Chapter 10. Nederlandse samenvatting

Transcriptie

1 Nederlandse samenvatting

2 Hereditair Nonpolyposis Colorectaal Carcinoom, afgekort als (HNPCC), ook wel Lynch syndroom genoemd, is een autosomaal dominante erfelijke aandoening met een hoge penetrantie (80-85%), waarbij patiënten een verhoogd risico hebben op het ontstaan van verschillende vormen van kanker. HNPCC is één van de meest voorkomende erfelijke kankersyndromen. In typische HNPCC-families zijn individuen uit meerdere generaties aangedaan met colorectaal carcinoom (CRC; kanker van de dikke darm en/of endeldarm) op jonge leeftijd of met andere vormen van kanker, zoals endometriumcarcinoom (EC; baarmoederkanker) en ovariumcarcinoom (eierstokkanker). HNPCC wordt veroorzaakt door kiembaanmutaties in de DNA mismatch repair (MMR) genen (eerste hit), gevolgd door somatische inactivatie van het wild-type (normale) allel (tweede hit). Wanneer beide allelen van een MMR-gen geïnactiveerd zijn, verliest het MMR-systeem dat genomische stabiliteit tijdens de DNA-replicatie garandeert het vermogen om DNA-replicatiefouten (mismatches) te repareren. Hierdoor accumuleren mutaties door het gehele genoom. Microsatellietsequenties, oftewel repeterende sequenties, ook wel short tandem repeats genoemd, zijn in het bijzonder kwetsbaar voor replicatiefouten, en daardoor resulteert MMR-deficiëntie (ook) in microsatellietinstabiliteit (MSI). Spontane mutaties treden niet alleen op in niet-coderende sequenties, maar ook in genen die essentieel zijn voor stabiliteit van het genoom. Door mutaties in dergelijke genen kunnen aangedane cellen ongecontroleerd gaan delen en kan er een kankergezwel ontstaan. Mutaties in de MMR-genen MLH1, MSH2 en MSH6 veroorzaken de aandoening in een groot deel (42-75%) van de families die op klinische gronden met HNPCC zijn gediagnosticeerd. Omdat mutaties in de MMR-genen de ontwikkeling van kanker bij HNPCC-patiënten initiëren, zou het misschien beter zijn HNPCC niet door klinische criteria te definiëren maar door genetische criteria. In dit proefschrift, zoals geïntroduceerd in hoofdstuk 1, worden verschillende onderwerpen betreffende HNPCC behandeld. Eén van de vragen die we wilden beantwoorden was: welke patiënten moeten gescreend worden voor mutaties in de MMR-genen? In andere woorden, hoe zouden HNPCC verdachte patiënten geselecteerd moeten worden voor mutatieanalyse? Identificatie van MMR-genmutatiedragers is belangrijk, omdat zij in aanmerking komen voor periodieke controles om tumoren op te sporen in de vroegst mogelijke stadia. Het is aangetoond dat periodieke colonoscopie het risico op CRC reduceert en de mortaliteit verlaagt. Echter, mutatieanalyse is kostbaar en arbeidsintensief en hierdoor is het niet haalbaar om aan alle patiënten met CRC en EC mutatieanalyse in de MMR-genen aan te bieden. Om deze reden is er behoefte aan sensitieve en specifieke criteria om patiënten te selecteren voor 134

3 Nederlandse samenvatting mutatieanalyse. Zowel klinische als niet-klinische criteria kunnen gebruikt worden voor deze selectie. In hoofdstuk 2 worden verschillende strategieën besproken om HNPCC verdachte patiënten te selecteren voor mutatieanalyse, onder meer aan de hand van sensitiviteit, specificiteit en predictieve waarden van deze methoden voor de aanwezigheid van een pathogene MLH1, MSH2 of MSH6 mutatie. Criteria om het pathogene karakter van een mutatie (ziekteverwekkend of niet?) vast te stellen worden bediscussieerd, als wel de verschillen in opzet van functionele testen om pathogeniteit van mutaties te bepalen. In hoofdstuk 3 worden 281 HNPCC verdachte patiënten beschreven die of CRC hadden voor de leeftijd van 50 jaar of twee of meer HNPCC-geassocieerde tumoren. Deze patiënten werden gescreend op kiembaanmutaties in MLH1, MSH2 en MSH6 en hun tumoren werden onderzocht op MSI en aankleuring van de MMR-eiwitten (immunohistochemisch onderzoek; IHC). In totaal werden 25 pathogene kiembaanmutaties in de drie genoemde genen gevonden. Vervolgens werden in deze groep de voorspellende waarden van familieanamnese, MSIanalyse en IHC voor de aanwezigheid van een MMR-genmutatie berekend. De prevalentie van pathogene mutaties was 6% in de groep van patiënten gediagnosticeerd met CRC voor de leeftijd van 50 jaar en 22% in de groep van patiënten met twee of meer HNPCCgeassocieerde tumoren. De sensitiviteit van familie anamnese, MSI-analyse en IHC voor de aanwezigheid van een mutatie was respectievelijk 76%, 82% en 88%, de specificiteit was 64%, 70%, en 84% en de positieve voorspellende waarde was 19%, 23% en 38%. De MSIanalyse miste drie mutatiedragers en de IHC miste twee andere mutatiedragers. In de groep van patiënten met multipele HNPCC-geassocieerde tumoren werden geen mutaties gevonden bij de 29 patiënten bij wie de eerste tumor boven de leeftijd van 60 jaar was vastgesteld. Geconcludeerd werd dat preselectie door IHC en/of MSI-analyse voorafgaand aan mutatieanalyse gerechtvaardigd is voor patiënten met CRC voor de leeftijd van 50 jaar en voor patiënten met twee of meer HNPCC-geassocieerde tumoren. In hoofdstuk 4 onderzochten we het mogelijke gebruik van de aanwezigheid van de BRAF- Val600Glu mutatie in tumoren als selectiemiddel voor mutatieanalyse in de MMR-genen. Dit deden we omdat recent was aangetoond dat de oncogene activatie van BRAF door de Val600Glu mutatie karakteristiek is voor sporadische colontumoren met MSI. Eerder was al aangetoond dat somatische BRAF mutaties niet aanwezig zijn in tumoren van HNPCCfamilies met kiembaanmutaties in de MMR-genen MLH1 en MSH2. Echter, er waren geen gegevens beschikbaar voor MSH6 mutatiedragers. Om deze reden hebben wij exon 15 van BRAF gescreend in 38 tumoren van HNPCC-patiënten, die of een kiembaanmutatie hadden in MSH6, of bij wie eerder geen MMR-genmutatie gevonden was. In 37 tumoren werd geen 135

4 Val600Glu mutatie aangetoond, één tumor van een MSH6 mutatiedrager met meerdere tumoren had wel deze mutatie. Dit was zeer waarschijnlijk veroorzaakt door het feit dat in deze tumor de MLH1 promotor gemethyleerd was. Deze gegevens, in combinatie met de bevindingen aangaande BRAF mutaties in MLH1 en MSH2 mutatiedragers, suggereren een mogelijk nut van de BRAF-Val600Glu mutatie als een exclusiecriterium voor mutatieanalyse in de MMR-genen of als een moleculaire marker van sporadische carcinomen. Een andere vraag die we in dit proefschrift hebben getracht te beantwoorden is, of mutaties in andere genen, of combinaties van mutaties in verschillende genen, kunnen leiden tot een HNPCC-fenotype. Zoals hierboven reeds genoemd, zijn mutaties in MLH1, MSH2 en MSH6 verantwoordelijk voor 42 75% van de families die klinisch gediagnosticeerd zijn met HNPCC. Mutaties in andere genen zouden een gedeelte van de gevallen waarin geen mutatie gevonden werd, kunnen verklaren. Onlangs werd gesuggereerd dat mutaties in een ander MMR-gen, PMS2, een veel belangrijker rol spelen in HNPCC dan aanvankelijk gedacht werd. Om dit verder uit te zoeken, hebben we de prevalentie van pathogene PMS2 mutaties bepaald in 73 HNPCC verdachte patiënten, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Deze patiënten hadden een CRC of EC met MSI of waren afkomstig uit een Amsterdam Criteria II positieve familie. Eerder waren deze patiënten gescreend op mutaties in MLH1, MSH2 en MSH6 waarbij geen mutatie gevonden was. Onder de 73 patiënten werden drie patiënten met een pathogene PMS2 mutatie geïdentificeerd (4,1%). De IHC was informatief in één patiënt en hierbij liet de tumor verlies van PMS2 kleuring zien. Eén van de tumoren van de andere twee mutatiedragers vertoonde een negatieve MLH1 kleuring. Onze resultaten bevestigen de bevindingen van eerdere studies dat mutaties in PMS2 vaker HNPCC veroorzaken dan aanvankelijk verondersteld werd. Wij stellen voor dat immunohistochemische kleuring voor PMS2 en mutatieanalyse in PMS2 worden toegevoegd aan de screeningsprotocollen die op dit moment gebruikt worden om patiënten met MMR-genmutaties te identificeren. De meeste HNPCC studies tot nu toe hebben HNPCC, zoals hierboven gedefinieerd, beschouwd als een duidelijke Mendeliaanse ziekte, waarbij één mutatie de oorzaak is van het syndroom, dat autosomaal dominant overerft met incomplete penetrantie. Niet-mendeliaanse overerving, in het bijzonder in de groep waarop we ons gericht hebben, kan echter niet uitgesloten worden. Wij kunnen niet uitsluiten dat bepaalde mutaties op zichzelf onschadelijk zijn, maar ziekteverwekkend in combinatie met mutaties in andere genen. Anders gezegd, combinaties van laag penetrante mutaties zouden een fenotype kunnen veroorzaken dat lijkt op HNPCC. In hoofdstuk 6 hebben we de hypothese onderzocht dat de combinatie van een 136

5 Nederlandse samenvatting mono-allelische MUTYH mutatie met een MMR-genmutatie het risico op kanker verhoogt. Het MUTYH eiwit is betrokken bij reparatie van oxidatieve DNA-schade. Dit eiwit heeft een interactie met het MMR-eiwit MSH6 dat onderdeel is van de MSH2/MSH6 heterodimeer ( ). Het is aangetoond dat DNA-binding en glycosylaseactiviteiten van MUTYH stimuleert. Om onze hypothese te testen, hebben we de prevalentie van monoallelische MUTYH mutaties in dragers van een kiembaan MMR-genmutatie onderzocht: 40 dragers van een truncerende mutatie (groep I) en 36 dragers van een missense mutatie (groep II). Al deze patiënten waren gediagnosticeerd met CRC of EC. We vergeleken de MUTYH mutatiefrequenties in deze groepen met de frequentie geobserveerd in een groep van 134 Nederlandse patiënten met CRC en/of EC zonder een MMR-genmutatie (0,7%) en met de frequentie die gerapporteerd is voor controle personen (1,5%). In groep I werd één monoallelische MUTYH mutatie gevonden (2,5%), terwijl in groep II vijf monoallelische MUTYH mutaties (14%) werden aangetoond. Vier van die vijf werden gevonden bij MSH6 missense-mutatiedragers (20%). Van alle patiënten met een MMR-genmutatie, vertoonden alleen die met een missense mutatie een significant hogere frequentie aan (monoallelische) MUTYH mutaties in vergelijking met de Nederlandse kankerpatiënten zonder MMRgenmutatie (p = 0,002) en de gepubliceerde controles (p = 0,001). Onze resultaten suggereren dat de aanwezigheid van een monoallelische MUTYH mutatie gecombineerd met een missense MMR-genmutatie, in het bijzonder van MSH6, leidt tot een verhoogd risico op kanker. Naast mutaties in andere genen, of combinaties van mutaties in genen, kunnen epigenetische gebeurtenissen de oorzaak zijn van een kleine proportie van de HNPCC-gevallen. Recent werden acht patiënten gerapporteerd met gegeneraliseerde (kiembaan) hypermethylatie van de MLH1 promotor. In hoofdstuk 7 onderzochten wij de prevalentie van MLH1 promotorhypermethylatie in lymfocyten van 40 HNPCC verdachte patiënten die bij eerder onderzoek geen mutatie in MLH1, MSH2 of MSH6 bleken te hebben. Vijfentwintig van deze patiënten hadden een tumor waarbij IHC verlies van MLH1 had laten zien, en 15 patiënten hadden een tumor met MSI waarbij (nog) geen IHC verricht was. In één patiënt ontdekten we hypermethylatie van de MLH1 promotor in lymfocyten. Analyse van DNA uit huidfibroblasten, een mondspoeling en tumormateriaal van dezelfde patiënt toonde ook MLH1 promotorhypermethylatie aan. De familieanamnese voor HNPCC-geassocieerde tumoren was negatief. De tumor vertoonde MSI, verlies van MLH1 kleuring en verlies van heterozygositeit. Verder DNA-onderzoek bij de moeder, de broers en zusters, en in een tumor van de overleden vader liet geen MLH1 promotorhypermethylatie zien. In de tumor van de 137

6 indexpatiënt werd een mutatie in codon 12 van KRAS en methylatie van twee tumor suppressorgenen (RARB en PTEN) gevonden, suggererende dat de tumoren een gelijksoortig ontwikkelingspatroon hadden als sporadische tumoren met een CpG island methylator phenotype (CIMP). Onze data tonen aan dat kiembaan MLH1 promotorhypermethylatie de oorzaak is van kankerontwikkeling bij een klein percentage van HNPCC verdachte patiënten. Om deze reden moet in patiënten met MLH1 promotorhypermethylatie in de tumor en een klinische verdenking van HNPCC, methylatieanalyse in lymfocyten worden overwogen. In hoofdstuk 8 worden de onderwerpen zoals in dit proefschrift beschreven bediscussieerd en wordt een strategie gepresenteerd voor de selectie van HNPCC verdachte patiënten voor mutatieanalyse. In deze strategie zijn het al dan niet aanwezig zijn van de BRAF-Val600Glu mutatie in de tumor, MSI-analyse en IHC de meest belangrijke selectiemiddelen. Deze strategie houdt er rekening mee dat een deel van de missense mutaties (mutaties die een aminozuurverandering tot gevolg hebben) pathogeen zou kunnen zijn, wanneer zij getest worden in functionele testen. Het ontwerp van zulke testen is één van de grote uitdagingen in toekomstig HNPCC-onderzoek. Wanneer deze testen beschikbaar worden voor routinematig diagnostisch onderzoek, zal dat een enorme impact hebben op de klinische aanpak bij HNPCC-families. Meer patiënten (en hun familieleden) die risico lopen op het ontwikkelen van HNPCC-geassocieerde tumoren zullen geïdentificeerd worden en onder controle gaan om kanker te voorkomen en/of om het in een zo vroeg mogelijk stadium te ontdekken. Functionele testen hebben niet alleen invloed op de klinische aanpak bij HNPCC verdachte patiënten, maar zullen zeer waarschijnlijk ook onze kennis verbreden op het gebied van genotype-fenotype correlaties. Daarnaast zouden ze gebruikt kunnen worden om te onderzoeken of combinaties van MMR-genmutaties, die gevonden werden bij HNPCC verdachte patiënten, de MMR-capaciteit ernstiger aantasten dan de afzonderlijke mutaties. Andere uitdagingen bij toekomstig HNPCC-onderzoek liggen in de identificatie van kandidaatgenen, het achterhalen welke combinaties van mutaties in verschillende genen een HNPCC-fenotype kunnen veroorzaken en het verder optimaliseren van strategieën om patiënten met andere HNPCC-geassocieerde tumoren dan CRC te selecteren voor mutatiedetectie. 138