Wanneer moleculaire analysen aanvragen bij hematologische aandoeningen?

Transcriptie

1 Wanneer moleculaire analysen aanvragen bij hematologische aandoeningen? Barbara Denys Centrum voor Moleculaire Diagnostiek UZ Gent GAB, 1 juni 2010

2 Wat is de waarde van moleculaire biologie in de diagnostiek en followup van leukemieën en lymfomen? Algemene organisatie Technieken Bijdrage diagnose, bepalen therapie, prognose en follow-up Voordelen en beperkingen Belang correcte staalname Strategie: wanneer en welke test uitvoeren

3 Rol van het labo binnen de hemato-oncologie? Morfologie (beenmerg en perifeer bloed)! Microscopie = basis van de hematologische diagnostiek voordeel: snel geen geavanceerde techniek nadeel: beperkte gevoeligheid geen bijkomstige info

4 Rol van het labo binnen de hemato-oncologie? Verfijning van diagnostiek fenotypering: flowcytometrie met monoklonale antilichamen niveau van eiwit (functie van cel) genotypering: karyotypering - FISH PCR/microarrays niveau van genoom/dna/rna Detectie en/of analyse van nucleïnezuren in klinische stalen

5 Organisatie binnen UZ Gent Centrum Medische Genetica Gent (CMGG) Erferlijk overdraagbaar Technieken: karyotypering en FISH Analysen binnen hematooncologie (verworven): karyotypering, FISH bij diagnose AL en MDS Karyotypering en FISH bij multiple myeloom Karyotypering en BCR-ABL FISH bij CML FISH CLL Centrum Moleculaire Diagnostiek (CMD) Verworven Technieken: PCR, RTqPCR, sequencing Analysen: Opsporen en kwantificeren van fusiegenen en oncogen overexpressie (lymfomen en leukemie) Opsporen van klonaliteit (lymfomen) Opsporen van mutaties NPM1/FLT3 (AML), JAK2 V617F (MPN) Sequencing immuunglobuline zware keten locus (CLL)

6 Centrum voor Moleculaire Diagnostiek (CMD) 18 centra voor moleculaire diagnostiek (KB 98) afgeschaft door arrest Raad van State in : ex-cmd s niet meer betaald door RIZIV, op kosten van ziekenhuis Art 33bis in voege vanaf 01/08/2007: De verstrekkingen moeten uitgevoerd zijn in een laboratorium dat, binnen de 2 jaar na het in werking treden van dit besluit, een ISO accreditatie, of een accreditatie volgens een gelijkwaardige laboratoriumnorm bezit voorde uitgevoerde verstrekkingen April 2009: CMD UZG accreditatie behaald 3 MLT s voor de testen binnen hematooncologie (daarnaast 3 MLT s voor virologische testen) ~2000 arbeidsintensieve testen per jaar

7 Polymerase chain reaction of PCR specifieke amplificatie van een bepaalde sequentie DNA/cDNA streng, afgebakend door de gekozen reagentia (primers), door herhaald kopiëren in cycli bij elke cyclus worden vorige kopijen ook gekopieerd, zodat vermeerdering exponentieel verloopt (amplificatiefactor 2 n ; n = aantal cycli). DNA polymerase enzym verlengt primer door aanhangen nucleotiden (bouwstenen), complementair met template DNA (matrijs). Door amplificatie (10 12 ) analytisch gevoelig, doch gevaar van contaminatie

8 Materiaal - WBC: isolatie na lyse RBC - Extractie DNA of RNA: digestie, alkalische lyse, precipitatie of adsorptie - RNA als template: moet eerst in DNA omgezet worden door reverse transcriptie (cdna synthese); twee-staps PCR (betere gevoeligheid) - Reagentia: DNA polymerase, nucleotiden, primers, buffer - PCR toestel: thermische cycler; laat cyclische opwarming en afkoeling van reactiebuisjes

9 PCR = kettingreactie: opeenvolging van denaturatie, annealing en elongatie 1) denaturatie: complementaire DNA strengen uiteen halen, d.m.v. verhitting (95 C) 2) annealing: hybridisatie van complementaire DNA fragmenten, i.h.b.primers; wordt mogelijk door koelen (50 a 65 C) 3) elongatie: door polymerase verlengen van de vrije 3 residu s, best bij 72 C, wordt gestopt door verhitten: terug stap 1. T ( C) t (min) Real-time typisch 95 C 15s; 60 C 1min

10 Detectie Klassieke kwalitatieve PCR: Agar gelelectroforese (ethidium bromide) Kwantitieve PCR m.b.v. real-time fluorescentie Capillaire electroforese (fluorescentie) vb. klonaliteitsanalyse Chromogene enzymreactie (ELISA, lijn hybridisatie)

11 Staal Compartimentalisatie PCR Lab Archievering staal/dna/rna/cdna Pre-PCR Lab extractie DNA/RNA reverse transciptie Sas Mix lokaal aanmaak reagentia (Post) PCR Lab amplificatie, detectie PCR Lab: amplificatie detectie : voor amplificatie : na amplificatie Afval

12 Moleculaire testen CMD UZ Gent opsporen van fusiegen (-expressie): PML-RARA, TEL-AML, AML-ETO,... bij acute leukemieën BCR-ABL bij CML t(11;14) en t(14;18) bij lymfomen (MCL/FL) opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie bij acute leukemieën opsporen van mutaties: NPM1 en FLT3 bij AML JAK2V617F bij MPN opsporen van klonale genherschikkingen: TCR en Ig genherschikkingen bij lymfomen

13 DEEL I: moleculaire diagnostiek bij ACUTE LEUKEMIEËN Belang diagnose, prognose en follow-up!

14 Verworven genetische afwijkingen: fusiegenen Chromosomale translocatie geeft aanleiding tot ontstaan van een nieuw gen = fusiegen: opgebouwd uit coderende regio s van beide chromosomen Identificatie van fusiegenen: herschikking van genetisch materiaal tgv. structurele defecten resulteert in de vorming van fusiegenen (PML-RARA, TEL-AML1, etc.) Vb. inv(16) MYH 11/CBFβ Causaal verband tussen expressie van dit gen en neoplasie (?)

15 Ziekte-specifiek RNA versus DNA Aanwezigheid degraderende enzymes DNase relatief instabiel/inactief RNase heel stabiel / renatureert na autoclaveren, zit op vingertoppen Bij lyse, sterven cel: RNasen actief DNA stabiel in klinische stalen RNA niet stabiel in klinische stalen Beide kunnen geïsoleerd worden uit lichaamsvloeistoffen; verse en paraffine ingebedde weefsels Screening fusiegenen bij nieuwe acute leukemie: Bepaling op RNA

16 Meestal ziekte-specifiek RNA Waarom? genexpressie is abnormaal in neoplastische cellen, soms mede ten gevolgen van genomische afwijkingen Waggot et al. Blood, 90, 1997: meer (m)rna Betere gevoeligheid

17 NIEUWE DIAGNOSE ACUTE LEUKEMIE Verfijning van de diagnostiek Bloedstaal voor: Klinische biologie CMGG PCR Flowcytometrie Karyotypering FISH Na/Li-heparine buis EDTA Geen heparine: werkt inhiberend op PCR

18 Staalname en transport CMD Bij voorkeur beenmerg Perifeer bloed indien voldoende blasten perifeer EDTA bloed APARTE BUIS: cfr. Stabiliteit RNA Speciaal blauw aanvraagformulier met vermelding klinische info ( leukemie ) Buis moet binnen de 24h na afname naar CMD gezien het belang van de pre-analytische fase Op die manier isolatie WBC zeker binnen 48h na staalname

19 Leukemie protocol Breed screenen met een kwalitatieve multiplex RT- PCR bij diagnose (beenmerg of perifeer bloed) Positief negatief hernemen met specifieke real-time PCR voor overeenkomend gevonden fusiegen Kwantitatieve waarde gevonden fusietranscript bij diagnose Follow-up mogelijk m.b.v. specifieke real-time PCR van het gevonden fusietranscript WT1- overexpressie Positief Follow-up met realtime PCR WT1 STOP uitwerking tranlocaties negatief Geen verdere moleculaire follow-up mogelijk Mutatie FLT3 en NPM1 Prognostische merkers

20 Screening translocaties leukemie HemaVision TM is een kwalitatieve multiplex RT-PCR test ontwikkeld om 28 verschillende translocaties of chromosomale herschikkingen, inclusief meer dan 80 breekpunten of splice variants, te detecteren, die specifiek voorkomen bij acute en chronische leukemie t(1;11)(p32;q23) MLL/AF1p, t(1;11)(q21;q23)mll/af1q, t(1;19)(q23;p13)e2a/pbx1, t(3;21)(q26;q22)aml/eap/mds/evi1, t(3;5)(q25.1;q34)npm/mlf1, t(4;11)(q21;q23)mll/af4, t(5;12)(q33;p13) TEL/PDGFRb, t(5;17)(q35;q21)npm/rara, t(6:11)(q27;q23) MLL/AF6, t(6;9)(p23;q34)dek/can, t(8;21)(q22;q22)aml1/mgt8, t(9;11)(q22;q23) MLL/AF9, t(9;12)(q34;p13) TEL/ABL, t(9;22)(q34;q11)bcr/abl, t(9;9)(q34;q34)set/can, t(10;11)(p12;q23)mll/af10, t(11;17)(q23;q21)mll/af17, t(11;17)(q23;q21) PLZF/RARa, t(11;19)(q23;p13.1) MLL/ELL, t(11;19)(q23;p13.3) MLL/ENL, t(12;21)(p13;q22)tel/aml1, t(12;22)(p13;q11) TEL/MN1, t(15;17)(q22;q21)pml/ RARa, t(16;21)(q11;q22)tls/erg, t(17;19)(q22;p13) E2A/HLF, inv(16)(p13;q22)cbfb/myh11, t(x;11)(q13;q23)mll/afx, TAL1deletion(p34)SIL/TAL1

21 Screening translocaties leukemie Pallisgaard et al, Blood 98: Strehl et al., Blood 97:805-8 (2001)

22 Genetische diversiteit/ voorkomen fusiegenen bij AML

23 Rol cytogenetische afwijkingen (fusiegenen, mutaties) bij prognose Disease-free survival according to cytogenetics at diagnosis Ferrara et al., Crit review Onco/Hematol 2007

24 Translocaties in acute lymfatische leukemie Pui et al., NEJM 350: (2004)

25 Prognostisch belang van translocaties in acute lymfatische leukemie Pui et al., NEJM 350: (2004)

26 Belang detectie fusietranscripten bij follow-up Real-time PCR kwantificatie van fusietranscripten bij leukemie is relevant voor de follow-up and detectie van minimale residuele ziekte of MRD BELANG gevoelige detectie en kwantificatie minimal residual disease (MRD):

27 Follow-up BELANG gevoelige detectie minimal residual disease (MRD): kwantitatieve real-time PCR sensitiviteit: >> FISH serial molecular monitoring Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003)

28 MRD BELANG detectie en kwantificatie minimal residual disease (MRD): monitoring respons op therapie detectie vroege relaps relatie MRD resultaten en klinisch ziekteverloop (outcome) risk assessment (voorspellende waarde fusietranscript levels) kwantitatieve RT-PCR fusietranscripten beperkt (25% van de AML patiënten) Continue monitoring/follow up

29 Bepaling fusiegen expressie met kwantitatieve real-time RT-PCR EAC protocol LEADING ARTICLE: Standardization and quality control studies of real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia A Europe Against Cancer Program J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, W Bi, D Grimwade, N Pallisgaard, G Barbany, G Cazzaniga, JM Cayuela, H Cave, F Pane, JLE Aerts, D De Micheli, X Thirion, V Pradel, M Gonza lez, S Viehmann,M Malec, G Saglio and JJM van Dongen Leukemia 2003 Kwantificatie Standaardisatie

30 Overzicht belangrijkste fusiegenen waarvoor kwantitatieve opvolging Translocatie Fusiegen Voorkomen Prognose t(9;22) (q34;q11) ABL/BCR: p190 en p210 Pre B-cel ALL: 25-30% volwassenen; 2-5% kinderen Slechte prognose t(8;21) (q22;q22) ETO/AML1 AML: 5-12 %, AML M2: 30 % Goede prognose t(4;11) (q21;q23) V/MLL 5% pre B-cel ALL Slechte prognose 11q23 abnormaliteiten Meest frequente 11q23 abnormaliteit bij pre B-ALL t(9;11) (p22;q23) MLL-AF9 Precursor B-cel ALL 11q23: 5-6 % van AML (M4-5) Intermediaire prognose t(12;21)(q12;q22) TEL/AML-1 25% pre B-ALL bij kinderen Goede prognose inv(16) (p13;q22) MYH11/CBFbeta 8-12 % van AML, zeer hoge associatie met AML M4 eos Goede prognose t(1;19) (q23;p13) E2A-PBX1 3-5% kinderen - 3% volwassen ALL prognose controversieel t(15;17)(q22;q21) PML/RARalfa 5-8 % van AML, associatie met AML M3: > 95% Goede prognose

31 Overzicht fusiegenen: kwalitatieve PCR Translocatie Voorkomen Voorkomen Prognose t(6;9) (p23;q34) DEK/CAN 1% AML Slechte prognose t(1;22)(p13;q13) OTT-MAL AML bij kinderen: AML M7 of megakaryoblaste n leukemie - zelden Slechte prognose HOX11L2 expressie t(5;14)(35;32 T-ALL Slechte prognose Microdeletie 1p32 SIL-TAL 5-25% T-ALL? controversieel

32 Moleculaire testen CMD UZ Gent opsporen van fusiegen (-expressie): PML-RARA, TEL-AML, AML-ETO,... bij acute leukemieën BCR-ABL bij CML opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie bij acute leukemieën opsporen van mutaties: NPM1 en FLT3 bij AML JAK2V617F bij MPN opsporen van klonale genherschikkingen: TCR en Ig genherschikkingen bij lymfomen

33 Leukemie protocol Breed screenen met een kwalitatieve multiplex RT- PCR bij diagnose (beenmerg of perifeer bloed) Positief negatief hernemen met specifieke real-time PCR voor overeenkomend gevonden fusiegen Kwantitatieve waarde gevonden fusietranscript bij diagnose Follow-up mogelijk m.b.v. specifieke real-time PCR van het gevonden fusietranscript WT1- overexpressie Positief Follow-up met realtime PCR WT1 STOP uitwerking tranlocaties negatief Geen verdere moleculaire follow-up mogelijk Mutatie FLT3 en NPM1 Prognostische merkers

34 Wt-1 overexpressie Overexpressie Wilms tumour gene 1 (WT1) in leukocyten bij de meeste AML patiënten (~80%): pan-leukemische merker. Klinische relevantie bepaling WT1 genexpressie voor MRD wordt in vraag gesteld Geen prognostische waarde Gevoeligheid WT1 als MRD merker is beperkt door de relatieve hoge achtergrond WT1 expressie in BM cellen bij patienten in remissie en gezonde individuen (geen hematologische maligniteit) Bepaling WT1 gen expressie enkel nuttig voor followup patiënten zonder een meer specifieke en sensitieve MRD merker (fusiegen)

35 AML prognostic markers Mutations overexpression Flt3 ITD 40% Adverse BAALC Adverse NPM % Favorable ERG Adverse MLL PTD 8-11% Adverse EVI1 14% Adverse CEBPa 15-19% Favorable MN1 Adverse N-RAS 9% Unclear WT % Adverse K-RAS PRANG 30-60% Favorable WT1 10% Adverse? PHAM/ALM 70% Favorable ckit 25-30% CBFB- AML Adverse Total microrna Adverse PU-1 mir181a Favorable MOLECULAR PROGNOSTIC SCORE

36 NPM1 en FLT3-ITD mutaties Incidentie NPM1 mutaties: NPM1+ = goede prognose % van de AML - 50%-60% AML met normaal karyotype Incidentie FLT3-ITD: 25% < AML; hogere incidentie (40%) in NMP1+ AML FLT-ITD = slechte prognose Gallagher, R. E. Blood 2005;106:

37

38 DEEL II: moleculaire diagnostiek bij CML Belang fusietranscript BCR-ABL a.d.h.v. een casus

39 Casus presentatie man, 51 jaar doorverwijzing huisarts wegens aanhoudende leukocytose kliniek: - splenomegalie (miltdiameter 14cm) - geen adenopathie

40 Casus bloedwaarden Rode bloedcellen * 10 6 /µl Hemoblobine g/dl Hematocriet % MCV 97 fl MCH 33.2 pg/cel MCHC 33.0 g/dl RBC RDW % WBC * 10 3 /µl 4-10 PLT 169 * 10 3 /µl LDH U/L urinezuur + 8 mg/dl CRP mg/dl normocytaire anemie forse leukocytose geen trombopenie/trombocytose

41 CASUS morfologie PERIFEER opvallende hyperleukocytose meerderheid segmenten maar ook myeloïde voorlopers (voornamelijk myelocyten) blasten (<2%)

42 PERIFEER CASUS morfologie eosinofielen normoblast basofiel

43 CASUS morfologie BEENMERG hypercelrijk beenmerg/mergbrokjes met een gestegen M/E verhouding laag normaal aantal megakaryocyten morfologie megakaryocyten: - kleinere - hypolobulaire/monolobulaire hoog normale eosinofilie

44 CASUS morfologie BESLUIT MORFOLOGIE Beeld passend bij een chronisch myeloproliferatief proces; best passend bij CML in chronische fase. Te confirmeren met moleculaire diagnostiek. Verfijning van de diagnostiek

45 Vermoeden nieuwe CML Verfijning van de diagnostiek Bloedstaal voor: CMD CMGG PCR Karyotypering FISH Na/Li-heparine buis EDTA Geen heparine: werkt inhiberend

46 Staalname en transport CMD PERIFEER BLOED is voldoende EDTA bloed APARTE BUIS: cfr. Stabiliteit RNA Speciaal blauw aanvraagformulier met vermelding klinische info ( nieuwe diagnose CML of CML? ) Buis moet binnen de 24h na afname naar CMD gezien het belang van de pre-analytische fase Op die manier isolatie WBC zeker binnen 48h na staalname

47 CASUS moleculair/(cyto)genetica Enige CMPD die geassocieerd is met een specifieke genetische afwijking: > 95% t(9;22)(q34;q11) Gerelateerd aan pathogenese!

48 CASUS (cyto)genetica t(9;22)(q34;q11) Philadelphia chromosoom kayotypering (CMG) abnormaal karyotype bij patient: 46,XY,t(9;22)(q34;q11)[30] BCR/ABL fusiegen metafase FISH (CMG) resultaat patiënt: 99% van de onderzochte kernen positief voor t(9;22) BCR ABL der(9) der(22) (Ph) 22 9

49 Bepaling fusiegen expressie met kwantitatieve real-time RT-PCR EAC protocol LEADING ARTICLE: Standardization and quality control studies of real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia A Europe Against Cancer Program J Gabert, E Beillard, VHJ van der Velden, W Bi, D Grimwade, N Pallisgaard, G Barbany, G Cazzaniga, JM Cayuela, H Cave, F Pane, JLE Aerts, D De Micheli, X Thirion, V Pradel, M Gonza lez, S Viehmann,M Malec, G Saglio and JJM van Dongen Leukemia 2003 Kwantificatie Standaardisatie

50 CASUS MOLECULAIR genoom/dna ALL CML mrna Nashed et al., J. Mol. Diag. 5:63-72 (2003) M-Bcr = major breakpoint cluster region m-bcr = minor breakpoint cluster region

51 PCR BCR-ABL Methode volgens gestandaardiseerd EAC protocol real-time RT-PCR die de frequente junctietypes (b2a2/b3a2 bij p210 en e1a2 bij p190) detecteert. Andere zeldzame junctietypes worden niet opgespoord. FISH steeds uitvoeren bij diagnose indien sterk vermoeden BCR-ABL en negatieve PCR

52 Voorspellende waarde major molecular response (MMR) onder imatinib mesylaat (Glivec) MMR A best molecular response of at least a 3-log reduction in BCR- ABL mrna levels predicts better progression-free survival. Kaplan-Meier survival curve is shown for patients achieving a best RQ-PCR level (at any time) above various thresholds. The panel compares patients with a best molecular response of at least 3 versus those below 3. These are landmark analyses starting at the time of CCR. RD Press et al, Blood, June 2006 (4250)

53 Moleculaire follow-up Progression-free Survival on 1 st -line Imatinib by Molecular Response (MR) at 12 months Progression-free Survival on 1 st -line Imatinib by Molecular Response (MR) at 12 months % without progression No CCyR <3 log reduction >=3 log reduction estimated rate of survival without progression at 42 months: n=138 75% PFS n=94 90% PFS n=136 98% PFS Months since randomization IRIS Study,update 2004

54 MMR Recommendation of European LeukemiaNet: incorporating molecular responses at 6, 12 and 18 months based on analysis ot the IRIS PCR data Evaluation Time Optimal Suboptimal Failure 3 months CHR and at least minor CR (Ph+ 65%) No CHR No HR 6 months At least partial CR (Ph+ 35%) No partial CR (Ph+ > 35%) and/or BCR-ABL (IS) > 10% No CHR No CR (Ph+ > 95%) 12 months CCR No CCR (Ph+ > 1%) and/or BCR-ABL (IS) > 1% No partial CR (Ph+ > 35%) and/or BCR-ABL (IS) > 10% 18 months MMR ( 0.1%) No MMR ( 0.1%) No CCR (Ph+ > 1%) and/or BCR-ABL (IS) > 1% Baccarani et al., J Clin Oncol 2009 ASH 2009

55 Opvolging genormaliseerde ratio BCR-ABL (%) bij patiënt casus Ratio BCR-ABL/ABL (%) perifeer bloed 1000,00000% 100,00000% 10,00000% 1,00000% 0,10000% 0,01000% KARYO: + FISH: + Diagnose KARYO: - FISH: - 8 maand 14 maand 20 maand Ratio BCR-ABL / ABL (%) 0,00100% 0,00010% Diagnose 8 maand 14 maand 20 maand 2j 2m 2j 2m 3j 1m 3j 1m 4j 1m 4j 1m 4j 7m 4j 7m 5j 5m 5j 5m start Glivec: 400 mg/dag

56 DEEL III: JAK2V617F mutatie Belang mutatiescreening bij chronisch myeloproliferatieve aandoeningen (MPN)

57 JAK2V617F mutatie verworven puntmutatie chrom 9 exon 14; G naar T op codon 617 => Valine naar phenylalanine Involvement of Janus Kinases in Cytokine Signal Transduction (Panel A) and Structural Map of Janus Kinase 2 (Panel B) 2005: first reports by 4 groups gain-of-function point, resulting in a constitutive tyrosine phosphorylation activity -> cytokine-independent activation of JAK-STAT pathway proliferative and survival advantage to affected hematopoietic precursors stimulatie erythropoïese zonder groeifactoren zoals EPO Goldman JM, NEJM 2005

58 Klinisch belang JAK2V617F DIAGNOSTISCHE WAARDE:! Belangrijke moleculaire merker bij diagnose van BCR-ABL negatieve chronische myeloproliferatieve aandoeningen; heterogene groep met vaak complexe histologische diagnose JAK2 tijdperk: veel vereenvoudigd simpele en relatief goedkope assay Ziekte van Vaquez of polycythemia vera (PV): >95% JAK2V617F positief Essentiële thrombocytemie (ET): ~50% positief Primaire myelofibrose (PMF): ~50% positief 100% specifiek voor klonale aandoening Geen onderscheid mogelijk tussen de verschillende MPD

59 Revised WHO 2008: Klinisch belang JAK2V617F Presence of JAK2V617F = major diagnostic criterion

60 Klinisch belang JAK2V617F PROGNOSE MUTATIESTATUS: ET patienten: verschillende studies tonen een prognostische waarde JAK2V617F MUTATIESTATUS (Vannucchi et al, Leukemia 2008): JAK2V617F + ET: hoger Hb and WBC, lager PLT aantal, verhoogd risico op PV transformatie!!! Meeste reports: associatie met veneuze trombosen, maar controversieel Belang KWANTITATIEVE resultaten: Verschillende JAK2V617F allele burden (%) tussen MPN categorieën Associatie proportie mutante JAK2 allelen en fenotype, ziekteprogressie en risico op tromobose MAAR meer studies vereist Mogelijkheid tot follow-up en opvolging JAK2V617F targeted therapy/jak2 inhibitors (toekomst)

61 Vermoeden MPN Opvallende polycythemie, met normale O 2 saturatie Trombocytose Leukocytose Verfijning van de diagnostiek Bloedstaal voor CMD (beenmerg niet nodig) PCR t(9;22) of BCR-ABL bij leukocytose en vermoeden CML OF Mutatie JAK2V617F bij polycythemie en trombocytose

62 Andere mutaties MPL mutaties myeloproliferatieve leukemie virus gen codeert voor een trombopoïetine receptor (TPO) Trombopoïetine (TPO) en MPL-receptor reguleren de productie van trombocyten Meest voorkomende mutatie: MPLW515L en MPLW515K 5% van PMF en 1% ET JAK2 exon 12 mutaties Reeds meer dan 12 verschillende beschreven JAK2V617F negatieve PV-patiënten (3-5%)

63 DEEL IV: moleculaire diagnostiek bij LYMFOMEN Wanneer PCR nodig? Belang diagnose en follow-up?

64 Moleculaire testen CMD UZ Gent opsporen van fusiegen (-expressie): PML-RARA, TEL-AML, AML-ETO,... bij acute leukemieën BCR-ABL bij CML t(11;14) en t(14;18) bij lymfomen (MCL/FL) opsporen van (onco-) gen overexpressie: WT1-overexpressie bij acute leukemieën opsporen van mutaties: NPM1 en FLT3 bij AML JAK2V617F bij MPN opsporen van klonale genherschikkingen: TCR en Ig genherschikkingen bij lymfomen

65 Ig en TCR genherschikking Basis diversiteit immuunreceptoren Basis klonaliteit: unieke genherschikking binnen maligniteiten

66 PCR gebaseerde klonaliteit BIOMED-2 protocol Multiplex PCR Verbetering sensitiviteit Gestandaardiseerd protocol: betere inter-lab vergelijking

67 PCR gebaseerde klonaliteit Consensus primers, targeting framework regions (FR) of V and J gene-segments; FR flank complementary determining regions (CDR) CDR3 variability results of both from gene-segment diversity and nucleotide removal or addition in frame rearrangements differ 3 base-pares

68 Multiplex BIOMED-2 PCR TCR Vβ Dβ Jβ TCRB tubes A and B TCRB tubes A and C: J β A primers 5' 3' Vβ2 Vβ4 Vβ1/5 Vβ6a/11 Vβ6b/25 Vβ6c Vβ7 Vβ8a Vβ9 Vβ10 Vβ11 Vβ3/12a/13a/15 Vβ13b Vβ12b/13c/14 Vβ16 Vβ17 Vβ18 Vβ19 Vβ20 Vβ21 Vβ22 Vβ8b/23 Vβ24 V β family primers AACTATGTTTTGGTATCGTCA CACGATGTTCTGGTACCGTCAGCA CAGTGTGTCCTGGTACCAACAG AACCCTTTATTGGTACCGACA ATCCCTTTTTTGGTACCAACAG AACCCTTTATTGGTATCAACAG CGCTATGTATTGGTACAAGCA CTCCCGTTTTCTGGTACAGACAGAC CGCTATGTATTGGTATAAACAG TTATGTTTACTGGTATCGTAAGAAGC CAAAATGTACTGGTATCAACAA ATACATGTACTGGTATCGACAAGAC GGCCATGTACTGGTATAGACAAG GTATATGTCCTGGTATCGACAAGA TAACCTTTATTGGTATCGACGTGT GGCCATGTACTGGTACCGACA TCATGTTTACTGGTATCGGCAG TTATGTTTATTGGTATCAACAGAATCA CAACCTATACTGGTACCGACA TACCCTTTACTGGTACCGGCAG ATACTTCTATTGGTACAGACAAATCT CACGGTCTACTGGTACCAGCA CGTCATGTACTGGTACCAGCA 3' 5' GTGGTCTAAGTGTCAACATCCATTC (+53) CTGGTCCAATTGGCAACATCCATTC TTCAACCGAGTGACAACATCCATTC CTTGGGTCGAGAGACAGAACCCATAC CTGAGCTGAGAGGTAGGATCCATTC GTCCGAGTGACACTGTCCATAC TCCGACTGGCATGACCCATTC TCCGACTGGCACGACCCGCTC GTCCGAGTGCCAATGTCCATTC ACTGTCACGAGCCATTCGCCC AGAGTCACGACCCATTCGACC CACGAGCCACACGCGC (+53) (+55) (+56) (+55) (+58) (+56) (+58) (+52) Jβ1.1 Jβ1.2 Jβ1.3 Jβ1.4 Jβ1.5 Jβ1.6 Jβ2.2 Jβ2.6 Jβ2.7 TCRB tubes B and C: J β B primers 3' 5' AGTGGCACGATCCATTCTTCC (+59) Dβ J β primers (+58) (+59) (+57) Jβ Jβ2.1 Jβ2.3 Jβ2.4 Jβ2.5 TCRB tube C Dβ1 (-252) Dβ1 primer 5' 3' GCCAAACAGCCTTACAAAGAC Dβ2 primer 5' 3' Dβ 2 (-137) TTTCCAAGCCCCACACAGTC J β primers BIOMED-2 report: Leukemia 2003; 17:

69 Multiplex BIOMED-2 PCR IgH

70 Detectie klonaliteit in B-cel maligniteiten IGH IGK all IGH DH-JH VH-JH DH-JH VH-JH Vκ-Jκ Kde Vκ-Jκ + IGK + Kde * +DH-JH + Kde MCL (n=54) 100% 11% 100% 94% 75% 100% 100% 78% B-CLL/SLL (n=56) 100% 43% 100% 96% 61% 100% 100% 73% FL (n=109) 84% 19% 86% 63% 59% 84% 100% 64% MZL (n=41) 88% 51% 95% 68% 54% 83% 100% 68% DLBCL (n=109) 79% 30% 85% 61% 58% 80% 98% 72% TOTAL (n=369) 88% 28% 91% 73% 60% 88% 99% 70% * Combination of two Ig gene rearrangements without somatic mutations BIOMED-2 B-cell malignancy report: PAS Evans et al, Leukemia 2007;21:

71 Detectie klonaliteit in T-cel maligniteiten TCRB TCRG TCRB Vβ-Jβ Dβ-Jβ Vβ-Jβ Vγ-Jγ + TCRG + Dβ-Jβ T-PLL (n=33) 94% 47% 100% 94% 100% T-LGL (n=28) 86% 62% 96% 96% 100% PTCL-U (n=47) 85% 67% 98% 94% 100% AILT (n=37) 70% 61% 89% 92% 95% ALCL (n=43) 70% 48% 74% 74% 79%* TOTAL (n=188) 80% 58% 91% 89% 94%* (99%) * 20% to 25 % of anaplastic large cell lymphomas do not have TCR gene rearrangements (null-alcl) BIOMED-2 T-cell malignancy report: M. Brüggemann et al, Leukemia 2007;21:

72 VOORDELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse Hoge klinische gevoeligheid (zie voorgaande tabellen) Moleculaire diagnostiek vaak niet eerste lijn in de diagnostische uitwerking; vaak geen vers materiaal meer beschikbaar Gefixeerd materiaal / paraffinecoupes nog bruikbaar voor PCR applicaties CAVE belang fixatie protocol, waardoor beschadiging nucleïnezuren (gefragmenteerd); afh. Best gebufferde formol (4%) en minder dan 24h fixatieduur

73 NADELEN PCR-gebaseerde klonaliteitsanalyse Complex Interpretatie vaak moeilijk Veel pitfalls Analyse vereist voldoende kwalitatief (niet gefragmenteerd) DNA; niet altijd mogelijk op paraffinecoupes Pseudoklonaliteit door preferentiële amplificatie bepaalde herschikkinge Vals negativiteit mogelijk: zeldzame herschikkingen, somatische hypermutatie EXPERTISE VEREIST!

74 Toepassingen DIAGNOSE Histopathologische DD maligniteit vs reactief beeld: op vers en paraffine materiaal B-cel maligniteiten: uitwerking vermoeden klonaliteit met flowcytometrie (niet altijd duidelijk) T-NHL: uitwerking aberrant fenotype gevonden met flowcytometrie STAGING Klonale verwantschap: klonaal verband aantonen tussen verschillende lymfoproliferatieve letsels of in geval van relapse? Secundaire tumor?

75 Vermoeden lymfoproliferatieve aandoening Verfijning van de diagnostiek Bloedstaal voor: Klinische biologie UZ Gent Flowcytometrie: B-cel: bepaling mkappa / mlambda expressie T-cel: aantonen aberrante populatie (weinig specifiek) PCR TCR genherschikking PCR OF/EN Ig genherschikking PCR

76 Mantelcellymfoom t(11;14)(q13;q32) of BCL1-IGH = genetic hallmark Overexpressie van cycline D1 (rol controle celcyclus) Geen abnormaal fusieproteïne gevormd PCR op DNA volgens BIOMED-2 protocol

77 PCR t(11;14) De gouden standaard = interphase FISH detectie alle mogelijke breekpunten door gebruik te maken van breakpoint-flanking probes De PCR-gebaseerde detectiemethode maakt gebruik van een primer in het uiterste 5 gebied van de BCL1-MTC (85 bp regio) zodat ~ 40% van de breekpunten gedetecteerd kunnen worden. diagnostische klinische gevoeligheid beperkt (hoog % vals-negatieve t.o.v. FISH), Wel analytisch gevoelig: indien positief, nuttig voor MRD analyse. BIOMED-2 protocol

78 Folliculair lymfoom t(14;18)(q32;q21) of BCL2-IGH is karakteristiek Frequentie varieert wel binnen de groep: Graad 1 en 2: 85-90% Graag 3a: 75% Graad 3b: 10-15% Geen abnormaal fusieproteïne gevormd PCR op DNA volgens BIOMED-2 protocol

79 PCR t(14;18) De gouden standaard = interphase FISH detectie zo goed als alle mogelijke breekpunten De PCR-gebaseerde detectiemethode; 3 sets van primers (MBR, 3 MBR en mcr) zodat ~ 60% van de breekpunten gedetecteerd kunnen worden. diagnostische klinische gevoeligheid beperkt (hoog % vals-negatieve t.o.v. FISH), Wel analytisch gevoelig: indien positief, nuttig voor MRD analyse. BIOMED-2 protocol

80 Vermoeden MCL of FL Verfijning van de diagnostiek Bloedstaal voor: Klinische biologie CMGG PCR Flowcytometrie Karyotypering FISH FISH op celsuspensie Geen karyotypering meer!