High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA). Door het polymorf karakter van deze genen dient er nog steeds een groot aantal variaties gesequeneerd te worden. In het CMGG gebeurt momenteel mutatie onderzoek van het NF1 gen door sequenering op cdna niveau. Deze methode is echter tijdrovend en arbeidsintensief. De algemene doelstelling van deze thesis is de optimalisatie van twee HRMCA toepassingen, namelijk de genotypering met behulp van ongelabelde probes voor de karakterisatie van frequente BRCA1/2 SNP s en de mutatiescanning van het NF1 gen. 14

16 probes in BRCA1/2 SNPs en mutatiescanning van het NF1 gen literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Borstkanker Incidentie Borstkanker is in vele Westerse landen, na hart- en vaatziekten, de grootste doodsoorzaak bij vrouwen tussen de 30 en 55 jaar [15]. Het is één van de meest voorkomende vormen van kanker bij vrouwen [47]. In België worden ongeveer ieder jaar 8000 à 9000 vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker. Het risico om borstkanker te ontwikkelen in België bedraagt voor vrouwen één op acht. Borstkanker komt in mindere mate ook voor bij mannen (ongeveer 80 patiënten per jaar). Van alle borstkankerpatiënten vertegenwoordigen mannen dan ook slechts 1% [5] Risicofactoren Borstkanker is een ziekte waarbij meerdere factoren een rol spelen, het is het resultaat van een interactie tussen omgevings- en genetische factoren Geslacht Een belangrijke risicofactor om borstkanker te ontwikkelen is het geslacht. De kans dat de ziekte zich manifesteert is 100 keer groter bij vrouwen dan bij mannen [34]. Vrouwen hebben meer borstweefsel en dus een hoger risico. Ook hormonale factoren spelen een rol. Oestrogenen stimuleren de ontwikkeling van borstkankercellen [5,44] Leeftijd Het risico op borstkanker stijgt met de leeftijd. Oudere vrouwen zijn in de loop der jaren meer blootgesteld aan risicoverhogende factoren dan jonge vrouwen. Vrouwen tussen de 50 en 59 jaar vormen de grootste risicogroep, zij vertegenwoordigen 70% van alle borstkankerpatiënten [15]. Slechts 0,3% van de borstkankerpatiënten komen voor tussen de leeftijd van 20 en 29 jaar (een overzicht wordt weergegeven in grafiek 2.1) [5,32]. 15

17 aantal Optimalisatie van HRMCA toepassingen: genotypering met behulp van ongelabelde literatuurstudie Leeftijd Aantal Aantal borstkankerpatiënten per leeftijdscategorie in België in leeftijd Grafiek 2.1 aantal vrouwelijke borstkankerpatiënten per leeftijdscategorie in België in 2003 (gegevens [19] Gynaecologische of hormonale invloeden Een verlengde blootstelling aan oestrogenen verhoogt het risico op borstkanker. Dit kan te wijten zijn aan een eerste vroege menstruatie (voor twaalf jaar), een late menopauze (na 50 jaar), een oestrogeenvervangende therapie, het kinderloos blijven of een eerste late zwangerschap (na 30 jaar) [5,32]. Borstvoeding geven kan een beschermend effect hebben tegen premenopauzale borstkanker. Bij vrouwen die vier tot twaalf maanden borstvoeding geven is er een risicovermindering van 22%. Het risico daalt naarmate vrouwen op jongere leeftijd borstvoeding geven [7] Geologie, leefstijl en omgeving Borstkanker komt het meest frequent voor in landen en regio s met een hoge graad van industrialisatie. In geïndustrialiseerde landen is er een verhoogde blootstelling aan carcinogenen en aan bestraling. Deze vergelijking is ook treffend voor Vlaanderen (184 op inwoners in 2003) en Wallonië (153 op inwoners in 2003) [19]. De leefstijl kan een groot risico vormen. Zwaarlijvigheid, verhoogde alcoholconsumptie en lage fysische arbeid kunnen het risico op borstkanker verhogen [5,32,44] Familiale voorgeschiedenis De familiale voorgeschiedenis voor borstkanker is één van de meest significante risicofactoren. Van alle vrouwen met borstkanker hebben er 15% een familiale voorgeschiedenis waarbij in een significant percentage een genetische afwijking kan gedetecteerd worden [16]. 16

18 literatuurstudie Het risico is afhankelijk van een aantal familiale factoren. Het risico wordt bepaald aan de hand van volgende factoren: graad van verwantschap tot de familieleden die getroffen zijn door borstkanker, het aantal familieleden met borstkanker, de leeftijd waarop borstkanker bij de familieleden is vastgesteld of bilaterale borstkanker bij een familielid [5] Genetische gevoeligheid voor borstkanker Ongeveer 80% van de borstkankers is sporadisch. Sporadisch betekent dat er in de familie geen verhoogd voorkomen van borstkanker is [16]. Sporadische kankers zijn het gevolg van een accumulatie van verschillende mutaties in verschillende genen. Deze mutaties komen toevallig voor in de lichaamscellen van de patiënt of onder invloed van externe factoren [26]. In 5-10% van alle borstkankerpatiënten kan een genetische oorzaak worden aangetoond [34]. De genetische gevoeligheid is één van de belangrijkste en meest bestudeerde risicofactoren. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen familiale en erfelijke borstkanker, respectievelijk geassocieerd met een minder sterk en een sterk verhoogd risico Erfelijk borstkankersyndroom Erfelijke borstkanker vertegenwoordigt 5-8 % van alle borstkankers [47]. Het overervingspatroon voor borstkanker is autosomaal dominant. Deze borstkankerpatiënten hebben tevens een verhoogd risico voor ovariumkanker [5]. De diagnostische criteria voor het erfelijke borstkanker en/of ovariumkanker syndroom worden beschreven in tabel 2.1. Tabel 2.1 diagnostische criteria voor erfelijke borstkanker Erfelijke borst- en/of ovariumkanker (HBOC) Diagnose van borst- en/of ovariumkanker in: 1. ten minste drie eerste graads verwanten 2. ten minste twee opeenvolgende generaties 3. ten minste één patiënt gediagnosticeerd voor de leeftijd van Familiaal borstkankersyndroom Deze groep omvat ongeveer 15% van alle borstkankers. Bij deze families komt borstkanker vaker voor en op jongere leeftijd vergeleken met de normale populatie. In de stamboom wordt geen duidelijk overervingspatroon teruggevonden. In 20-30% van de 17

19 literatuurstudie families komt een BRCA-mutatie voor, vaak in kleine families of waar de overerving gebeurt via de mannelijke verwanten [5]. De diagnostische criteria voor familiale borstkanker worden vermeld in tabel 2.2. Tabel 2.2 diagnostische criteria voor familiale borstkanker Familiale borstkanker Diagnose van borstkanker: 1. in ten minste twee eerste graads verwanten op jonge leeftijd 2. bij families die niet aan de criteria voor HBOC voldoen BRCA1/BRCA Inleiding Tot nu toe zijn twee genen (BRCA1 en BRCA2) gekend die bij defect verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van borstkanker [34]. Ze zijn verantwoordelijk voor een klein percentage van alle borstkankers, maar voor 70-80% van alle erfelijke borstkankers. Personen die drager zijn van zo n mutatie hebben een sterk verhoogd risico op de ontwikkeling van borstkanker. Vrouwen met een defect gen hebben 55-85% kans om borstkanker te ontwikkelen en 15-65% om ovariumkanker te ontwikkelen voor de leeftijd van 70 jaar. Mannen die drager zijn van een aangetast gen hebben een verhoogde kans op borst- en prostaatkanker. De kans dat een man borstkanker ontwikkelt is kleiner dan 5%, maar hij kan wel de mutatie overdragen naar de volgende generatie. Bij iedere zwangerschap, waarbij één van de ouders drager is van een mutatie, is de kans 50% dat deze mutatie wordt overgeërfd. Het afwijkende gen kan zowel van de moeder als van de vader geërfd worden (figuur 2.1)[5]. 18

20 literatuurstudie Figuur 2.1 links: vader is drager van een afwijkend gen (pijl) rechts: moeder is drager van een afwijkend gen (pijl) onder: de kans op een afwijkend gen bij de kinderen is 50% [12] BRCA1 BRCA1 is gelokaliseerd in het jaar 1990 en geïsoleerd in het jaar BRCA1 is gelegen op de lange arm van chromosoom zeventien op chromosoomband 21 (17q21). Chromosoom zeventien wordt weergegeven in figuur 2.2. Meer precies, het gen is gelokaliseerd van bp tot bp ( Figuur 2.2 links: plaats van het BRCA1 gen op chromosoom 17 (gele pijl) [2] rechts: BRCA1 mutaties in de Belgische en Nederlandse populatie [1] BRCA1 is opgebouwd uit 24 exonen, waarvan twee exonen niet-coderend zijn (1A en 1B). Het eerste coderende exon is exon twee. Exon vier is een ingevoegd niet-coderend repetitief Alu element. De Alu insertie leidt tot de introductie van een voortijdig stopcodon. 19

21 literatuurstudie Exon elf is het grootste en vertegenwoordigt bijna 60% van de totale coderende sequentie [1,2,5] BRCA2 Het BRCA2 gen werd gelokaliseerd in het jaar 1994 en één jaar later volledig gekarakteriseerd. Het BRCA2 gen is gelegen op de lange arm van chromosoom dertien, op plaats 12.3 (13q12.3, figuur 2.3). Om precies te zijn, het gen is gelegen van bp tot bp ( Figuur 2.3 links: de plaats van het BRCA2 gen op chromosoom 13 (gele pijl) [3] rechts: BRCA2 mutaties in de Belgische en Nederlandse populatie [1] BRCA2 is opgebouwd uit 27 exonen. Van de 27 exonen zijn er 26 coderend. Er zijn twee grote exonen, exon tien en elf. Exon elf is het grootste exon. Het codeert voor bijna 50% van het totale eiwit. Samen met exon tien coderen beide exonen voor 60% van het gen [1,3,5] BRCA1/BRCA2 als tumorsuppressorgenen Beide genen zijn tumorsuppressorgenen (TSG). Een verhoogde expressie van de BRCA proteïnen in tumorcellijnen inhibeert de celgroei en de celdeling [26]. Knudson veronderstelde dat tumorgoei verkregen wordt als er schade voorkomt aan de functie van beide allelen. Bij erfelijke borstkankerpatiënten wordt bij één allel van het TSG een mutatie overgeërfd via paternale of maternale transmissie tijdens de conceptie (kiemlijn mutatie = first hit ). Als resultaat dragen alle ontwikkelde cellen in de zygote een mutante 20

22 literatuurstudie kopij. Om effectief kanker te ontwikkelen, moet ten minste één cel een second hit verkrijgen (somatische mutatie). Deze second hit is een beschadiging van het overblijvende wild-type allel. Het kan een tweede mutatie zijn of een intragenische deletie. Het individu heeft een hoger risico om kanker te ontwikkelen in vergelijking met individuen zonder kiembaanmutatie. In de sporadische vorm van kanker moeten immers beide hits voorkomen op het somatische niveau. De kans dat beide hits gebeuren in dezelfde cel is lager dan wanneer alle cellen al een kiembaanmutatie dragen [5]. De hypothese van Knudson wordt weergegeven in figuur 2.4. Figuur 2.4 Knudson's 2 hit model voor tumorontwikkeling [33] 2.2 Neurofibromatose type Klinische aspecten en diagnostische criteria Neurofibromatose type 1 (NF1), beter gekend als Von Recklinghausen neurofibromatose, is een autosomale dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. Wereldwijd komt deze aandoening voor bij één op 3500 individuen. 21

23 literatuurstudie De aandoening heeft een variabele expressie, verschillen worden gezien tussen families, binnen families en zelfs tussen verschillende lichaamsdelen van een NF1 patiënt. De meest voorkomende kenmerken zijn pigment abnormaliteiten (café-au-lait vlekken (figuur 5), sproeten en Lisch nodulen) en/of de vorming van tumoren of neurofibromen [25,35,41]. De diagnose NF1 wordt gesteld wanneer patiënten aan twee of meer van de volgende criteria voldoen (tabel 2.3): Tabel 2.3 diagnostische criteria voor NF1 volgens NIH (National Institute of Health) NF1 is aanwezig in een patiënt met twee of meer van volgende kenmerken zes of meer café-au-lait plekken > 5 mm in grootste diameter bij prepuberale individuen en > 15 mm in grootste diameter bij postpuberale individuen twee of meer neurofibromen van eender welk type of één plexiform neurofibroom Sproeten in de oksel- of liesstreek Optisch glioom twee of meer Lisch noduli Een karakteristiek beenderletsel, zoals wiggebeen dysplasie of uitdunning van de cortex van de lange beenderen met of zonder pseudoarthrose Een eerste graad verwant met NF1 Figuur 2.5 links: Plexiforme neurofibroom rechts: café-au-lait spots [31] 22

24 literatuurstudie Neurofibromen Het best gekende kenmerk van NF1 zijn neurofibromen. Dit zijn complexe goedaardige tumoren bestaande uit meerdere celtypes (Schwanncellen, mastcellen, fibroblasten,...). Deze tumoren kunnen ontstaan in de mantel van de perifere zenuwen van zowel kleine als grote zenuwen. Één enkele tumor kan ontstaan in ieder niet-nf1 individu, meerdere tumoren zijn kenmerkend voor NF1. Bij de meeste patiënten zijn geen neurofibromen aanwezig bij de geboorte. Ze verschijnen voor het eerst rond de puberteit. Bij vrouwelijke patiënten stijgt het aantal en de grootte van de neurofibromen tijdens de zwangerschap. De neurofibromen kunnen onderverdeeld worden in twee grote types: de discrete neurofibromen (cutaan en subcutaan) en de plexiforme neurofibromen. De cutane neurofibromen zijn vlezige, zachte knobbeltjes met een roze-roodachtige kleur. Ze kunnen ongemakken en jeuk veroorzaken en komen meestal voor op plaatsen waar er een hogere huidtemperatuur is. De subcutane neurofibromen zijn vaster en eivormig. Ze komen voor in dieper gelegen weefsels van het lichaam. Plexiforme neurofibromen groeien langs de lengte van de zenuw. Het zijn traaggroeiende tumoren die kunnen ontstaan in verschillende delen van het lichaam. De tumor kan zeer groot worden en effect hebben op een volledig lichaamsdeel (figuur 2.5) [25,35,41] De genetische aspecten van het NF1 gen Het NF1 gen is geïdentificeerd in het jaar Het is gelokaliseerd op chromosoomplaats 17q11.2. Van de start- tot het stopcodon is de lengte van het gen bp. Het gen is opgebouwd uit 60 exonen (figuur 2.6). 23

25 literatuurstudie Figuur 2.6 voorstelling van het NF1 gen De transcriptie startplaats is aangeduid door het pijltje. De asterix geeft de plaats weer van de mrna processing [32]. Meerdere NF1-gerelateerde sequenties komen voor als pseudogenen. Er wordt verondersteld dat de pseudogenen ontstaan uit een duplicatie en transpositie van het NF1 locus. Het NF1 gen codeert voor het proteïne neurofibromine. NF1 heeft één van de hoogste mutatiesnelheden in de menselijke genen. De helft van de NF1 patiënten zijn sporadisch, ze hebben geen familiale voorgeschiedenis voor NF1. Mutatie analyse is niet eenvoudig vanwege de grootte van het gen en het voorkomen van pseudogenen. Bovendien komen alle types van mutaties voor, verspreid over het volledige NF1 gen [25,35,41]. 2.3 Mutaties Inleiding Mutaties zijn veranderingen die voorkomen in het erfelijk materiaal. Zij zorgen er voor dat er variatie in fenotype bestaat, waarop de natuur kan selecteren. Polymorfismen zijn genetische varianten die niet geassocieerd zijn met een fenotype. Ze zijn neutraal of onschadelijk [40]. Variaties die betrekking hebben op één nucleotide worden single nucleotide polymorfismen of SNP s genoemd (figuur 2.7)[13]. 24

26 literatuurstudie Figuur 2.7 SNP: single nucleotide polymorphism [14] Veel mutaties hebben geen of weinig invloed bij overerving omdat ze enkel voorkomen in de lichaamscellen, de zogenaamde somatische mutaties. Deze mutaties zijn niet erfelijk. Kiembaanmutaties die voorkomen in de geslachtscellen kunnen wel erfelijk zijn en zijn daarom van belang in erfelijke aandoeningen en evolutionaire processen. Kanker kan ontstaan door een opeenhoping van mutaties in genen met regulerende functies. Er ontstaat een ongeremde celdeling, waarbij de kans op nieuwe mutaties groter wordt. Daardoor kunnen kankercellen meer agressieve eigenschappen krijgen [30] Puntmutaties Puntmutaties zijn kleinschalige mutaties die een verandering met zich meebrengen op genniveau. Ze veroorzaken een verandering in de basensamenstelling van het DNA. Substituties, deleties en inserties zijn puntmutaties die kunnen leiden tot een nonsense mutatie, missense mutatie, frameshift mutatie, splice-site mutatie, silent mutatie, [30]. Men vermoedt dat puntmutaties veroorzaakt worden door de achtergrondstraling waaraan ieder organisme is blootgesteld [29] Nonsense mutatie Een nonsense mutatie is een basenpaarsubstitutie die optreedt in het coderend deel van het gen. Bij een nonsense mutatie is het nieuw gevormde codon, door de mutatie, een stopcodon. Dit stopcodon zorgt voor een vroegtijdig stoppen van het translatieproces en bijgevolg voor de vorming van een foutief eiwit (zie figuur 2.8) [44]. 25

27 literatuurstudie Figuur 2.8 nonsense mutatie [44] Missense mutatie Een missense mutatie resulteert in de substitutie van één aminozuur in een ander aminozuur op die plaats, wat kan leiden tot het slecht functioneren van het eiwit (figuur 2.9)[44]. Figuur 2.9 missense mutatie [44] Inserties en deleties Een insertie/deletie verandert het aantal DNA basen in een gen door een stuk DNA toe te voegen/te verwijderen (figuur 2.10). Het stuk DNA kan uit één of meerdere basen bestaan. Vanaf die plaats kan een frameshift mutatie ontstaan wanneer er geen veelvoud van drie nucleotiden geïnsereerd/gedeleteerd wordt. Een frameshift mutatie verandert het reading frame van een gen. Een reading frame bestaat uit drie gegroepeerde basen die coderen voor een aminozuur. Een frameshift mutatie verschuift de groepering van deze 26

28 literatuurstudie basen waardoor de code voor de aminozuren verandert. Het proteïne gecodeerd door het gen zal niet of minder goed functioneren [44]. Figuur 2.10 links: insertie rechts: deletie [44] Silent mutatie/substitutie Een silent mutatie veranderd de DNA-sequentie, maar heeft geen schijnbaar effect op het fenotype of de functie (figuur 2.11) [36]. Figuur 2.11 links: wild-type rechts: silent mutatie 27

29 literatuurstudie Op plaats 43 worden de A en T gewijzigd in een C en G. Deze baseverandering heeft geen effect op het aminozuur dat gevormd wordt. Het gevormde aminozuur blijft threonine. Daarom wordt dit een silent mutatie genoemd, vanwege de ondetecteerbare verandering op eiwitniveau. [6] Splice-site mutatie Voordat het mrna de kern verlaat, worden de intronen verwijderd en komen de exonen tegen elkaar te liggen. Dit wordt splicing genoemd. Splicing wordt gecontroleerd door specifieke intronsequenties, de splice-acceptor en splice-donor sequenties. Deze sequenties komen voor aan de uiteinden van de coderende regios (exonen), in de noncoding regios (intronen) (figuur 2.12). Mutaties in deze sequenties kunnen leiden tot de retentie van grote segmenten intronisch DNA of tot de verwijdering van hele exonen uit het mrna. Deze veranderingen kunnen intense effecten hebben op het resulterende proteïne [38]. Splice-site mutations Figuur 2.12 splice-site mutaties [38] Duplicatie/grote deleties Een duplicatie is een stuk DNA dat één of meerdere keren gekopieerd wordt. De verdubbeling gebeurt bij de replicatie. Het kan het resultaat zijn van ongelijke overkruising door verkeerde paring en uitwisseling van DNA tussen niet-homologe chromosoomsequenties (figuur 2.13 links). Grote deleties overspannen verschillende exonen van een gen, een volledig gen of zelfs verschillende buurgenen [44]. 28

30 literatuurstudie Figuur 2.13 links: niet-homologe crossing-over [18] rechts: duplicatie [44] Mutatiedetectietechnieken Denaturerende gradiënt gel elektroforese (DGGE) Het principe van DGGE is de scheiding van een PCR amplicon volgens denaturerende elektroforese. Er wordt gebruik gemaakt van een poly-acrylamide gel die een denaturerende stof bevat (vaak ureum en formamide). De PCR wordt uitgevoerd met specifieke, universele primers op de constante regio s. Één van de primers bevat een lange keten van G s en C s na elkaar (GC-klem). De GC-klem zorgt ervoor dat er geen volledige denaturatie kan plaatsvinden. De GC-staart is heel stabiel in het denaturant, door de onderlinge binding van beide basen met drie waterstofbruggen. Wanneer dsdna migreert in de denaturerende gradiënt zal op een bepaald punt het dsdna enkelstrengig worden. De GC-klem houdt de twee strengen bij elkaar, er ontstaat een vorkstructuur die vastloopt in de matrix van de gel door de toenemende weerstand (figuur 2.14). Door toevoegen van een kleurstof (zoals ethidiumbromide) worden de fragmenten zichtbaar gemaakt in de gel na UV belichting. 29

31 literatuurstudie Figuur 2.14 DGGE proces [5] De herhaalde denaturatie en re-annealing van de DNA-strengen tijdens de PCR leidt tot de vorming van twee homoduplexe DNA-fragmenten en twee heteroduplexe DNAfragmenten. De thermostabiliteit van de heteroduplexen daalt bij de aanwezigheid van een base mismatch. De detectie van de DNA-fragmenten, de homozygoten, de varianten en de heterozygoten, is mogelijk op DGGE. De drie duplexen zijn goed van elkaar te onderscheiden. 30

32 literatuurstudie DGGE is één van de meest gevoelige mutatiedetectietechnieken. De gevoeligheid gaat net niet tot 100%. DGGE werd gebruikt voor screening van onder andere BRCA1/BRCA2 [5,43] DNA-sequenering DNA-sequenering is het bepalen van de basenvolgorde van een DNA-fragment. Er zijn verschillende methoden, maar de meest gebruikte is de methode van Sanger. De methode is gebaseerd op enzymatische aanmaak van één van de DNA-ketens waarvan de basenvolgorde bepaald moet worden. De methode maakt gebruik van een kort gelabelde primer, DNA-polymerase, vier verschillende nucleotidebouwstenen (datp, dttp, dctp en dgtp) en vier dideoxynucleotiden (ddatp, ddttp, ddctp en ddgtp). De primer hecht zich aan het 3 uiteinde en wordt verlengd. De bouwstenen worden door het DNA-polymerase in de keten ingebouwd volgens complementariteit aan de onbekende streng. Wordt er een dideoxynucleotide ingebouwd, dan wordt de aanmaak van de streng gestopt. Op deze manier ontstaan gelabelde fragmenten met een verschillende lengte. Manueel worden de reactieproducten naast elkaar in een gel op lengte gescheiden en zichtbaar gemaakt. De basenvolgorde van de complementaire streng kan afgelezen worden. De kleinste fragmenten lopen het verst op de gel en vormen het 5 -uiteinde van de complementaire streng en het 3 -uiteinde van het onbekende DNA-fragment (figuur 2.15). 31

33 literatuurstudie Figuur 2.15 DNA-sequenering volgens de methode van Sanger [39] De methode van Sanger leent zich goed voor automatisatie. De polymerasereacties verlopen identiek als bij de manuele methode, uitgezonderd dat de vier dideoxynucleotiden elk gelabeld zijn met een andere fluorescerende molecule. Ze vertonen een verschillende kleur nadat ze met behulp van licht geëxciteerd worden. Alle reacties worden in één reactiemengsel uitgevoerd. De fragmenten worden gescheiden volgens grootte. De banden zijn gekleurd volgens de laatst toegevoegde ddntp (figuur 2.16). Aan de hand van de emissie van de golflengte en de migratietijd wordt de DNAsequentie bepaald [8]. DNA-sequencing heeft het voordeel dat met deze techniek gemakkelijk puntmutaties kunnen nagegaan worden. De volledige basenvolgorde van een exon/gen wordt bepaald. Het enige nadeel van de methode is de hoge kostprijs. Figuur 2.16 resultaat automatische DNA-sequencing [10] 32

34 literatuurstudie 2.4 High resolution melting curve analysis (HRMCA) High resolution melting curve analysis of HRMCA is een mutatiedetectietechniek gebruikt voor de detectie van sequentievariaties gebaseerd op heteroduplexe vorming [4]. De detectie gebeurt met behulp van de kleurstof LCGreen Plus. Screening van heterozygote SNP s in producten tot 1000 bp heeft een gevoeligheid van 97% en een specificiteit van 99% [20,22]. Om een sensitiviteit van 100% te verkrijgen wordt aanbevolen om korte fragmenten (± 300 bp) te gebruiken LCGreen Plus LCGreen Plus is een dsdna-bindende, fluorescerende kleurstof. De kleurstof maakt homogene mutatiescanning en genotypering mogelijk, gebaseerd op de unieke eigenschap om heteroduplexen te detecteren tijdens smeltanalyse [4]. De kleurstof kan in de pre-pcr of post-pcr procedure worden toegevoegd. LCGreen Plus kleurstoffen zijn stabiel en hebben geen effect op het PCR-proces. De optimale excitatie en emissie van LCGreen Plus ligt respectievelijk bij nm en nm. Wanneer LCGreen Plus kleurstoffen toegevoegd worden aan het PCR product verhoogt dat de annealing temperatuur met 1-3 C. Als het dsdna gebonden met LCGreen Plus, in verzadigde vorm, denaturatie ondergaat komt de LCGreen Plus vrij. Doordat LCGreen Plus over de volledige lengte van het dsdna geïntercaleerd is, ontstaan er geen openingen. Indien er openingen gevormd worden, zoals bij het vroeger veel gebruikte SYBR Green, zou de kleurstof bij denaturatie verspringen naar een opening in plaats van vrij te komen in het milieu (figuur 2.17) [45]. Dankzij de verzadigende eigenschap kunnen heteroduplexen worden gedetecteerd (figuur 2.18)[4]. Aan de hand van de hoeveelheid vrijgekomen fluorescentie, gemeten op een HRMCA toestel, kan een smeltcurve gegenereerd worden [21]. 33

35 literatuurstudie Figuur 2.17 links: SYBR Green gebonden op het dsdna rechts: LCGreen Plus verzadigd en geïntercaleerd in het dsdna Bij denaturatie komt LCGreen Plus vrij, waardoor de fluorescentie daalt. SYBR Green verplaatst zich naar een naburig gelegen vrije plaats op het dsdna [45] Figuur 2.18 verschil tussen SYBR Green en LCGreen Plus. SYBR Green detecteerd de heteroduplex in de heterozygote mutatie niet in tegenstelling tot LCGreen Plus. F508del regio is bij cystic fibrosis een voorbeeld van een heterozygote mutatie.[45] Mutatiedetectie met HRMCA Het principe van HRMCA steunt op de thermostabiliteit van een PCR product. Bij de PCR reactie wordt LCGreen Plus toegevoegd dat zich intercaleert in het dsdna. De PCR amplicons worden dan onderworpen aan een stijgende temperatuur. HRMCA wordt toegepast op de daarvoor voorziene toestellen zoals de LightScanner (Idaho technology Inc), Gene Rotor (Corbett Lifescience), LightCycler (Roche). Eerst wordt de temperatuurrange bepaald waarin de fluorescentie van het amplicon zal gemeten moeten worden. Eenmaal dit gebeurd is, kan de meting gestart worden. De 34

36 literatuurstudie temperatuur stijgt met C/s [20]. Naarmate de temperatuur stijgt, zal het dsdna denatureren en uiteindelijk resulteren in twee enkele strengen DNA. LCGreen Plus komt vrij naarmate de temperatuur stijgt en naarmate de twee strengen uit elkaar gaan. Bij 100% fluorescentie is het amplicon volledig dubbelstrengig. Bij 0% fluorescentie is het DNA enkelstrengig [24]. Wanneer een amplicon een sequentievariatie ( een mismatch ) draagt, zullen de strengen op een lagere temperatuur uit elkaar gaan dan het homozygoot perfect gepaarde DNA. Voor elk amplicon wordt op deze manier een smeltcurve gegenereerd (figuur 2.19). Figuur 2.19 genormaliseerde smeltcurve [20] In de smeltcurve wordt de fluorescentie uitgezet ten opzichte van de temperatuur. Na de meting worden de curves genormaliseerd. Na de normalisatie kan men de homozygote duplexen, mutanten en wild types, en heterozygote duplexen goed van elkaar onderscheiden (figuur 2.20). 35

37 literatuurstudie Figuur 2.20 HRMCA analyse: difference plot. De verschillende genotypes worden van elkaar onderscheiden [17] Genotypering met ongelabelde probes Genotypering met ongelabelde probes is een andere toepassing van HRMCA. De techniek is simpel, snel en kan de meeste SNP s genotyperen [22]. De methode vereist twee primers, een ongelabelde probe en een verzadigende kleurstof (LCGreen Plus). De PCR reactie verloopt asymmetrisch, één primer wordt in overmaat toegevoegd. Het principe van genotyperen wordt schematisch weergegeven in figuur

38 literatuurstudie Figuur 2.21 asymmetrische PCR met een ongelabelde probe [28] Men kan kiezen ten opzichte van welke streng de probe komt te liggen. Als men kiest om de probe tegenover de sense streng te leggen, dan moet de primer in overmaat zorgen voor een vergrote hoeveelheid kopies van de sense streng. De probe is complementair met deze streng en is zo ontworpen dat hij hybridiseert met de regio waar de sequentievariatie zich bevindt. Het is deze regio die gegenotypeerd moet worden. De probe kan complementair aan de wild type sequentie of aan de variante sequentie ontworpen worden. Indien de probe past met de sequentievariant dan zal de mutante duplex perfect passen en de hoogste smelttemperatuur (temperatuur waarbij het dsdna voor 50% gedenatureerd is) hebben. Heterozygote stalen hebben dan één mismatch, terwijl de wild type sequentie met twee mismatches de grootste destabilisatie van de probe tot gevolg heeft [4,20]. Er kunnen twee soorten duplexen gevormd worden: 37

39 literatuurstudie heterozygote en homozygote duplexen. De homozygote duplexen zijn afkomstig van de variant of van het wild type. Na de asymmetrische PCR wordt een overmaat probeamplicon duplexen gevormd en een kleinere hoeveelheid amplicon duplexen [46]. Beide duplexen geven verschillende smeltcurven die samen in één beeld kunnen bekeken en geanalyseerd worden. Na PCR is er één afgeleide grafiek te zien met twee pieken. Één piek van de probe-amplicon duplex en één piek van het amplicon duplex (figuur 2.21). De piekhoogte van het probe-target signaal is afhankelijk van de concentratie van de probe, de complementaire streng en de lengte van het PCR product [23]. Probes met een lengte rond de 30 bp produceren het beste signaal. De smelttemperatuur van de probe moet onder de 70 C blijven zodat het niet interfereert met de polymerase extensie. Het 3 -einde van de probe wordt geblokkeerd om zijn verlenging tijdens PCR te voorkomen. De blokkage wordt gevormd met een 3 C3-blok, 3 -fosforylatie,...[20]. 38

40 Materialen en methoden 3 Materialen en methoden De basistechniek in de genetica is PCR, ook het CMGG is opgesplitst in een pre- en post- PCR gedeelte. Pre-PCR gebeuren de voorbereidingen voor de PCR reactie zelf. In post- PCR gebeuren alle analyses na de PCR reactie. In elk gedeelte moet gewerkt worden met labojas en handschoenen. Elke vorm van contaminatie moet vermeden worden. 3.1 Polymerase chain reaction Principe PCR De polymerase chain reaction of polymerase kettingreactie (PCR) laat de vermeerdering toe van een specifieke DNA-sequentie uit een zeer kleine hoeveelheid DNA. Een PCR bestaat uit drie stappen (figuur 3.1) die elk bij een welbepaalde temperatuur en gedurende een welbepaalde tijd worden uitgevoerd. Als eerste stap (95 C) vindt men de denaturatie of het smelten van het DNA tot twee enkelstrengen. De tweede stap (50-65 C) bestaat uit het doen annealen of binden van de twee primers of startsequenties aan de DNA-sequentie die men wil kopiëren. Deze primers worden in de elongatiestap verlengd door de inbouw van de DNA-bouwstenen met behulp van DNA-polymerase [9,11]. 39

41 Materialen en methoden Figuur 3.1 PCR reactie [42] Asymmetrische PCR Een asymmetrische PCR is een PCR waarbij één primer in overmaat wordt gebruikt (zie paragraaf literatuurstudie). De primer in overmaat schrijft vele kopijen over van de streng die hybridiseert met de probesequentie. Er ontstaan veel probe-amplicon duplexen en weinig amplicon duplexen. Deze PCR wordt gebruikt voor het genotyperen van frequente BRCA1/2 SNP s met behulp van ongelabelde probes Gradiënt PCR Een gradiënt PCR is identiek aan een normale symmetrische PCR, maar in de gebruikte toestellen kan een temperatuursgradiënt aangelegd worden zodat verschillende annealing temperaturen tegelijkertijd kunnen getest worden. De gradiënt PCR wordt gebruikt voor de optimalisatie van mutatiescanning voor het NF1 gen Materiaal HPLC water Producten (bewaren bij 4 C) 10x Buffer Invitrogen 50 mm MgCl 2 Invitrogen 1mM dntp 40

42 Materialen en methoden Platinum Taq DNA polymerase 10x LCGreen Plus Probes (tabel 3.1) Primers (tabel 3.2) Tabel 3.1 probes BRCA1/2 Invitrogen Idaho Technology Inc Fragment Polymorfisme Probe SEQUENTIE BRCA1 8 BRCA1 IVS7-34C>T CTGGCCAATAATTGCTTGACTG BRCA1 c c>t BRCA en 11.9 BRCA1 2201C>T (S694S) CTGGGAAAGTATCACTGTCATGTC en BRCA1 2196G>A (D693N) BRCA BRCA1 3667A>G (K1183R) CGTCCAGAGAGGAGAGCTTAG BRCA BRCA2 7470A>G (S2414S) CTGTTCAACTCTGTGAAAATGCGATTTAGTT Tabel 3.2 primers BRCA1/2 BRCA1 Aantal bp primer sequentie (5' - 3') Nucleotide positie) TA ( C) 240 8F M13-GTCAAGTTTCTCTTCAGGAG (562-75) 50 8R M13-CTATAAGATAAGGAATCCAGC ( ) F M13-GGA AGT CTT CTA CCA GGC R M13-GTTAACTTCAGCTCTGGGAAA F M13-GGTAAAGAACCTGCAACTGGAG R M13-GCAAAACCCTTTCTCCACTTAAC F M13-CCATATCTGATTTCAGATAACTTA R M13-GATAAGTTCTCTTCTGAGGACTC BRCA2 Aantal bp primer sequentie (5' - 3') Nucleotide positie TA ( C) F M13-GGAAAAATCTTCAAGCAATTTAGC R M13-GCTTTTGTCTGTTTTCCTCCAA Epjes 1,7 ml epjes (Sorenson, BioScience Inc) lot: ,7 ml epjes (Sorenson, BioScience Inc) lot: ,2 ml epjes Thermo-tube (Thermo Scientific) lot: 9LNN2 Tips 0,5-10 µl ART 10REACH pipet tips (Molecular BioProducts) µl ART 10REACH pipet tips (Molecular BioProducts) µl ART 10REACH pipet tips (Molecular BioProducts) ART: aerosol resistant tips Pipetten 0,1-2 Labmate+ 0,5-10 Labmate+ 41

43 Materialen en methoden Labmate Labmate+ Rekjes (Nalgene ) Vortex VWR mini vortexer VWR Lab dancer S40 Centrifuge 5415D (Eppendorf) Folie 96-wellplaat PCR film AB-0558 (ABgene) Lot: wellplaat AB gene PCR plates, Thermo-Fast 96 (Thermo-Scientific) Handschoenen SC value (Maxxim medical Europe) Microtube 2 ml (Sarstedt) Lot: Bewaardoos producten (Sarstedt) Methode PCR voorbereiding Er wordt eerst een mastermix gemaakt per fragment. Het enige product dat niet aan de mastermix wordt toegevoegd is DNA. Wanneer de mastermix niet gelijk is aan het totaal volume wordt deze aangevuld met H 2 O. Platinum Taq polymerase wordt als laatste product toegevoegd. Bij elke nieuwe pipetteerstap wordt een nieuwe tip gebruikt om contaminatie te vermijden. Vanuit de mastermix wordt een hoeveelheid mix (totaal volume DNA volume) gepipetteerd in de voorziene aantal epjes/welletjes. Per well/epje wordt dan de gewenste hoeveelheid DNA (concentratie 25 ng/µl) toegevoegd. De stalen worden gevortexed en gecentrifugeerd vooraleer ze in het PCR toestel geplaatst worden. Een overzicht van de verschillende mastermixen wordt weergegeven in de tabellen 3.3, 3.4 en

44 Materialen en methoden Asymmetrische PCR voor het genotyperen van SNP s in BRCA1/2 met ongelabelde probes Tabel 3.3 mastermix asymmetrische PCR met een totaal volume van 15 µl Product Concentratie Volume (µl) Invitrogen 10x buffer 10x 1.5 MgCl 2 50 mm 0.7 dntp 1 mm 6 LCGreen Plus 10x 1.5 Primer in overmaat 10 µm 0.15 Primer niet in overmaat 10 µm 0.03 Probe 10 µm 0.12 Taq DNA polymerase 5 U/µL 0.18 HPLC H 2 O 2.82 DNA 25 ng/µl 2 Gradiënt PCR voor mutatiescanning van het NF1 gen Voor de gradiënt PCR worden per exon vier negatieve stalen gebruikt. Het exon wordt getest op twaalf verschillende temperaturen. Er wordt gewerkt met een totaal volume van 25 µl en 100 ng DNA per PCR reactie. Tabel 3.4 mastermix gradiënt PCR met een totaal volume van 25 µl Product Concentratie Hoeveelheid (µl) HPLC H 2 O dntp 1 mm 5 Invitrogen buffer 10x 2.5 MgCl 2 50 mm 1.15 LCGreen Plus 10x 1 Platinum Taq polymerase 5 U/µL 0.16 Primer (forward en reverse) 0.1 DNA 25 ng/µl 4 43

45 Materialen en methoden PCR met heteroduplex stap voor mutatiescanning van het NF1 gen Tabel 3.5 mastermix PCR met heteroduplex stap met een totaal volume van 25 µl Product Concentratie Hoeveelheid (µl) H 2 O dntp 1 mm 5 Invitrogen buffer 10x 2.5 MgCl 2 50 mm 1.15 LCGreen Plus 10x 1 Platinum Taq polymerase 5 U/µL 0.16 Primers (forward en reverse) 0.1 DNA 25 ng/µl PCR uitvoering De stalen worden na de PCR voorbereiding in het PCR toestel geplaatst en het gewenste programma wordt gekozen. Voor op run gedrukt wordt, moet de lower en higher temperature aangepast worden via edit. Ga daarna naar run, kies of er met tubes of een plate gewerkt wordt. Het toestel zal vragen of het heated lid gebruikt moet worden of niet. Kies altijd voor yes. Het programma zal daarna automatisch starten. Wacht tot het PCR toestel program complete weergeeft. Haal de stalen eruit en bewaar ze op een koele en donkere plaats. Een overzicht van de gebruikte PCR programma s wordt weergegeven in de tabellen 3.6, 3.7 en

46 Materialen en methoden Asymmetrische PCR voor het genotyperen van SNP s in BRCA1/2 met ongelabelde probes Het basisprogramma dat gebruikt wordt is PROBE en wordt stap voor stap weergegeven in tabel 3.6. Per annealing temperatuur verschilt het programma van naam. Is de Ta 55 C, dan wordt als programma PROBE_55/PROBE55 gebruikt. Tabel 3.6 basisprogramma (PROBE) asymmetrische PCR Stap Temperatuur Tijd 1 95 C C 30 3 Annealing temperature C 30 5 Go to stap 2 for 50 times 6 95 C C 30 8 END Gradiënt PCR voor mutatiescanning van het NF1 gen Tabel 3.7 PCR programma NF1_grad Stap Temperatuur Tijd 1 94 C C 20 3 Lower temperature to higher temperature C 40 5 Go to stap 2 for 37 times 6 72 C C C C END 45

47 Materialen en methoden PCR met heteroduplex stap voor mutatiescanning van het NF1 gen Tabel 3.8 PCR programma NF1_HD Stap Temperatuur Tijd 1 94 C C 20 3 Annealing temperature C 40 5 Go to stap 2 for 37 times 6 72 C C C C END 3.2 Agarosegelelektroforese Principe Agarosegelelektroforese is een techniek die stukjes DNA van elkaar scheidt op basis van hun lengte, steunend op de elektrische lading van het DNA en de eigenschappen van de agarosegel. Het negatief geladen DNA migreert in de richting van de positieve pool. Grotere DNA-fragmenten zullen moeilijker door de gel bewegen dan kleinere DNAfragmenten. Hierdoor kunnen de verschillende DNA-fragmenten van elkaar onderscheiden worden. In de gel wordt een bandenpatroon zichtbaar door de toevoeging van ethidiumbromide. Er wordt ladingsbuffer bij het PCR product gevoegd. Deze kleurstof bevat sucrose, waardoor het DNA in de slotjes zakt en niet zomaar ronddwarrelt (figuur 3.2). 46

48 Materialen en methoden Figuur 3.2 principe gelelektroforese Materiaal Post-PCR Microplate 96 (Greiner Bio-one) Ladingsbuffer Pipet 0,5 10µL (Labmate+) Multichannel 0,5-10 (Finnpipette ) Agarose (Invitrogen ) Weegvlootje Balans (Navigator ) 47

49 Materialen en methoden Ethidiumbromidelokaal 10x TBE buffer (Invitrogen ) Microgolfoven Handschoenen Kleenguard (Kimberley-Clark professional) Ethidiumbromide Elektroforesebak (BioRad) Spanningsbron Power-Pac basic (BioRad) Folie Gedemineraliseerd water Methode Gieten van de gel Drie gram agarose (voor 1,5% gel) wordt afgewogen in een vlootje. Los de agarose op in 250 ml 1X TBE-buffer. Zet dit in de microgolfoven gedurende 2 30 tot het mengsel kookt, laat niet overkoken. Koel de oplossing af en voeg vijf druppels ethidiumbromide (10 mg/30 ml) toe. Meng goed. Plaats de kammetjes op de gewenste plaats. Giet de gel en laat stollen (±30 ). Haal daarna voorzichtig de kammetjes uit de gel Voorbereiden van de stalen en het laden van de gel Meng 1 µl ladingbuffer met 5 µl PCR product. Laad 5 µl in de slotjes van de gel. Laat de gel lopen op 145 V gedurende minuten. Nadat het DNA door de gel gelopen is wordt deze op een UV-plaat gelegd en wordt een foto genomen. De foto kan worden bewerkt en afgedrukt met het programma Microsoft Photo editor. 3.3 LightScanner De LightScanner (figuur 3.3) is een toestel ontworpen door de firma Idaho technology Inc. Het toestel wordt gebruikt voor High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA) voor mutatiedetectie en genotypering in 96 of 384 wellplaten. 48

50 Materialen en methoden Figuur 3.3 LightScanner (Idaho technology Inc) [45] Voorbereiding mutatiedetectie en genotypering met behulp van ongelabelde probes op de LightScanner De voorbereiding voor mutatiedetectie en genotypering met behulp van ongelabelde probes op de LightScanner gebeurt in het post-pcr gedeelte van het labo. De analyse van beide methoden op de LightScanner vereist specifieke platen met niet-doorzichtige welletjes (96 wellplaten). Na PCR en voor het overbrengen van de stalen in de plaat worden de stalen gecentrifugeerd. Er wordt 10 µl PCR-oplossing in de nieuwe plaat gepipetteerd. Boven de oplossing komt ongeveer 22 µl minerale olie. De plaat wordt daarna gecentrifugeerd gedurende 10 op 3000 rpm (programma 7). Na centrifugatie kan de plaat gelopen en geanalyseerd worden op de LightScanner. 49

51 Materialen en methoden Loopprogramma LightScanner De analyse gebeurt met de bijhorende Software, Call-IT. Vanuit het beginscherm (figuur 3.4) wordt gekozen voor de knop Run. Figuur 3.4 software Call-IT beginscherm In het beginscherm worden de temperaturen waartussen de run moet gebeuren, aangepast. Voor mutatiedetectie is dit van 70 C tot en met 98 C, voor genotypering met ongelabelde probes loopt de run van 45 C tot 98 C. De hold temperature wordt steeds 5 C lager gezet dan de laagste temperatuur (figuur 3.5). 50

52 Materialen en methoden Figuur 3.5 start run scherm Eens de temperaturen aangepast zijn, laat men de temperatuur van de LightScanner tot hold temperature komen (klik op Go to Hold Temp ). Voer de plaat in met de afgeknotte hoek gericht naar linksboven. Het luikje van de LightScanner sluit automatisch. Druk daarna op Start run. Geef een naam op waaronder de data moet worden opgeslagen. De run start automatisch, nadat het toestel de fluorescentie van de wells heeft gemeten (figuur 3.6). De plaat wordt uit de LightScanner genomen na het beëindigen van de run. 51

53 Materialen en methoden Figuur 3.6 plate image fluorescentiemeting van de wells Op deze figuur is de controle te zien van de ingevoerde plaat. De wells die blauw blijven, zijn blanco stalen. De gekleurde wells bevatten DNA en de verzadigende kleurstof LCGreen Plus Analyse Voorbereidend werk analyse Voor de analyse van mutatiedetectie wordt de knop scanning aangeklikt, voor de analyse van genotypering met ongelabelde probes wordt de knop unlabeled probe aangeklikt. De analyse kan starten. De eerste stap is het maken van subsets. Klik op New Subset en markeer de vakjes die in de subset moeten voorkomen. Benoem de subset als volgt: gen_exon_specificiteit. Een voorbeeld: BRCA1_exon11.8_58 C. Druk daarna op Add marked to subset. De subset is gemaakt en benoemd. De subsets verduidelijken op welk fragment een PCR gebeurd is. In dit voorbeeld is er een PCR gebeurd voor het fragment 11.8 van het gen BRCA1 op 58 C (figuur 3.7). Volg dit principe voor alle subsets. 52

54 Materialen en methoden Figuur 3.7 aanmaken van een subset Klik eerst op New Subset. Duid de vakjes aan die je in de subset wilt. Geef de subset een naam in het vakje Edit Subset Name. Klik daarna op Add Marked to Subset. Alle vakjes geven de wells weer van een 96 wellplaat. De witte vakjes zijn aangemaakte subsets. De reeks met blauwe vakjes is een gemarkeerde subset. 53