Voor akkoord verklaring

Transcriptie

1 Voor akkoord verklaring Dit eindwerk is een examen; eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna worden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de stagebegeleider, vermeld op de titelbladzijde. Martine De Bleeckere Stagementor Kathleen Claes Stagegever Stefanie Salliau Promotor

2 Woord vooraf Met dit eindwerk sluit ik mijn drie jaar durende studies biomedische laboratoriumtechnologie af. Ik heb ervan genoten dankzij mijn prima docenten van de Hogeschool West-Vlaanderen, departement Simon Stevin en mijn toffe medestudenten. In eerste instantie gaat mijn dank uit naar mijn stagebegeleidster, mevr. Stefanie Salliau, een nieuwkomer op het departement, maar niettemin een prachthulp die me bijstond met raad en daad bij het schrijven van dit eindwerk. Het onderzoek heb ik mogen behandelen in het Centrum voor Medische Genetica van het Universitair Ziekenhuis te Gent. Ik wens dan ook mijn stagegever mevr. Kathleen Claes te bedanken, niet alleen voor het aanreiken van het boeiend onderwerp, maar vooral omdat zij ondanks haar drukke werkschema nog tijd vrijmaakte om me te begeleiden doorheen dit eindwerk. Ook mijn dank aan mevr. Martine De Bleeckere, omdat ze me wegwijs maakte en me bijstond in het labo. Tenslotte dank ik mijn ouders voor hun steun en interesse en voor het helpen terugvinden van mijn enthousiasme op de momenten dat ik die even kwijt was.

3 Samenvatting In de westerse wereld is colonkanker één van de meest voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker. Colonkankers kunnen sporadisch, familiaal of erfelijk voorkomen. In België sterven momenteel jaarlijks meer dan mensen aan deze ziekte. In de toekomst hoopt men via preventief onderzoek een daling van het aantal sterfgevallen door colonkanker te bewerkstelligen. Identificatie van patiënten met een verhoogd risico op colonkanker zorgt ervoor dat deze groep een intensievere klinische follow-up krijgt en in een vroeger stadium kan behandeld worden. Op de afdeling moleculaire genetica van het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG) wordt onderzoek gedaan naar de erfelijke colonkankersyndromen: familiale adenomateuze polyposis (FAP) en hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). In het CMGG wordt momenteel voor HNPCC microsatellietinstabiliteiten-onderzoek en mutatieonderzoek aangeboden van de drie meest frequent gemuteerde genen (MLH1, MSH2 en MSH6). Informatie omtrent de methylatiestatus van de MLH1 promotor maakt het mogelijk om een beter onderscheid te maken tussen sporadische en HNPCC-geassocieerde colontumoren. Daarom wil het CMGG een protocol optimaliseren voor de bepaling van de methylatiestatus van MLH1 in colontumoren, ingebed in paraffine. In het kader van dit eindwerk werden twee methoden hiervoor uitgetest: de methylatie-specifieke PCR en de methyqesd, een combinatie van methylatie-gevoelige digestie en real-time PCR. De optimalisatie van het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren start bij een goede methode voor DNA-isolatie van tumormateriaal ingebed in paraffine. Dit is een belangrijke stap om het aantal niet-interpreteerbare analyses te beperken, gezien de kwaliteit van de ontvangen paraffineblokken wisselend is. De methylatie-specifieke PCR bleek al snel een veel robuustere methode, met een hoge specificiteit en sensitiviteit, dan de methyqesd. Bijgevolg werd geopteerd om hiermee verder te werken. Na DNA-extractie volgt een bisulfietbehandeling, waardoor ongemethyleerde cytosine basen omgezet worden in thymine basen en gemethyleerde cytosine basen ongewijzigd blijven. Voor de methylatie-specifieke PCR worden primers gebruikt, waarvan de ligging zo gekozen is dat ze zich bevinden in de proximale regio in de promotor van het MLH1 gen. Het is aangetoond dat methylatie van de CpG-eilanden in deze regio geassocieerd is met verlies van expressie van het MLH1 gen.

4 Op fragmentanalyse kan de methylatie van de CpG-eilanden worden gedetecteerd. Een piek bij 186 bp wijst erop dat er geen methylatie is, terwijl een piek bij 183 bp wel methylatie aanduidt. Het gebruik van 100% gemethyleerd controle DNA is van cruciaal belang tijdens het experiment. Het DNA dient als positieve controle om na te gaan of de bisulfietconversie volledig is doorgegaan. In totaal werd voor dit onderzoek DNA geïsoleerd uit tumormateriaal en ingebed in paraffine onderzocht van 35 patiënten. Selectie van de patiënten gebeurde op basis van een MSI-high fenotype en/of immunohistochemisch defect gedetecteerd in de tumor voor MLH1, MSH2, MSH6 of PMS2. Van deze patiënten werd eveneens DNA geïsoleerd uit bloed geanalyseerd. Er werd bij geen enkele van de onderzochte patiënten methylatie teruggevonden in het DNA geëxtraheerd uit bloed, wat betekent dat er geen germinale epimutaties aanwezig zijn. Voor vier patiënten (11.4%) werden geen interpreteerbare resultaten bekomen op DNA geïsoleerd uit paraffinemateriaal. Dit percentage is in de lijn van de verwachtingen en stemt overeen met andere analyses die gebeuren in het CMGG op DNA geïsoleerd uit paraffinemateriaal. In 32% van de onderzochte colontumoren werd hypermethylatie van de MLH1 promotor vastgesteld. Het percentage methylatie verschilt, gaande van 5% methylatie tot 60% methylatie. De laagste percentages methylatie werden vastgesteld in tumoren van twee patiënten met een germinale MLH1 mutatie. In de overige patiënten lag het methylatie percentage hoger, wat er op wijst dat dit zeer waarschijnlijk sporadische tumoren zijn. Dit betekent dat zij niet geassocieerd zijn met een germinale mutatie en bijgevolg niet erfelijk zijn. In 68% van het onderzochte tumormateriaal werd geen DNA-methylatie waargenomen. In deze patiënten is dus nog geen oorzaak gevonden voor het MSI-high fenotype en/of immunohistochemisch defect in de colontumor. Wegens de positieve resultaten van dit onderzoek zal in de toekomst in het CMGG de methylatiespecifieke PCR toegepast worden in de diagnostiek om een onderscheid te maken tussen erfelijke en sporadische vormen van colonkanker. Voor patiënten met een hoog percentage hypermethylatie van de MLH1 promotor, is een grondig mutatie-onderzoek van de mismatch herstelgenen geassocieerd met HNPCC weinig zinvol.

5 Lijst met afkortingen en symbolen A AFAP AP APC gen Bp Adenine Attenuated FAP Antarctic phosphatase Adenomateuze polyposis coli gen Base pair

6 C CMGG CpG CRC CT-waarde DNA DNMT dntp EDTA Exo I FAM FAP G GSU HNPCC HRMCA IBD IHC MethyQESD MLH1 gen MLPA MMR genen MS MSH2 gen MSH3 gen MSH6 gen MSI MSI-H MSI-L MSP MSS MUTYH gen NaOAc Cytosine Centrum voor Medische Genetica Gent Cytosinefosfaatguanine Colorectaal carcinoom Threshold cycle-waarde Desoxyribonucleïnezuur DNA-methyltransferase Deoxyribonucleotide trifosfaat Ethyleendiaminetetra-azijnzuur Exonuclease I Carboxyfluoresceïne Familiale adenomateuze polyposis Guanine Genetic Service Unit Hereditair, non-polyposis, colorectaal carcinoom High resolution melting curve analyse Inflammatory bowel disease Immunohistochemie Methylation-quantification of endonuclease-resistant DNA MutL homoloog 1 gen Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Mismatch repair genen Microsatellite MutS homoloog 2 gen MutS homoloog 3 gen MutS homoloog 6 gen Microsatellite instability Microsatellite instability High Microsatellite instability Low Methylation specific PCR Microsatellite stable MutY homoloog gen Natriumacetaat

7 OD PCR PMS2 gen Q-PCR RER RNA RR-mix SAM SDS SSR T TACSTD 1 gen Taq TBE TE TSG U UV V Optische densitiet Polymerase chain reaction Postmeiotic segregation increased 2 gen Quantitatieve PCR Replication errors Ribonucleïnezuur Ready reaction-mix S-adenosylmethionine Sodiumdodecylsulfaat Simple sequence repeats Thymine Tumor-associated calcium signal transducer 1 gen Thermus aquaticus Tris boraat EDTA Tris EDTA Tumorsuppressorgen Uracil Ultraviolet Volt

8 Verklarende woordenlijst Adenocarcinoom Klierkanker Adenoom Goedaardig klierweefsel gezwel Carcinoom Kanker, kwaadaardig gezwel van epitheliaal weefsel Colectomie Gehele of gedeeltelijke excisie van het colon Colitis ulcerosa Met koorts en zweervoming gepaard gaande ontsteking van het colon waarbij etter en vaak ook bloed wordt afgescheiden Colorectaal carcinoom Carcinoom van het colon en/of rectum (endeldarm) CpG-eilanden DNA-regio s die relatief veel CpG s in hun sequentie bevatten Cytogenetica Onderdeel van de erfelijkheidsleer met betrekking tot structuur (speciaal van de chromosomen) en functie van de cel De novo mutatie Aanleg voor een erfelijke aandoening was niet aanwezig bij de ouders, maar wordt wel bij het kind gevonden Deaminatie Onttrekken van een aminogroep (NH 2 ) Deletie Afwezigheid van de erfelijke informatie voor één of meerdere aminozuren DNA-mismatch repair Herstelmechanisme om onvermijdelijke fouten (mismatches) bijvoorbeeld bij de replicatie van DNA, te kunnen herstellen, waardoor uiteindelijk het aantal fouten wordt beperkt DNA-replicatie Verdubbeling van DNA tijdens de celdeling Duodenumkanker Kanker van de twaalfvingerige darm Dysplasie Misvorming, abnormale vorming en groei van weefsel Endometriumkanker Kanker van het baarmoederslijmvlies Endonuclease Enzym dat een nucleïnezuur molecuul kan splitsen waardoor fragmenten ontstaan Epigenetica Studie van omkeerbare erfelijke veranderingen in de genfunctie die optreden zonder wijzigingen in de sequentie (volgorde van de basenparen) van het DNA in de celkern Exon Een coderend stukje DNA Frameshift Mutatie met verschuiving van genetisch leesraam Gain-of-function mutatie Leidt tot een verhoogde activiteit of een totaal nieuwe functie van het genproduct

9 Genomic imprinting Germinale mutatie Histon-modificatie Housekeeping genen Hypertrofie Immunohistochemie Inflammatoir bowel disease Insertie Kanker Kiembaan mutatie Loss-of-function mutatie Maligne Medullablastoom Melanoom Microsatelliet Mosaïcisme Mutatie Oncogenen Proces waardoor een bepaald allel van een gen alleen tot expressie komt, wanneer het van één specifieke ouder (de vader of de moeder) afkomstig is Mutatie in de geslachtscellen, wordt doorgegeven aan het nageslacht Wijziging van histonen, specifieke eiwitten die samen met het DNA in de celkern het chromatine vormen Genen betrokken in de basisfuncties, nodig voor het onderhoud van de cel Sterke ontwikkeling van weefsels of organen (zonder toename van het aantal cellen) Het aantonen van antigenen in cellen en weefsels door middel van specifieke antistoffen Verzamelnaam voor darmziekten, gekenmerkt door chronische ontstekingsprocessen waarvan de oorzaak niet geheel duidelijk is, hiertoe behoren de ziekte van Crohn en colitis ulcerosa Invoegen van een stukje DNA in het reeds aanwezige DNA Kwaadaardige gezwelvorming, neoplasma Mutatie in de geslachtscellen, wordt doorgegeven aan het nageslacht Leidt tot een vermindering of volledig verlies van activiteit van het eiwit Kwaadaardig Maligne gezwel in het cerebellum (kleine hersenen) Gezwel uit melanocyten (pigmentcellen) in moedervlekken Korte, repeterende DNA-sequentie die in het gehele genoom kan gevonden worden Het voorkomen van genetische verschillende cellen in aan elkaar grenzend weefsel ten gevolge van onvolkomenheden in de kerndelingen Plotselinge blijvende en overerfbare verandering in het genetisch materiaal en dus in de erfelijke informatie Genen, betrokken bij het ontstaan van tumoren

10 Oppervlaktespanning Ovariumkanker Penetrantie Poliep Promotor Puntmutatie Retina Sigmoïdoscopie Somatische mutatie Tumorsuppressorgenen X-chromosoom inactivatie Ziekte van Crohn Verschijnsel dat het oppervlak van een vloeistof aan een vloeistofgas overgang zich gedraagt als een veerkrachtige laag Kanker van de eierstokken De mate van manifest worden van een erfelijke eigenschap Gesteeld goedaardig gezwel, komt voornamelijk voor in de neus, darm en blaas DNA, gelegen voor een gen, dat de werking van het gen reguleert. Het wordt niet afgelezen bij de transcriptie Mutagene vervanging van een aminozuur in een molecuul door een afwijkend ander aminozuur Netvlies van het oog Inwendig onderzoek van het sigmoïd, het laatste S-vormig deel van het colon Mutatie in de lichaamscellen, wordt niet doorgegeven aan het nageslacht Genen, betrokken bij het ontstaan van tumoren, remmen de groei of activeren apoptose (geprogrammeerde celdood) Inactivatie van één van beide X-chromosomen in vrouwelijke cellen Chronische ontsteking van een deel van de dunne darm en/of het colon met zweervorming, waardoor onder andere sterk functieverlies van het resorberend darmoppervlak kan ontstaan Lijst van tabellen en figuren Lijst van figuren Figuur 1 Een lijst met de meest voorkomende kankers in België volgens de Stichting Kankerregister Figuur 2 Leeftijd specifieke incidentie van colonkanker volgens het geslacht... 21

11 Figuur 3 Van adenoom tot carcinoom Figuur 4 De 'two hit'-hypothese van Knudson Figuur 5 Percentage sporadische colonkanker, IBD ( Inflammatory bowel disease ), FAP (familiale adenomateuze polyposis), HNPCC (hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom) en FH (positieve familie geschiedenis) Figuur 6 Autosomaal dominant overervingspatroon Figuur 7 Het colon met adenomateuze poliepen Figuur 8 Het APC gen Figuur 9 MLH1 gen Figuur 10 Strategie bij de diagnose van HNPCC Figuur 11 Detectie van microsatellietinstabiliteiten Figuur 12 Een immunohistochemische kleuring van een MSI-H patiënt Figuur 13 Principe van HRMCA Figuur 14 Principe van MLPA Figuur 15 Het mechanisme van DNA-methylatie Figuur 16 Het proces van DNA-isolatie Figuur 17 De Nanodrop Figuur 18 Laden van het DNA-staal Figuur 19 Het staal wordt samengedrukt en vormt als het ware een kolom Figuur 20 DNA-sequencing resultaten na bisulfietbehandeling Figuur 21 De drie stappen tijdens PCR: denaturatie, annealing en extensie Figuur 22 Het principe van methylatie specifieke PCR Figuur 23 Overzicht van het fragment uit de MLH1 promotor regio dat wordt geamplificeerd Figuur 24 Het principe van agarosegelelektroforese Figuur 25 De MultiNA Figuur 26 Fluorescent gelabelde DNA-fragmenten bewegen door het capillair Figuur 27 Detectie van de fluorescent gelabelde DNA-fragmenten Figuur 28 Figuur A toont geen methylatie, figuur B vertoont 50 % methylatie. 100% methylatie wordt getoond in figuur C Figuur 29 Principe van MethyQESD Figuur 30 DNA, dat na behandeling met CpG-methyltransferase wordt geprecipiteerd voor bisulfietconversie Figuur 31 DNA dat niet wordt neergeslaan voor bisulfietconversie... 70

12 Figuur 32 Figuur A toont fragmentanalyse na behandeling met EZ DNA Methylation-Direct Kit. Figuren B en C tonen fragmentanalyse van dezelfde patiënt na behandeling met EZ DNA Methylation Kit na respectievelijk 16u en 3u incubatie bij 50 C Figuur 33 Een regio van de MLH1 promotor Figuur 34 PCR-amplificatie gebruik makend van primers P344/P345 gevisualiseerd met de MultiNA Figuur 35 PCR-amplificatie gevisualiseerd met de MultiNA Figuur 36 PCR-amplificatie met primers P344/P345 op commercieel aangekocht gemethyleerd controle DNA na bisulfietconversie. DNA-sequenties na opzuivering via ethanol precipitatie Figuur 37 PCR-amplificatie met primers P344/P345 op commercieel aangekocht gemethyleerd controle DNA na bisulfietconversie. DNA-sequenties na opzuivering met beads Figuur 38 Uit paraffine geëxtraheerd DNA vertoont op fragmentanalyse een piek bij 186 bp Figuur 39 Sequentie van uit paraffine geïsoleerd DNA waarin geen van de CpG eilanden gemethyleerd is. Alle cytosine basen zijn omgezet naar thymines, ook in de CG-nucleotiden Figuur 40 DNA geëxtraheerd uit paraffine vertoont op fragmentanalyse een piek bij 183 bp en 186 bp Figuur 41 Sequentie van DNA geïsoleerd uit paraffine Figuur 42 DNA geëxtraheerd uit paraffine vertoont op fragmentanalyse een piek bij 183 bp Figuur 43 Sequentie van uit paraffine geïsoleerd DNA Figuur 44 Donkergrijs=staal30bloed geknipt met DraI en XbaI; wit=commercieel gemethyleerd DNA geknipt met Hin6I; Grijs=staal30paraffine geknipt met Hin6I; Lichtgrijs=staal30bloed geknipt met Hin6I Lijst van tabellen Tabel 1 Een lijst met de verschillende genen die kunnen betrokken zijn bij kanker 21 Tabel 2 Klinische criteria voor hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom 29 Tabel 3 Aan ten minste één van deze Bethesda criteria moet worden voldaan 30 Tabel 4 Criteria voor MSI-H, MSI-L en MSS 31 Tabel 5 Patiëntenmateriaal 38 Tabel 6 Een lijst met de primersets 49 Tabel 7 Een lijst met de primersets 60 Tabel 8 DNA-concentraties, OD 260/280 en OD 260/ Tabel 9 DNA-concentraties van vijf stalen na opzuivering met beads 71 Tabel 10 DNA-concentraties van vijf stalen na verdubbeling producten 71 Tabel 11 Verschil tussen EZ DNA Methylation Kit en EZ DNA Methylation-Direct Kit 71

13 Tabel 12 Standaard PCR-mix met een totaal reactievolume van 20 µl 73 Tabel 13 PCR-mix met een totaal volume van 20 µl 73 Tabel 14 Patiëntenmateriaal en percentage methylatie 80 Tabel 15 Lijst met de uitgevallen DNA-stalen 83 Tabel 16 Lijst met patiënten voor MLPA 86

14 Inhoudsopgave Voor akkoord verklaring... 1 Woord vooraf... 2 Samenvatting... 3 Lijst met afkortingen en symbolen... 5 Verklarende woordenlijst... 8 Lijst van tabellen en figuren Inhoudsopgave Inleiding, situatieschets en probleemstelling Situering Inleiding en doelstelling Literatuurstudie Inleiding tot kanker Algemene inleiding tot colonkanker Colonkanker in cijfers Risicofactoren Erfelijke en sporadische colonkanker Colonkanker syndromen: familiale adenomateuze polyposis en hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Familiale adenomateuze polyposis Situering Pathologische karakteristieken Genetische achtergrond Moleculaire diagnostiek Hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Situering Pathologische karakteristieken Genetische achtergrond... 28

15 2.4.4 Moleculaire diagnostiek De Amsterdam en Bethesda criteria Microsatellietinstabiliteiten-onderzoek Immunohistochemisch-onderzoek Mutatie-onderzoek Methylatie Epigenetica Methylatie van DNA DNA-methylatie en tumorvorming Detectie van DNA-methylatie Materialen en methoden Onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor Patiëntenmateriaal DNA-isolatie en DNA-concentratie bepaling Principe DNA-isolatie Materiaal Werkwijze DNA-concentratie bepaling Bisulfietconversie Principe Materiaal Werkwijze Polymeraseketting reactie Principe Materiaal Werkwijze Agarosegelelektroforese Principe... 50

16 Materiaal Werkwijze MultiNA Principe Materiaal Werkwijze Fragmentanalyse Principe Materiaal Werkwijze Sequeneren Principe Materiaal Werkwijze MethyQESD Principe Materiaal Werkwijze Gemethyleerd controle DNA Principe Materiaal Werkwijze MLPA Principe Materiaal Werkwijze Resultaten en bespreking... 67

17 4.1 Optimalisatie van het onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren DNA-isolatie Zoektocht naar kwaliteitsvol gemethyleerd controle DNA Aanmaak van gemethyleerd controle DNA Optimalisatie van de methylatie-specifieke PCR Optimalisatie bisulfietconversie Optimalisatie van de PCR-reactie Correlatie tussen resultaten bekomen met fragmentanalyse en sequenering Overzicht resultaten op patiëntenmateriaal Germinale epimutaties Robuustheid van de test Frequentie van MLH1 hypermethylatie in het onderzochte patiëntenmateriaal MethyQESD Patiëntenmateriaal Resultaten MLPA Patiëntenmateriaal Resultaten Discussie Conclusie Literatuurlijst Bijlagen 96 Bijlage 1 De volledige sequentie van de MLH1 regio met aanduiding van de in het onderzoek gebruikte primers... 96

18 Inleiding, situatieschets en probleemstel l ing 1 Inleiding, situatieschets en probleemstelling 1.1 Situering Het Centrum voor Medische Genetica Gent (CMGG), onder leiding van Professor Dr. A. De Paepe, is een afdeling van het Universitair Ziekenhuis Gent. Het vertegenwoordigt één van de acht genetische centra in België (waarvan vier in Vlaanderen) waar erfelijkheidsonderzoek wordt uitgevoerd. Het CMGG heeft drie grote taken: dienstverlening: het verrichten van genetische testen en inrichten van poliklinische consultaties voor personen met vragen rond erfelijkheid; wetenschappelijk onderzoek: voornamelijk rond verschillende kankers, oogafwijkingen, groeistoornissen, mentale retardatie; onderwijs. Het CMGG heeft twee verschillende laboratoriumafdelingen: de afdeling cytogenetica, waar zowel het klassiek cytogenetisch onderzoek als het moleculair cytogenetisch onderzoek worden uitgevoerd, in diagnostisch en onderzoeksverband; de afdeling moleculaire genetica, die verder ingedeeld is in het bindweefsel labo, die instaat voor de moleculaire diagnostiek en onderzoek naar erfelijke bindweefsel-, cardiovasculaire- en skeletale aandoeningen en het DNA-labo, waar de moleculaire diagnostiek van erfelijke aandoeningen verzorgd wordt en onderzoek gevoerd wordt naar onder andere erfelijke oogaandoeningen en familiale kankersyndromen. 1.2 Inleiding en doelstelling Eén van de meest voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker in de westerse wereld is colonkanker. Momenteel sterven hieraan jaarlijks meer dan mensen in België alleen al. Colonkankers kunnen sporadisch, familiaal of erfelijk voorkomen. Door preventief onderzoek zou men de patiënten met een verhoogd risico op colonkanker kunnen identificeren, monitoren en zodoende snel behandelen, om zo het aantal sterfgevallen te verminderen. Op de afdeling moleculaire genetica wordt onderzoek gedaan naar de erfelijke colonkankersyndromen: familiale adenomateuze polyposis (FAP) en hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). In dit eindwerk 18

19 Inleiding, situatieschets en probleemstel l ing worden deze twee syndromen dan ook uitvoerig besproken in het onderdeel literatuurstudie. Het onderzoek zelf betreft echter enkel HNPCC. In het CMGG wordt voor colonkanker microsatellietinstabiliteiten-onderzoek en mutatieonderzoek aangeboden. Het doel van dit eindwerk is de optimalisatie van onderzoek naar de methylatiestatus van de MLH1 promotor in colontumoren. Er worden twee methodes geselecteerd om uit te testen: de methylatie-specifieke PCR en methyqesd, een combinatie van methylatiegevoelige digestie en real-time PCR. 19

20 Literatuurstudie 2 Literatuurstudie 2.1 Inleiding tot kanker Kanker is samen met hart- en vaatziekten de belangrijkste doodsoorzaak in Europa (1). Jaarlijks worden er in België ongeveer mensen geconfronteerd met de diagnose kanker, waarvan mannen en vrouwen (2). In 2004 stierven Belgen ten gevolge van deze ziekte. Voornamelijk oudere personen worden getroffen door kanker: ongeveer tweederde van alle vrouwen en drie kwart van alle mannen, waarbij kanker werd geregistreerd, is 60 jaar of ouder op het ogenblik van de diagnose (3). Figuur 1 Een lijst met de meest voorkomende kankers in België volgens de Stichting Kankerregister. Prostaatkanker is de meest voorkomende kwaadaardige tumor bij mannen, gevolgd door longkanker en kanker van de dikke darm. Bij vrouwen is borstkanker de meest voorkomende kanker, gevolgd door colonkanker en longkanker (3). Kanker is een genetische afwijking die veroorzaakt wordt door mutaties in bepaalde genen die leiden tot een afwijkende celgroeiregulatie (4). De mutaties kunnen spontane mutaties zijn, bijvoorbeeld ontstaan tijdens de DNA-replicatie. Daarnaast kunnen ook geïnduceerde mutaties, door bijvoorbeeld UV-straling, chemische stoffen en radioactiviteit, aan de basis liggen voor het ontstaan van kanker. Daarnaast heeft vijf tot tien procent van alle kankers een duidelijk erfelijk karakter (5). Verschillende types van genen kunnen betrokken zijn bij het ontstaan van kanker, zoals de belangrijke oncogenen en tumorsuppressorgenen (tabel 1). Proto-oncogenen zijn betrokken bij het stimuleren van de normale celdeling. In tumoren zijn deze genen, nu oncogenen genoemd, echter op abnormale wijze geactiveerd door gain-of-function mutaties. Oncogenen zijn dominant, daar één mutant allel reeds voldoende is om het abnormale fenotype te veroorzaken. Tumorsuppressorgenen inhiberen de processen die kunnen leiden tot de ontwikkeling van kanker. In tumoren zijn deze genen op abnormale wijze geïnactiveerd door loss-of-function mutaties. Inactivering van beide 20

21 Literatuurstudie allelen van een tumorsuppressorgen is nodig om het gedrag van een cel te veranderen, op moleculair niveau zijn deze genen dus recessief (6). Tabel 1 Een lijst met de verschillende genen die kunnen betrokken zijn bij kanker (5) - Oncogenen - Tumorsuppressorgenen - DNA- mismatch herstelgenen - Genen die betrokken zijn bij het metabolisme - Genen die betrokken zijn bij de hormoonhuishouding 2.2 Algemene inleiding tot colonkanker Colonkanker in cijfers Colorectale kanker of colonkanker is in de westerse wereld één van de meest voorkomende, levensbedreigende vormen van kanker zowel bij vrouwen als bij mannen. In 2005 werd in België bij mannen en bij vrouwen de diagnose colorectale kanker vastgesteld. In 2004 stierven hieraan mensen. Het risico op het krijgen van colorectale kanker vóór de leeftijd van 75 jaar is vijf procent bij mannen en ongeveer drie procent bij vrouwen. De ziekte komt het vaakst voor rond de leeftijd van 70 jaar (2) (figuur 2). In de toekomst wordt een daling van overlijden door colorectale kanker verwacht, dit door meer preventief onderzoek, waardoor vroegtijdige diagnose mogelijk is met een betere prognose (7). Figuur 2 Leeftijd specifieke incidentie van colonkanker volgens het geslacht 21

22 Literatuurstudie Risicofactoren Meerdere factoren kunnen aan de basis liggen voor het ontstaan van colorectale kanker, enerzijds omgevingsfactoren, inclusief de rol van de individuele levensstijl (roken, voeding, weinig lichaamsbeweging), en anderzijds erfelijke risicofactoren (8). Een aantal aandoeningen zoals darmpoliepen (adenomen) en bepaalde chronische darmontstekingen (ziekte van Crohn en colitis ulcerosa) verhogen het risico op het ontstaan van een colorectaal carcinoom. Darmpoliepen zijn meestal goedaardig, maar kunnen uitgroeien tot een kwaadaardig gezwel (figuur 3). Mensen met colorectale kanker in de familie hebben eveneens een verhoogd risico (3). Figuur 3 Van adenoom tot carcinoom Erfelijke en sporadische colonkanker Bij een individu treedt erfelijke kanker reeds op jongere leeftijd op met een hogere kans op meerdere tumoren, dit vanwege de germinale mutatie. Vaak ontstaan ook in andere weefsels en organen kwaadaardige gezwellen. De sporadische vorm komt daarentegen over het algemeen pas op latere leeftijd tot uiting (5). Knudson formuleerde in 1971 de two-hit -hypothese voor tumorvorming (figuur 4). Deze stelde dat alle kankers in twee vormen voorkomen: erfelijk en sporadisch. Daarnaast beweerde Knudson dat er voor de ontwikkeling van een tumor twee mutaties ( hits ) nodig zijn. In het geval van erfelijke of familiale kanker heeft het individu reeds bij de geboorte één mutatie overgeërfd van vader of moeder, waardoor één allel van een tumorsuppressorgen werd geïnactiveerd. Dit noemt men een kiembaan of germinale mutatie. Slechts één bijkomende somatische mutatie is nodig voor de ontwikkeling van een tumor. Bij sporadische tumoren moeten er twee somatische mutaties (deleties of puntmutaties) optreden die leiden tot de inactivatie van beide allelen van een tumorsuppressorgen, vooraleer een tumor zich kan ontwikkelen (11). 22

23 Literatuurstudie Figuur 4 De 'two hit'-hypothese van Knudson. Figuur A toont sporadische kanker, hier zijn twee somatische mutaties in het TSG (tumorsuppressorgen) nodig voor het ontwikkelen van een tumor. Figuur B toont een erfelijk kankermodel, waarbij reeds één mutatie werd overgeërfd bij de geboorte. Een tweede somatische mutatie zorgt voor het ontstaan van een tumor (12). De meeste colorectale kankers zijn sporadische kankers. Vijftien tot twintig procent kent een familiaal voorkomen, terwijl ongeveer vijf procent erfelijk is (figuur 5)(9). Bij sporadische colonkanker heeft de patiënt geen andere familieleden met de ziekte. Bij familiaal voorkomen vertonen enkele familieleden van de patiënt een voorgeschiedenis van colonkanker. Bij patiënten met erfelijke colonkanker wordt een sterke familiale voorgeschiedenis van de ziekte waargenomen aan één zijde van de familie, waarbij veel familieleden zijn gestorven ten gevolge van deze ziekte (10). 23

24 Literatuurstudie Figuur 5 Percentage sporadische colonkanker, IBD ( Inflammatory bowel disease ), FAP (familiale adenomateuze polyposis), HNPCC (hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom) en FH (positieve familie geschiedenis) (9) Colonkanker syndromen: familiale adenomateuze polyposis en hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Twee belangrijke erfelijke vormen van colonkanker zijn gekend, familiale adenomateuze polyposis (FAP) en hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC). Deze twee syndromen worden in detail besproken in hoofdstukken 2.3 en 2.4. Bij de erfelijke colonkanker syndromen FAP en HNPCC kan een autosomaal dominante mutatie overgeërfd zijn van de vader of moeder. Alle cellen in het lichaam van dit individu zullen dan een normaal en een abnormaal gen bezitten. Het normale gen kan na verloop van tijd ook beschadigd geraken, waardoor kanker zich ontwikkelt. Anderzijds kan het zijn dat geen van beide ouders de mutatie in het gen draagt, maar dat het kind een nieuwe mutatie wel heeft gekregen op het moment van de bevruchting. Dit noemt men een de novo mutatie (13). Figuur 6 Autosomaal dominant overervingspatroon (14) 24

25 Literatuurstudie Het is belangrijk te begrijpen dat bij HNPCC, wanneer een mutant gen wordt overgeërfd, een verhoogd risico op colonkanker wordt doorgegeven. Niet alle mensen die een mutant gen overerven ontwikkelen colorectale kanker. FAP daarentegen is 100% penetrant. 2.3 Familiale adenomateuze polyposis Situering Familiale adenomateuze polyposis (FAP) is een eerder zeldzame autosomaal dominante aandoening waarbij talrijke adenomateuze poliepen ontstaan (4). De diagnose is duidelijk te stellen door de aanwezigheid van deze poliepen (15). FAP wordt veroorzaakt door een mutatie in het adenomateuze polyposis coli (APC) gen, die in punt besproken wordt (16). Het syndroom is verantwoordelijk voor één procent van alle colorectale kankers (9) Pathologische karakteristieken FAP wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van talrijke adenomateuze poliepen in de dikke darm en het rectum. De poliepen kunnen zich al op kinderleeftijd gaan ontwikkelen en op de leeftijd van 40 jaar zijn er vaak honderden poliepen aanwezig. De adenomen kunnen bloedverlies via de anus veroorzaken, maar blijven meestal jarenlang asymptomatisch. Rond de leeftijd van 45 jaar ontwikkelt één van deze poliepen zich meestal tot een invasief adenocarcinoom, een tumor die ontstaat uitgaande van het slijmvlies. Een adenocarcinoom kan enkel worden voorkomen door regelmatige screening door middel van sigmoïdoscopie en tijdige colectomie (15). Tevens neemt bij FAP het risico op de ontwikkeling van andere soorten kankers, zoals maag- en duodenumkanker, toe. Andere afwijkingen, geassocieerd met FAP, zijn hypertrofische pigmentafwijkingen in de retina en epidermoïdcysten in de huid (18). Figuur 7 Het colon met adenomateuze poliepen (19) 25

26 Literatuurstudie Naast de beschreven klassieke FAP bestaat er ook een mildere vorm, atypische of attenuated FAP (AFAP). Deze aandoening wordt gekenmerkt door een kleiner aantal adenomateuze poliepen. De poliepen en dus ook de kanker ontwikkelen zich over het algemeen op latere leeftijd dan bij de klassieke FAP (15) Genetische achtergrond Zowel FAP als AFAP worden veroorzaakt door een mutatie in het APC gen. Dit gen bevindt zich op de lange arm van chromosoom 5 (5q21-q22) (figuur 8). Het is een groot gen met 15 exonen (16). Het APC gen is een tumorsuppressorgen en werkt als een gatekeeper (19). Het genproduct speelt een belangrijke rol in verschillende cellulaire processen die bepalen of een cel zich ontwikkelt in een tumorcel. Figuur 8 Het APC gen (aangeduid met pijl) is gelegen op de lange arm van chromosoom 5 (20) Meer dan 700 mutaties, verspreid over het volledige genoom, werden reeds ontdekt in families met het klassieke FAP of AFAP-syndroom. De meeste van deze mutaties leiden tot het ontstaan van een abnormaal kort, niet functioneel APC proteïne. Dit korte proteïne kan de cellulaire overgroei, die leidt tot het maken van poliepen (die maligne kunnen worden), niet onderdrukken (20) Moleculaire diagnostiek Voor de diagnose van FAP wordt een stamboom opgemaakt die uitleg geeft over de aanwezigheid van colorectale poliepen en kanker in de familie. De meerderheid (ongeveer 60 procent) van de patiënten met FAP hebben het gemuteerd gen geërfd van één van de ouders. Ongeveer 30 procent van de patiënten hebben echter geen familiale voorgeschiedenis voor FAP. De oorzaak ligt dan meestal bij een de novo mutatie. Bijgevolg hebben de volgende generaties wel het risico het gemuteerd gen over te erven (21). Daarnaast valt ook een deel te verklaren door mosaïcisme en door mutaties in het MUTYH gen. Mutaties in het MUTYH gen veroorzaken autosomale recessieve familiale adenomateuze polyposis. Wanneer dit gen gemuteerd is kunnen cellen 26

27 Literatuurstudie fouten, die gemaakt worden tijdens de DNA-replicatie, niet meer verbeteren. Op deze manier kunnen darmpoliepen ontstaan, met eventueel colorectale kanker tot gevolg (17). Er wordt bij voorkeur een bloedstaal afgenomen bij een persoon met FAP. DNA wordt uit het bloed geëxtraheerd en vervolgens wordt mutatie-onderzoek van het APC gen opgestart. Bij ongeveer 80 procent van de mensen met de klinische diagnose van FAP wordt een APC mutatie geïdentificeerd. Eens de familiale mutatie geïdentificeerd is, kan presymptomatisch onderzoek bij familieleden worden opgestart. Bij de overige 20 procent wordt de abnormaliteit van het gen niet gedetecteerd met een bloedtest. Belangrijk om op te merken is dat genetische testen geen kanker of poliepen detecteren, ze geven enkel de informatie dat een persoon de genmutatie gekregen heeft (21). 2.4 Hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom Situering Hereditaire non-polyposis colorectaal carcinoom (HNPCC), ook wel het Lynch syndroom genoemd, is een relatief frequent voorkomende autosomaal dominante aandoening, die gekenmerkt wordt door de ontwikkeling van colon-, endometrium- en andere carcinomen op relatief jonge leeftijd (22). HNPCC komt vaker voor dan FAP. De diagnose verloopt echter moeilijker dan bij FAP, omdat er geen of slechts een beperkt aantal adenomateuze poliepen worden gevormd. HNPCC wordt veroorzaakt door een defect in één van de DNA- mismatch herstelgenen, zoals bijvoorbeeld MSH2, MLH1 en MSH6 (22). Mensen met HNPCC hebben 80 procent kans om colorectale kanker te ontwikkelen (23). Tweederde van deze kankers doen zich voor in het proximale deel van het colon (24). Vrouwen hebben bovendien 71 procent kans om endometriumkanker te ontwikkelen (23). HNPCC is verantwoordelijk voor vijf procent van alle colorectale kankers (9) Pathologische karakteristieken HNPCC gaat gepaard met het optreden van één of enkele adenomateuze colonpoliepen (minder dan vijf) die een grote kans hebben te ontaarden in een kwaadaardige tumor. De poliepen kunnen, net zoals bij FAP, bloedverlies via de anus veroorzaken (15). Vaak zijn er echter geen symptomen tot het carcinoom groot en zelfs al uitgezaaid is. Daarnaast is er ook een verhoogd risico op de ontwik- 27

28 Literatuurstudie keling van andere kankers zoals endometrium-, maag-, dunnedarm-, lever-, huid-, prostaat-, ovariumkanker, kanker in de hersenen en urinewegen (22) Genetische achtergrond HNPCC wordt veroorzaakt door een mutatie in één van de DNA- mismatch herstelgenen (MMR genen). MMR genen coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij het herstel van fouten, gemaakt gedurende de DNA-replicatie. Deze fouten kunnen deleties, inserties en foute incorporaties van basen zijn. De eiwitten vormen verschillende eiwitcomplexen die verantwoordelijk zijn voor de herkenning en het herstel van fouten (bijvoorbeeld een complex van het genproduct van MSH2 met het genproduct van MSH3 en MSH6). Als één eiwit in het complex niet goed functioneert of ontbreekt als gevolg van een mutatie in één van de genen, leidt dit tot de verstoring van het DNAherstel en een accumulatie van fouten in het DNA (22). De MMR genen zijn dus 'caretakers' die indirect tumorvorming kunnen promoten en HNPCC kunnen veroorzaken (4). Minstens vier MMR genen zijn reeds ontdekt die HNPCC kunnen veroorzaken. MLH1 bevindt zich op de korte arm van chromosoom 3 (3p21.3), MSH6 en MSH2 op korte arm van chromosoom 2 (2p21) en PMS2 op chromosoom 7 (7p22). Slechts bij 40 tot 60 procent van alle HNPCC-patiënten konden germinale mutaties worden aangetoond. MSH2 en MLH1 zijn verantwoordelijk voor de meerderheid (respectievelijk 40 en 50 procent) van deze mutaties in HNPCC-families, terwijl MSH6 verantwoordelijk is voor minder dan tien procent van de mutaties. Mutaties in het MSH6 gen zorgen meestal voor een atypische vorm van HNPCC, die gekenmerkt wordt door de aanwezigheid van endometriumkanker en de afwezigheid van colorectale kanker (16). Figuur 9 MLH1 gen is gelegen op chromosoom 3 (aangeduid met een pijl) (25) Moleculaire diagnostiek Bij de diagnose van HNPCC worden eerst de Amsterdam I/II criteria ( ) overlopen. Wanneer aan deze criteria voldaan is, wordt mutatie-onderzoek van de MMR genen uitgevoerd ter bevestiging van HNPCC. Wanneer niet voldaan is aan de Amsterdam I/II criteria worden de Bethesda 28

29 Literatuurstudie criteria ( ) overlopen. Wordt aan één van deze criteria voldaan, dan volgen immunohistochemisch-onderzoek (IHC) en microsatelliet-instabiliteiten-onderzoek (MSI). Zijn de MSI/IHCtesten positief, dan wordt er alsnog mutatie-onderzoek uitgevoerd. Figuur 10 Strategie bij de diagnose van HNPCC (26) De Amsterdam en Bethesda criteria Om families met HNPCC te kunnen onderscheiden van families met toevallige clustering van colorectale carcinomen zijn internationale criteria opgesteld door de International Collaborative Group on HNPCC (ICG-HNPCC). Deze klinische criteria zijn bekend als de Amsterdam I criteria (27). Ze hebben als doel de uniformiteit in de terminologie van HNPCC te bevorderen en internationale studies mogelijk te maken. De Amsterdam I criteria werden echter aangepast naar de Amsterdam II criteria toen bleek dat HNPCC ook geassocieerd is met andere buiten het colon gelegen maligne tumoren (24) (tabel 2). Tabel 2 Klinische criteria voor hereditair non-polyposis colorectaal carcinoom (22) - Histologisch bevestigd colorectaal carcinoom of een andere HNPCC-geassocieerde tumor (urineleider, endometrium, dunnedarm en nierbekken) bij tenminste drie familieleden in tenminste twee generaties. Één van de familieleden moet in de eerste graad verwant zijn met de andere twee; - Bij tenminste één van hen moet de diagnose zijn gesteld voor het vijftigste levensjaar; - De aandoening familiale adenomateuze polyposis moet zijn uitgesloten. Uit verschillende studies is echter gebleken dat deze criteria mogelijk te strikt zijn, waardoor patiënten met een defect in de DNA- mismatch herstelgenen kunnen worden gemist (27). De Amsterdam criteria zijn vervolgens aangepast tot de Bethesda criteria (tabel 3) (28). 29

30 Literatuurstudie Tabel 3 Aan ten minste één van deze Bethesda criteria moet worden voldaan (24) - Patiënten met synchrone kankers (twee of meer tumoren zijn aanwezig op hetzelfde moment) en metachrone kankers (eerste tumor wordt opgevolgd door een tweede tumor op een later moment) of HNPCC-geassocieerde kankers; - Patiënten met colorectale kanker (CRC) en een eerstegraads familielid met CRC en/of HNPCC-gerelateerde kanker en/of colorectale adenomen; - Eén van de kankers is gediagnosticeerd voor de leeftijd van 45 jaar en de adenoom voor de leeftijd van 40 jaar; - CRC of endometriumkanker is gediagnosticeerd voor de leeftijd van 45 jaar; - CRC aan de rechter zijde van het colon met een ongedifferentieerd patroon wat betreft histopathologie is gediagnosticeerd voor de leeftijd van 45 jaar. Wanneer voldoende aanwijzingen zijn voor HNPCC wordt genetisch onderzoek verricht. Omdat mutatie-onderzoek arbeidsintensief en duur is, wordt eerst een pre-screening verricht. MSI en IHCanalyse kunnen worden gebruikt om patiënten te identificeren met een hoge waarschijnlijkheid van de aanwezigheid van een MMR gendefect (24) Microsatellietinstabiliteiten-onderzoek In het DNA bevinden zich microsatellieten of Simple Sequence Repeats (SSR). Het zijn korte, repeterende DNA-sequenties van minder dan 150 basenparen lang, die in het gehele genoom gevonden kunnen worden. De samenstelling van de repeat is vaak zeer eenvoudig en bestaat uit een herhaling van één tot vier nucleotiden (bijvoorbeeld CACACACACA ) (24). Door het repetitief karakter worden tijdens de DNA-replicatie van deze microsatellieten vrij frequent fouten gemaakt, die normaal hersteld worden door de DNA- mismatch herstelgenen. In de kankercellen van HNPCC tumoren is deze controle op de replicatie beschadigd geraakt (de MMR genen functioneren niet meer goed). Hierdoor stapelen fouten (voornamelijk frameshifts ) zich op in de microsatellieten en worden de sequenties langer of korter. Dit fenomeen van abnormaal lange of korte microsatellieten noemt men microsatelliet instabiliteit (MSI) of replication errors (RER) (22). Over het algemeen worden bij MSI-analyse de internationale richtlijnen gehanteerd, die vastgelegd zijn op een workshop van de International Collaborative Group for HNPCC National Cancer Institute. Een panel van vijf microsatellietmarkers (referentie MS) wordt aanbevolen. Als twee van de vijf markers instabiliteit vertonen, wordt de tumor beschouwd als MSI-high (MSI-H). Als één 30

31 Literatuurstudie van de markers instabiliteit laat zien, wordt de tumor beschouwd als MSI-low (MSI-L). Een tumor zonder een instabiele marker wordt beschouwd als MS-stable (MSS). Als naast de vijf microsatellietmarkersets andere markers worden gebruikt, gelden de criteria hieronder weergegeven in tabel 4 (24). Tabel 4 Criteria voor MSI-H, MSI-L en MSS (24) MSI-H High microsatellite instability 30% van de markers vertonen instabiliteit MSI-L Low microsatellite instability < 30% van de markers vertonen instabiliteit MSS Microsatellite stability Geen enkele marker vertoont instabiliteit De lengte van de microsatellieten in tumorweefsel wordt vergeleken met de lengte van de microsatellieten in gezond weefsel (meestal bloed). MSI kan enkel als betrouwbaar geïnterpreteerd worden wanneer het tumorweefsel uit minimum 80 procent tumorcellen bestaat (28). Figuur 11 Detectie van microsatellietinstabiliteiten. Tumor-DNA (T) wordt vergeleken met DNA uit normaal weefsel (N) van dezelfde patiënt. De gebruikte markers voor de detectie van de instabiliteiten zijn internationaal vastgelegd. Figuur A toont een MSS-patroon, terwijl figuur B een MSI-H beeld weergeeft (28). Bijna alle colorectale carcinomen van patiënten met HNPCC vertonen een MSI-H beeld (meer dan 90 procent). MSI-analyse kan dus helpen bij de diagnose van dit syndroom. De analyse is echter niet specifiek voor HNPCC, daar het ook voorkomt bij tien tot vijftien procent van de sporadische colorectale en andere tumoren (24). 31

32 Literatuurstudie Immunohistochemisch-onderzoek Een andere snelle en goedkope techniek om MMR defecten op te sporen is immunohistochemie (IHC) van de MMR eiwitten in de tumoren (24). Door middel van immunohistochemisch-onderzoek kan de eiwitexpressie van de MMR genen bepaald worden. Dit onderzoek wordt toegepast op materiaal van tumorcellen en op normaal celmateriaal. Indien het betreffend eiwit niet meer tot expressie komt als gevolg van een mutatie, vindt geen aankleuring van het betreffende tumorweefsel voor dat specifieke eiwit plaats. Er kan aangetoond worden om welk gendefect het gaat door toepassing van IHC met antilichamen gericht tegen de verschillende MMR genen (28). Immunohistochemie is beschikbaar voor de detectie van de eiwitten gecodeerd door MLH1, MSH2 en MSH6 (28). Verlies van kleur voor het MSH2 eiwit is het gevolg van een germinale mutatie in het MSH2 gen. Ook voor MSH6 ligt een germinale mutatie aan de basis van het kleurverlies. Voor het MLH1 eiwit kan verlies van kleuring het resultaat zijn van hypermethylatie van de MLH1 promotor of van een germinale mutatie in het MLH1 gen. Figuur 12 Een immunohistochemische kleuring van een MSI-H patiënt. Figuur A toont kleuring van MLH1 en figuur B van MSH2. Er is duidelijk te zien dat de tumorcellen geen expressie vertonen voor MSH2. De tumorcellen tonen wel expressie voor MLH1. Het zou hier dus mogelijk kunnen gaan om een HNPCC-patiënt met een germinale MSH2-mutatie (28). Immunohistochemische kleuring is dus richtinggevend en een hulpmiddel bij de diagnose van HNPCC Mutatie-onderzoek Indien MSI-onderzoek en/of IHC-onderzoek een defect in één van de MMR genen suggereert, kan het onderzoek worden uitgebreid met mutatie-onderzoek (22). 32

33 Literatuurstudie In klinische diagnostische settings wordt meestal een bloedstaal getest op germinale mutaties in MLH1, MSH2 en MSH6. De mutaties in deze genen liggen verspreid over de gehele coderende sequenties. Bovendien blijkt dat HNPCC in de meeste families berust op een unieke germinale mutatie. Het onderzoek naar mutaties vereist daarom dat alle exonen onderzocht worden. Mutatieanalyse is hierdoor zeer arbeidsintensief en neemt een zestal maanden in beslag (22). De genetische test gebeurt bij voorkeur op een familielid waarbij colorectale kanker reeds is vastgesteld. Wanneer de familiale mutatie gevonden wordt in een welbepaald gen, kan presymptomatisch onderzoek worden uitgevoerd bij de rest van de familie (29). Honderden verschillende mutaties werden reeds gevonden. Het zijn voornamelijk kleine mutaties, maar er worden ook grote deleties gevonden bij MSH2 en MLH1. Kleine mutaties worden in het CMGG opgespoord via de op fluorescentie gebaseerde techniek High Resolution Melting Curve Analyse (HRMCA) (figuur 13). Afwijkingen in de smeltcurves wijzen op de aanwezigheid van een mutatie (30). Figuur 13 Principe van HRMCA. Door blootstelling aan stijgende temperaturen zal het DNA ultrasmelten. Hierbij komt de vooraf ingebouwde fluorescente dye vrij, wat resulteert in een typische smeltcurve (30). Indien een heterozygote mutatie in het amplicon aanwezig is, zal het DNA uitsmelten bij een andere temperatuur en een andere smeltcurve genereren. De X-as stelt de temperatuur voor, terwijl de Y-as de hoeveelheid fluorescentie in beeld brengt. Grote deleties worden opgespoord via Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) (figuur 14). MLPA is een multiplex-pcr methode die het mogelijk maakt om een abnormaal aantal kopieën te detecteren in wel 50 verschillende genomische DNA (of RNA)-sequenties. 33

34 Literatuurstudie De techniek van MLPA is gebaseerd op het feit dat de MLPA-probes hybridiseren aan de doelsequentie. In tegenstelling tot een standaard multiplex-pcr wordt slechts één paar PCR-primers gebruikt voor MLPA-amplificatie. De bekomen amplificatieproducten hebben een lengte tussen de 130 en 480 nucleotiden en kunnen geanalyseerd worden door middel van capillaire elektroforese. Het vergelijken van de verkregen pieken met een referentiestaal kan een indicatie geven omtrent de amplicons met een afwijkend aantal kopieën. Vier stappen worden gevolgd tijdens de MLPA-reactie (figuur 14) (31). Eerst gebeurt denaturatie van het DNA en overnacht incubatie met een mix van MLPA-probes. MLPA-probes bestaan uit twee gescheiden oligonucleotiden, die elk één van de PCR-primersequenties bevatten. De twee probe-oligonucleotides hybridiseren aan direct aangrenzende doelsequenties. Enkel wanneer de twee probe-oligonucleotiden beiden gehybridiseerd zijn aan hun aangrenzende doelsequenties, kan er ligatie optreden tijdens de ligatie reactie. Doordat enkel geligeerde probes exponentieel geamplificeerd zullen worden tijdens de PCR-reactie, zal het aantal probe-ligatieproducten een maat zijn voor de hoeveelheid doelsequenties in het staal. De amplificatieproducten worden gescheiden door middel van capillaire elektroforese. Figuur 14 Principe van MLPA (31) In de toekomst wil het CMGG methylatie-onderzoek van de MLH1 promotor invoeren vóór mutatie-onderzoek. 34

35 Literatuurstudie 2.5 Methylatie Epigenetica Ons genoom bestaat uit ongeveer drie miljard basenparen, waarvan minder dan twee procent codeert voor eiwitten (de genen). Fouten in de genen, zoals mutaties, deleties en inserties kunnen leiden tot het ontstaan van kwaadaardige tumoren. Niet alleen fouten in het DNA zelf, maar ook veranderingen in de structuur van het DNA, de zogenaamde epigenetische processen, beïnvloeden in belangrijke mate de activiteit van de genen (32). Epigenetica is letterlijk en figuurlijk een laag bovenop het DNA. Deze laag, die bestaat uit eiwitten en andere chemische moleculen, wijzigt niets aan de DNA-sequentie, maar bepaalt soms het onderscheid tussen ziek en gezond en ze controleert mee de eigenschappen van het organisme (33). In tegenstelling tot de klassieke genetische mutaties is een epigenetische verandering omkeerbaar. De twee meest bestudeerde epigenetische onderwerpen zijn DNA-methylatie en histon-modificatie. In het kader van mijn onderwerp wordt hieronder de DNA-methylatie verder besproken (34) Methylatie van DNA DNA-methylatie is één van de belangrijkste epigenetische processen. De term methylering beschrijft de toevoeging van een methylgroep aan een cytosine, waardoor een 5-methylcytosine gevormd wordt (figuur 15). Deze vorming van 5-methylcytosine gebeurt onder invloed van het enzym DNA-methyltransferase (DNMT), waarbij S-adenosylmethionine (SAM) de methyldonor is (32). Het enzym DNA-methyltransferase herkent de replicatievork, waar het efficiënt de CGdinucleotiden methyleert, waar de reeds bestaande streng ook gemethyleerd was. Dit mechanisme wordt de postreplicatieve onderhoudsmethylatie of maintenance methylation genoemd. Andere DNA-methyltransferases (zoals DNMT3a en DNMT3b) kunnen de overdracht van methylgroepen op naakt, ongemethyleerd DNA katalyseren. Deze de novo methylatie gebeurt onafhankelijk van de replicatie (33). Na de overdracht van de methylgroep volgt een spontane deaminatie, waardoor de base thymine ontstaat (34). 35