Moleculaire karakterisering bij acute myeloïde leukemie (AML)

Transcriptie

1 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Moleculaire karakterisering bij acute myeloïde leukemie (AML) Yuran VANWONTERGHEM Promotor: Prof. Dr.Jan Philippé. Begeleider: Apr. Klin. Biol. Barbara Denys Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER IN DE GENEESKUNDE

2

3 FACULTEIT GENEESKUNDE EN GEZONDHEIDSWETENSCHAPPEN Academiejaar Moleculaire karakterisering bij acute myeloïde leukemie (AML) Yuran VANWONTERGHEM Promotor: Prof. Dr.Jan Philippé. Begeleider: Apr. Klin. Biol. Barbara Denys Scriptie voorgedragen in de 2 de Master in het kader van de opleiding MASTER IN DE GENEESKUNDE

4 De auteur(s) en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Datum 04/05/2012 Yuran Vanwonterghem Prof. Dr. Jan Philippé

5 Voorwoord Het moeilijkste is ondertussen achter de rug. Het schrijven van dit voorwoord is dan ook een verademing. Voor je eraan begint lijkt een thesis schrijven geen onoverkomelijk iets. Pas wanneer je echt bezig bent merk je hoeveel tijd in één korte alinea kan kruipen, in één figuur. Ook al prent je jezelf in: onderschat het niet, doet dit ruimschoots op tijd. Je doet het niet. Daar kan ik zelf zeker van meespreken. Maar ach, het heeft ook nog iets om in de vroege uurtjes voor de deadline nog enkele erg relevante zaken in orde te stellen. Je schrijft maar één thesis. Allereerst enkele woorden van dank voor mijn promotor, Prof. Dr. Jan Philippé die ondanks zijn drukke agenda altijd tijd voor me kon vrijmaken. Met alle vragen kon ik bij hem terecht. Een volgende dankbetuiging richt ik tot mijn begeleidster, Apr. Klin. Biol. Barbara Denys. Niet enkel omdat ik haar steeds met intelligente en minder intelligente vragen mocht lastigvallen, maar ook omdat ze zelf erg veel werk heeft geleverd om mijn thesis tot op dit punt te krijgen. Zonder haar inbreng was dit werk waarschijnlijk een opeenstapeling van fouten geweest. Het is dan ook erg belangrijk voor mij dat zij achter mijn masterproef staat, waar we samen veel moeite hebben ingestoken. Bedankt. Ik kan mag en zal geen thesis indienen zonder mijn tweelingzusje Yumi te bedanken. Gedeelde thesissmart is halve smart. Miran en Sumi wil ik vast en zeker hier vermelden, alleen hen zien fleurde me al op. Ook mijn ouders stonden me steeds met raad, daad en vooral voedsel bij. En dat op de meest onmogelijke uren, dankjewel. Ten slotte wil ik nog mijn Geoffrey bedanken, mijn baken in donkere thesisdagen. Werkelijk high performance, delivered! Yuran Vanwonterghem v

6 Inhoudsopgave Voorwoord v 1 Inleiding Acute myeloïde leukemie Definitie Incidentie en mortaliteit Risicofactoren Pathogenese Leukemische stamcellen Diagnose Classificatie Prognose Behandeling Moleculaire en cytogenetische heterogeniteit in AML Cytogenetische afwijkingen Genmutaties Gen expressie Minimale restziekte Definitie Technieken Doelstelling 27 3 Methodologie Patiëntenreeks Diagnostiek van acute leukemie Microscopie Flowcytometrie vi

7 3.2.3 Cytogenetica Moleculaire diagnostiek bij AML Elektronisch patiëntendossier Statistische werkwijze Resultaten Patiëntenpopulatie Leeftijd Kinderen versus volwassenen Volwassenen <60j versus ouderen (>60j) Algemeen besluit Cytogenetica Cytogenetische afwijkingen Overlevingsduur volgens risicogroep Besluit Recidieven Patiëntenkarakteristieken Besluit Moleculaire afwijkingen NPM1 en FLT3 mutatie CEBPA mutatie Discussie Prognostische waarde van de bestudeerde variabelen Leeftijd en cytogenetica Moleculaire genetica Risicostratificatie Beperkingen van de studie Moleculaire analyse Statistische analyse Toekomstige implicaties Lijst van figuren 58 Lijst van tabellen 59 Bibliografie 61

8 Abstract Achtergrond Cytogenetica wordt gebruikt om patienten met acute myeloïde leukemie (AML) in te delen in prognostische risicogroepen. Een derde van de AML patiënten vertoont echter geen afwijkend karyotype. Zij worden in de intermediaire risicogroep ondergebracht. De prognose voor deze patiëntengroep is zeer variabel. Moleculaire analysen van leukemische blasten uit beenmerg of bloed tonen een duidelijke heterogeniteit van verworven genmutaties en veranderingen in genexpressie: mutaties in het nucleofosmine-gen (NPM1), het fms-gerelateerde tyrosine kinase 3-gen (FLT3) en het CCAAT/enhancer bindingsproteïne α gen (CEPBA). Methoden De cellen worden gekarakteriseerd d.m.v. 8-kleuren flowcytometrie en de moleculaire afwijkingen worden bepaald via Multiplex- PCR technieken. In een populatie van 75 patiënten met gediagnosticeerde AML werd gescreend naar onderliggende translocaties. We karakteriseerden de FLT3, NPM1, WT1 en CEBPA status voor 56 patiënten bij wie geen recurrente chromosomale afwijking met gekende prognose werd gevonden. We evalueerden de associaties van deze mutaties met het klinische beloop. Er werd gekeken naar risico op herval of sterfte als klinische eindpunten. Dit deden we zowel voor de hele populatie als voor de populatie met een normaal karyotype. Deze analyse werd verricht om de prognostische en voorspellende waarden van mutaties bij patiënten met AML te evalueren. Resultaten Een totaal van 26.7% van de patiënten had NPM1 mutaties, 17.8% had FLT3 mutaties en 3.5% had CEBPA mutaties. In de groep met een normaal karyotype vertoonden respectievelijk 44% van de AML patiënten NPM1 mutaties, 20% FLT3 mutaties en 4.2% CEBPA mutaties. Significante associaties werden zowel gevonden tussen het risico op herval of overlijden en de aanwezigheid van een NPM1 mutatie en FLT3 mutatie vooral in de groep met een normaal karyotype. De aanwezigheid van een CEBPA mutatie bleek geen significante impact te hebben op de prognose van de AML patiënten. De oorzaak hiervan lag bij de lage frequentie van de CEBPA mutatie in onze steekproef. Conclusie Onze resultaten tonen aan dat naast leeftijd en cytogenetische risico classificatie, moleculaire genetische merkers klinisch significante factoren zijn m.b.t. herval en overleving. Dit heeft een impact op het klinisch beleid van patiënten met cytogenetisch normaal karyotype, niet alleen wat hun prognosebepaling betreft, maar ook wat de selectie van een aangepaste therapie betreft.

9 Hoofdstuk 1 Inleiding In dit inleidende hoofdstuk wordt de relevantie van deze thesis geschetst. We bespreken vooreerst wat acute leukemie inhoudt, hoe acute myeloïde leukemie (AML) wordt gediagnosticeerd en onderverdeeld in prognostische risicogroepen. Hiertoe is het aangewezen enkele aspecten omtrent de moleculaire prognostische markers van de leukemische cellen te verhelderen. Deze worden in toenemende mate geanalyseerd en gebruikt om de therapie voor elke AML patiënt individueel te bepalen. 1.1 Acute myeloïde leukemie Definitie Acute leukemie is een heterogene groep van hematologische maligniteiten, gekenmerkt door een toegenomen aantal klonale cellen met een maturatie defect op verschillende stadia in de hematopoïetische differentiatie (1.1). Het immature karakter van deze voorlopercellen onderscheidt acute van chronische leukemie, waar bij deze laatste een proliferatie van mature cellen gezien wordt. Acute leukemie kan ingedeeld worden volgens twee cellijnen, namelijk de lymfatische cellijn en de myeloïde cellijn. Bij de normale differentiatie, ontstaan uit de lymfatische cellijn B-cellen, T-cellen en NK-cellen. De myeloïde cellijn staat in voor de vorming van granulocyten, monocyten, erytrocyten en megakaryocyten (1.1). Bij AML is de differentiatie en proliferatie van myeloïde voorlopercellen gestoord. De accumulatie van leukemische blasten in het beenmerg onderdrukt de groei en maturatie van cellen nodig voor de normale hematopoïese [2]. Dit heeft als gevolg dat de normale productie van erytrocyten, trombocyten en leukocyten in het gedrang komt. De symptomen te wijten aan deze cytopenie omvatten aldus moeheid, kortademigheid, bloedingsneiging en een toegenomen risico op infectie. Zonder therapie leidt AML tot een vroegtijdig overlijden binnen de 6 maand [3]. 2

10 Hoofdstuk 1. Inleiding 3 Figuur 1.1: Schematische weergave van de differentiatie van lymfatische en myeloïde cellen [1] Incidentie en mortaliteit De incidentie van AML is de laatste jaren gestabiliseerd en bedraagt wereldwijd 3,7 per personen [4]. Deze incidentie is leeftijdsgebonden en vertoont kenmerkend twee pieken, enerzijds in vroege kindertijd en anderzijds op oudere leeftijd. Wereldwijd bevindt de grootste incidentie van AML zich in de groep van de oudere mensen [5]. AML is in kleine mate vaker voorkomend bij mannen dan bij vrouwen met een man:vrouw ratio van 3:2 [6]. Onbehandeld leidt AML zonder uitzondering tot de dood. De gemiddelde overleving zonder behandeling is enkele weken tot enkele maanden. Zelfs na behandeling overleeft slechts 30-40% van alle AML patiënten, aangezien de meeste patiënten hervallen [3]. De mortaliteit is leeftijds-afhankelijk en bedraagt 2.7 tot bijna 18 per personen [4]. De incidentie blijkt ook te variëren naargelang de bevolkingsgroep. De incidentie van AML is hoger bij blanke mensen dan bij Hispano-Amerikanen en Afro-Amerikanen [7]. AML komt in deze laatste groep op jongere leeftijd voor in vergelijking met blanke mensen en gaat gepaard met een kortere overlevingsduur [5] Risicofactoren Er zijn een aantal factoren die het ontstaan van AML bevorderen of in de hand kunnen werken. Dit gebeurt via het toebrengen van schade en wijzigingen aan het dubbelstrengig DNA. Ongewilde bloot-

11 Hoofdstuk 1. Inleiding 4 stelling aan chemische stoffen zoals benzeen en ioniserende straling blijkt geassocieerd te zijn met een hoger risico op het ontstaan van AML [8]. Infectie met retrovirussen die bij de pathogenese van lymfatische leukemie een invloed blijkt te hebben, speelt bij AML geen rol. Wel blijkt elke vorm van chronische inflammatie, waaronder infecties en auto-immuunziekten, geassocieerd te zijn met een tweevoudig hoger risico op AML [9]. Naast deze omgevingsfactoren, blijkt vooral een voorgeschiedenis van radiotherapie of chemotherapie een belangrijke rol te spelen in het ontstaan van secundaire AML. Deze therapieën worden toegepast in de behandeling van primaire maligniteiten (borstkanker, non-hodgkin lymfoom) en bezitten mutagene eigenschappen. Als gevolg van chemotherapie kunnen patiënten secundair een AML ontwikkelen, typisch 3 à 5 jaar na behandeling. Vaak gaat hier eerst een voorgeschiedenis van een myelodysplastisch syndroom (MDS) aan vooraf [10]. In het geval van radiotherapie blijkt dit risico blijkt vrij klein te zijn. Dit risico is voornamelijk geassocieerd met de leeftijd van de patiënt en dosissen van meer dan 20 Gray [11]. Bovendien zijn er een aantal familiale aandoeningen geassocieerd met een toegenomen incidentie van AML zoals de familiale RUNX1 mutaties [12]. Ook bepaalde genetische syndromen, zoals trisomie 8 en 21 of syndromen met een stoornis in het DNA-herstel zoals Fanconi resulteren in een verhoogd risico voor AML [13]. Terwijl omgevings- en erfelijke factoren weldegelijk een rol spelen in het ontstaan van AML, moet benadrukt worden dat het merendeel van de patiënten met de novo AML geen voorgeschiedenis heeft van deze risicofactoren en dat de etiologische factoren die bijdragen aan de ontwikkeling van AML vooralsnog onbekend blijven [9] Pathogenese De normale hematopoïese is een goed gereguleerd proces dat gecontroleerd wordt door groeifactoren en nucleaire transcriptiefactoren. Deze groeifactoren zorgen voor een gecontroleerde celproliferatie terwijl de nucleaire transcriptiefactoren de cellijn specifieke differentiatie sturen [14]. AML is een heterogene ziekte waarbij verschillende genetische afwijkingen aan de basis liggen. Deze afwijkingen kunnen op verschillende wijze bijdragen aan de maligne transformatie van een cel door invloed uit te oefenen op de signaalwegen betrokken bij celgroei, differentiatie en celdood [15]. Veel genetische afwijkingen zorgen voor een ontregelde functie van transcriptiefactoren die kritisch zijn voor de normale hematopoïese [16]. Specifieke chromosomale translocaties en inversies hebben twee grote gevolgen: enerzijds kunnen de regulatoire sequenties van een gen naast een proto-oncogen komen te liggen waardoor dat geactiveerd wordt. Anderzijds kunnen chromosomale translocaties en inversies leiden tot de vorming van fusiegenen. Deze kunnen de transcriptie van kritische genen verhinderen of verhogen door een wijziging in de epigenetische regulatie. De resulterende fusie eiwitten kunnen binden op het DNA en zorgen voor een DNA methylatie en histoneiwit modificatie waardoor

12 Hoofdstuk 1. Inleiding 5 transcriptie verhinderd wordt. [17]. Dit veroorzaakt een differentiatiestop en een abnormale proliferatie en/of overleving. Puntmutaties van transcriptiefactoren worden eveneens waargenomen bij leukemie. Data suggereren dat mutaties die de proliferatie en overlevingsfuncties van voorlopercellen wijzigen, samenwerken met de mutaties van de transcriptiefactoren [16]. Dit verklaart waarom sommige mutaties vaak samen voorkomen terwijl andere mutaties nooit samen worden gevonden. Mutaties die namelijk op hetzelfde biologische pad aangrijpen, zullen niet samen voorkomen aangezien daar geen selectievoordeel uit voortvloeit [18]. Uit recente studies blijkt differentiële microrna (mirna) expressie ook betrokken te zijn in de pathogenese van AML. mirna s zijn niet-coderende RNA s met een lengte van nucleotiden. Ze reguleren genexpressie door te binden met complementaire sequenties op messenger RNA (mrna) transcripten, wat resulteert in onderdrukking van de translatie of tot een versnelde degradatie [19]. Bijgevolg kan downregulatie of overexpressie van mirna de functie van oncogenen of tumorsupressor genen in grote mate bepalen [20] Het bekomen resultaat van bovenstaande mechanismen is een differentiatiestop en een abnormale proliferatie en/of overleving. Dit leidt tot leukemie Leukemische stamcellen Hematopoïetische stamcellen (HSC) zijn multipotent en hebben het vermogen zich te differentiëren tot specifieke cellijnen. De hematopoïetische stamcellen hebben drie basisfuncties: zij verblijven in de G0 rustfase, bezitten het vermogen tot zelfvernieuwing (wat de productie van additionele stamcellen toelaat) en kunnen differentiëren tot cellijnspecieke voorlopercellen [18]. Hematopoiëtische stamcellen vertonen een karakteristiek celoppervlakte antigen (CD34), en kunnen verder onderverdeeld worden door de expressie van bijkomende celoppervlakte antigenen, inclusief CD38 en HLA-DR [21]. De oorsprong van AML ligt in een zeldzame populatie van leukemische stamcellen (LSC) met analoge eigenschappen als de HSC s [3]. Gebaseerd op de uniformiteit van het LSC fenotype, wordt vastgesteld dat de mutaties die verantwoordelijk zijn voor de leukemische transformatie en progressie zich voordoen in de primitieve cellen en niet in de cellijn specifieke voorlopercellen. Fenotypische en functionele analysen tonen aan dat de meeste LSC s in het CD34+ CD38- compartiment resideren, naast de normale HSC s [21]. Dit resultaat was consistent, onafhankelijk van het AML subtype, de lijnmerkers of het percentage van leukemische blastcellen die CD34+ waren [21]). LSC s zitten voornamelijk in het ruststadium van de cyclus. Dit verklaart waarom chemotoxische stoffen die inwerken op delende cellen, in staat zijn om de meeste AML blasten uit te roeien maar niet de LSC s uit te roeien. Het voortbestaan van deze leukemische stamcellen verklaart het herval na een eerder bereikte remissie [3].

13 Hoofdstuk 1. Inleiding Diagnose De diagnose van AML en de prognose voor de patiënt kunnen op verschillende manieren gebeuren waarbij morfologie, cytologie, immunofenotypering, cytogenetica en moleculaire diagnostiek een aandeel hebben. De diagnose wordt in de eerste plaats microscopisch gesteld. Hierbij worden in het bloed of beenmerg meer dan 20% myeloïde blasten gezien. Pathognomonisch, maar slechts aanwezig in 25% van de gevallen, is de aanwezigheid van Auer staafjes. Figuur 1.2: Auerstaaf, overgenomen van [22] De myeloïde kan bewezen worden door MPO aan te tonen via een immunohistochemische kleuring of via flowcytometrie. De flowcytometer maakt gebruik van specifieke oppervlakte merkers, en kan op deze manier het fenotype van de ziekte bepalen: cytoplasmatisch (Cy) CD3 voor T-cellen, CD19 voor B-cellen en myeloperoxidase (MPO) voor myeloïde cellen. In tweede lijn worden een uitgebreide reeks van CD-merkers gebruikt om het fenotype van de AML te bepalen. De voorlopers en mature cellen brengen namelijk op hun celmembraan merkers tot expressie die doorheen de ontwikkeling van de cellen kunnen wijzigen [23]. Een overzicht van de expressie van de verschillende merkers gedurende de myelöïde uitrijping is terug te vinden in 1.1. Panmyeloïd Merkers voor granulocytaire maturatie Monocytaire differentiatie Erythroïde merkers Megakaryocytaire merkers Expressie van onrijpe merkers CD13 CD33 CD117 CD65 anti-mpo CD15 CD11b CD14 CD11b CD64 CD36 CD71 CD105 CD41 CD42a CD42b CD61 CD34 Tdt Tabel 1.1: Myeloïde antigenen

14 Hoofdstuk 1. Inleiding Classificatie Op basis van het uitrijpingsstadium (morfologisch) kan een classificatie gemaakt worden. Vroeger werd vooral gebruik gemaakt van de French-American-British (FAB) classificatie (1.2). Deze FAB classificatie maakte een onderscheid tussen 8 verschillende AML subtypes (M0-M7) op basis van de morfologische en cytochemische kenmerken. M0 M1 M2 M3 M4 M4eo M5 M6 M7 FAB classificatie Acute myeloïde leukemie met minimale evidentie tot myeloïde differentiatie Acute myeloblastische leukemie zonder maturatie Acute myeloblastische leukemie met maturatie Acute promyelocytaire leukemie Acute myelomonocytaire leukemie Acute myelomonocytaire leukemie met eosinofilie Acute monocytaire/monoblastische leukemie Acute erythroleukemie Acute megakaryoblastische leukemie Tabel 1.2: De onderverdeling van AML volgens morfologie Hoewel de FAB-classificatie de morfologische heterogeniteit van AML erkent, weerspiegelt het niet altijd de genetische of klinische diversiteit van de ziekte [10]. In sommige gevallen, zoals acute promyelocytaire leukemie (APL) en acute myelomonocytaire leukemie met abnormale eosinofielen (M4Eo) voorspellen de morfologische karakteristieken de genetische afwijkingen. Sommige FAB subgroepen zijn ook gecorreleerd met een specifieke pathologie of klinische karakteristieken. Zo blijkt FAB M3 gepaard te gaan met een gedissemineerd intravasculaire coagulatie (DIC). Dit geldt echter niet voor de meeste AML gevallen. Daarom wordt steeds meer geopteerd voor de WHO classificatie. De World Health Organization (WHO) 2008 classificatie van hematologische maligniteiten baseert zich op specifieke chromosomale afwijkingen en hun moleculaire tegenhangers, samen met de morfologie, immunofenotypische en klinische gegevens [24]. Drie unieke subgroepen van AML worden erkend in de WHO-classificatie: (1) AML met recurrente genetische afwijkingen, (2) AML met multilineage dysplasie gerelateerde aandoeningen (3) therapie gerelateerde AML en MDS. Gevallen die niet aan de criteria voldoen voor elk van deze subgroepen, of waarvoor geen genetische data kan verkregen worden, moeten geclassificeerd worden als één van de entiteiten van de vierde subgroep: (4) AML, niet anders gespecificeerd (1.3).

15 Hoofdstuk 1. Inleiding 8 (1) AML met recurrente genetische afwijkingen (2) AML met MDS gerelateerde veranderingen (3) Therapie gerelateerde AML en MDS (4) AML niet anders gespecificeerd WHO classificatie AML herschikkingen [t(8;21)(q22;q22)], RUNX1/RUNX1T1 AML met een inversie in chromosoom 16 [inv(16)(p13;q22)], CBFB/MYH11 APL met herschikkingen tussen chromosoom 15 en 17 [t(15;17)(q22;q21)], RARA/PML AML herschikkingen tussen chromosoom 9 en 11 [t(9;11)(p22;q23)], MLLT3/MLL AML herschikkingen tussen chromosoom 6 en 9 [t(6;9)(p23;q34)], DEK/NUP214 AML met een inversie in chromosoom 3 [inv(3)(q21;q26)], RPN1/EVI1 AML herschikkingen tussen chromosoom 1 en 22 [t(1;22)(p13;q13)] Deze categorie bevat de patiënten met een voorgeschiedenis van een myelodysplastisch syndroom (MDS) of een myeloproliferatieve ziekte (MPD) die geëvolueerd is in een AML. Deze categorie bevat de patiënten die een voorgeschiedenis hebben van voorafgaande chemotherapie en/of radiatie en vervolgens AML of MDS ontwikkelden. Bevat alle subtypen die niet aan bod komen in de hier boven besproken categorieën. Deze worden verder onderverdeeld op basis van morfologie, gelijkaardig aan het vroegere FAB classificatie systeem. Tabel 1.3: Indeling van AML volgens WHO classificatie (2008) Deze classificatie erkent twee karakteristieke subgroepen met verschillende biologische kenmerken: (1) AML die evolueert uit MDS of gelijkaardige kenmerken heeft met deze die in MDS worden gevonden en (2) AML die de novo ontstaat zonder significante myelodysplastische eigenschappen [24]. Het nut van deze classificatie schuilt in het feit dat we het natuurlijk verloop van de ziekte in zekere mate kunnen voorspellen, alsook de genezing en overlevingskansen, de complicaties en de frequentie van recidieven. Met andere woorden, het stelt ons in staat om een aangepaste therapie te kiezen [24]. De categorie van AML met recurrente genetische afwijkingen is uitgebreid door toevoeging van twee voorlopige entiteiten, namelijk NPM1 of CEBPA mutatie. Deze veranderingen hebben in grote mate de aanpak van diagnose en prognostische stratificatie van AML patiënten gewijzigd [24] Prognose De prognose van AML is zeer heterogeen. Er zijn verscheidene klinische en biologische parameters voorhanden met een voorspellende waarde bij de diagnosestelling. De belangrijkste prognostische merkers zijn de leeftijd, het type AML (de novo of secundair), de cytogenetische afwijkingen, de functionele toestand van de patiënt of comorbiditeiten, de witte bloedcel (WBC) telling en het blastenpercentage na inductie van de chemotherapie.

16 Hoofdstuk 1. Inleiding 9 De AML gediagnosticeerd bij oudere patiënten is vaak secundair geëvolueerd uit een vroegere hematologische stoornis (secundaire AML na myelodysplastisch syndroom). Hierdoor bezitten de leukemische blasten in vele gevallen een ongunstige cytogenetica met een verlies aan genetisch materiaal, en een verhoogde expressie van multidrug resistentie (MDR1) eiwitten. Deze kenmerken zijn bijgevolg geassocieerd met een grotere resistentie tegen therapie [25]. De novo en secundaire AML hebben een verschillend mechanisme van pathogenese en aldus verschillende karakteristieken. MDS-gerelateerde leukemie wordt geassocieerd met dysplasie van verschillende cellijnen, een hoog risico karyotype dat vaak een verlies aan genetisch materiaal omvat, en een zwakke therapie-respons. De incidentie van dit type neemt toe met de leeftijd, wat overeenstemt met de hypothese dat MDS en MDS-gerelateerde leukemie ontstaan door langdurige en veelvuldige schade aan de genetische constitutie van de hematopoïetische stamcellen. De novo AML daarentegen is voornamelijk geassocieerd met bepaalde recurrente chromosomale afwijkingen en een cytogenetisch normaal karyotype. Dit type van leukemie heeft een relatief constante incidentie gedurende het leven en is het type dat het vaakst wordt waargenomen bij kinderen en jongvolwassenen. Een hoge witte bloedcel telling (> WBC/ mm3) heeft een negatief prognostische impact [2]. Hyperleukocytose (> 100,000 WBC/mm3) treedt op bij 5% to 30% van de volwassen AML patiënten [26]. Hierbij kan leukostase optreden. De meest gevreesde complicaties zijn respiratoir falen en intracraniële bloedingen. Dit komt vaker voor bij FAB M3-M5 en de 11q23 herschikkingen (MLL-AML). Lactaat dehydrogenase (LDH) is een biochemische merker voor tumor belasting. Verhoogde waarden op het moment van de diagnose houden een slechte prognose in [27]. Studies wijzen op het belang van LDH in de opvolging van leukemie, aangezien verhoogde waarden een hogere kans op herval na bereikte remissie voorspellen [27] Behandeling Behandeling van AML is, zoals de behandeling van de meeste maligniteiten, gebaseerd op het vernietigen van zoveel mogelijk maligne cellen. Op basis van de algemene toestand van de patiënt en de besproken prognostische risicofactoren worden de patiënten onderverdeeld in risicogroepen en krijgen op deze manier de meest passende behandeling [28]. Standaard behandelingen voor AML zijn ondermeer chemotherapie, radiotherapie en stamceltransplantatie. Doelgerichte therapieën zoals monoklonale antilichamen en moleculaire inhibitoren worden ook geëvalueerd in klinische trials voor de behandeling van AML. De primaire aanpak bestaat uit toedienen van inductie chemotherapie. Door de inductietherapie probeert men een complete remissie te verkrijgen, wat wil zeggen dat er na afloop van deze therapie niet meer dan 5% blasten in het beenmerg gedetecteerd mogen worden. Deze fase wordt gevolgd door een

17 Hoofdstuk 1. Inleiding 10 consolidatie behandeling om de complete remissie te behouden [29]. Hoewel deze aanpak voor het merendeel van de patiënten voor remissie zorgt, is herval frequent en de lange termijn overleving blijft laag. Aangezien veel patiënten hervallen, zullen sommigen onder hen geselecteerd worden voor een autologe stamceltransplantatie. Allogene stamceltransplantatie wordt niet zo vaak toegepast vanwege de hoge belasting en het hoge risico. Enkel patiënten met een slechte prognose komen hiervoor in aanmerking [10]. Recent werd de focus verplaatst naar wat in de literatuur de targetted therapie of doelgerichte therapie wordt genoemd. Tot deze groep behoren nieuwe middelen zoals monoklonale antilichamen tegen celoppervlakte epitopen en de groep van kleine moleculen zoals tyrosine kinase remmers en proteasoom inhibitoren [30]. Voorbeelden van doelwitten zijn ondermeer groeifactoren, celcycluseiwitten, signaaltransductie moleculen en angiogenese remmers [3]. 1.2 Moleculaire en cytogenetische heterogeniteit in AML De toepassing van gen- en RNA- profilering hebben genoomwijde expressie profielen geïdentificeerd die ons in staat stellen nieuwe biologische en/of prognostische subgroepen te maken [31]. Toekomstige bevindingen zullen hoogstwaarschijnlijk een grote invloed hebben op het klinisch beleid van AML omdat vele van de geïdentificeerde moleculaire afwijkingen niet alleen onafhankelijke prognostische merkers vertegenwoordigen, maar ook kunnen bijdragen tot nieuwe doelwitten voor specifieke therapeutische interventies. Deze cytogenetische en moleculaire afwijkingen in AML en hun klinische implicaties worden hiernavolgend in detail besproken Cytogenetische afwijkingen Cytogenetische afwijkingen bestaan uit numerieke en structurele afwijkingen. In deze laatste groep kan een verder onderscheid gemaakt worden tussen gebalanceerde afwijkingen waarbij geen zichtbare winst of verlies van genetische informatie optreedt en ongebalanceerde afwijkingen waarbij genetische informatie verloren gaat [32]. De frequentie van AML met gebalanceerde afwijkingen neemt toe met de leeftijd en dekt alle leeftijdsgroepen. Daarentegen, AML met ongebalanceerde afwijkingen komt zelden voor de leeftijd van 40 jaar voor. Studies wijzen erop dat AML met gebalanceerde afwijkingen ontstaat uit rijpere cellijn-specifieke hematopoïetische voorlopercellen en geassocieerd zijn met deregulatie van transcriptiefactoren [33]. Dit leidt tot een stop in de differentiatie. Daartegenover ontstaat AML met ongebalanceerde afwijkingen uit vroege pluripotente hematopoïetische stamcellen en wordt gekenmerkt door het verlies van genen die resulteren in een verstoorde celcyclus, verstoord DNA herstel en apoptose [34]. De gebalanceerde translocaties worden hieronder verder besproken ( ). Ongebalanceerde translocaties hebben een zeer variabel spectrum aan breukpunten i.t.t. de recurrente

18 Hoofdstuk 1. Inleiding 11 gebalanceerde translocaties. Hun respectievelijke winst of verlies aan chromosomaal materiaal plaatst ze samen met de andere genetische ongebalanceerde afwijkingen zoals chromosomale deleties in de prognostisch ongunstige risicogroep [35] Translocaties In onderstaande tabel (1.4) worden de meest voorkomende gebalanceerd chromosomale translocaties in AML belicht en de fusiegenen die hierdoor ontstaan [36]. Cytogenetische afwijkingen t(8;21)(q22;q22) Inv(16)(p13;q22) t(15;17)(q22;q21) t(6;9) (p23;q34) 11q23 afwijkingen inv(3)(q21q26) (of t(3;3)) Betrokken genen ETO/AML1 of RUNX1-RUNX1T1 MYH11/CBFbeta PML/RARAalfa DEK/CAN (MLL) AF9/MLL en andere RPN1/EVI1 Tabel 1.4: Chromosomale afwijkingen bij AML Vooreerst worden de drie meest frequente translocaties besproken die door hun gunstige prognose in dezelfde risico groep worden gestoken, namelijk t(8;21)(q22;q22)), t(15;17)(q22;q21) en inv(16)(p13;q22) [36]. De translocaties met een minder goede prognose namelijk t(6;9)(p23;q34), t(3;3)(q21q26) of inv(3) zullen niet verder besproken worden. AML met MLL herschikkingen daarentegen komen wel aan bod. t(8;21)(q22;q22) De gebalanceerde translocatie t(8;21)(q22;q22) heeft een frequentie van 7 % bij AML patiënten en is relatief frequent bij kinderen met AML ([37]). Deze translocatie juxtaposeert het runt-related transcriptie factor 1 (RUNX1) gen op chromosoom 21 met het runt-related transcription factor 1; translocated to RUNX1T1 gen op chromosoom 8. Hierbij wordt het RUNX1-RUNX1T1 fusie gen gevormd, dat vroeger gekend was onder de benaming AML1/ETO [38]. In normale omstandigheden vormt het RUNX1 eiwit een heterodimeer met een ander eiwit, het core binding factor beta (CBFB). Deze twee eiwitten vormen samen de transcriptiefactor RUNX1/CBFB. De RUNX1/CBFB transcriptiefactor bindt rechtstreeks met een aantal genen

19 Hoofdstuk 1. Inleiding 12 die kritisch zijn voor de hematopoïetische stamcel en voorloper celgroei, differentiatie en functie. RUNX1T1 op zijn beurt is een transcriptie regulator die transcriptie verhindert door histon eiwit modificatie en het binden van transcriptie factoren [2]. Het chimere eiwitproduct RUNX1-RUNX1T1 zal met deze doelwitgenen binden, maar transcriptie verhinderen. Dit leidt tot een differentiatiestop van de hematopoïetische voorlopercellen, voornamelijk van de myelocytaire cellijn (FAB subgroep M2) [19]. inv(16)(p13.1q22) of t(16;16)(p13.1;q22) De gebalanceerde translocatie inv(16)(p13.1q22) of t(16;16)(p13.1;q22) (vroeger acute myelomonocytic leukemia met eosinifiele component, FAB M4Eo) vindt men terug in ongeveer 7% [37]. Het inversie breukpunt op chromosoom 16q22 vindt plaats op het einde van de coderende regio van het CBFB gen, welke codeert voor een subunit van de heterodimere RUNX1/CBFB transcriptiefactor. Deze transcriptiefactor reguleert de transcriptie van genen belangrijk voor de myeloïde celgroei, differentiatie en functie. Het CBFB gen vormt na translocatie een fusiegen met het myosin, heavy chain 11, smooth muscle (MYH11) gen dat in normale omstandigheden codeert voor bestanddelen van spiereiwitten [39]. Het fusie eiwit CBFB-MYH11 zal geen transcriptie meer kunnen realiseren. AML met inv(16) toont kenmerkend monocytaire and granulocytaire differentiatie met abnormale eosinofielen in het beenmerg. t(15;17)(q24.1;q21.1) De gebalanceerde translocatie t(15;17)(q24.1;q21.1) komt voor in ongeveer 10% van de AML. Het breukpunt op chromosoom 17 vindt plaats binnen het eerste intron van de retinoïnezuur receptor alpha (RARA) gen, terwijl de breuk op chromosoom 15 plaatsvindt in het promyelocytaire leukemie (PML) gen [32]. Het RARA gen codeert voor de transcriptiefactor RARα terwijl het PML gen een functie heeft als een tumorsupressor gen dat proliferatie verhindert en apoptose induceert. De translocatie resulteert in een PML-RARA fusiegen dat het merendeel van de PML coderende sequenties bevat samen met de DNA bindende domeinen van het RARA gen. Het PML-RARA fusie eiwit heeft een lagere gevoeligheid voor retinoïnezuur waardoor transcriptie onderdrukt wordt. Deze verminderde transcriptie verhindert de differentiatie van promyelocyten [21]. Dit leidt tot een acute promyelocytaire leukemie (APL) (vroeger AML FAB type M3). De differentiatie stop kan omzeild worden door hoge farmacologische dosissen van het all-trans retinoïnezuur (ATRA) waardoor de genen alsnog tot expressie kunnen gebracht

20 Hoofdstuk 1. Inleiding 13 worden en op deze manier ook de differentiatie voltooid wordt [6]. MLL Mixed-lineage leukemie (MLL) herschikkingen zijn frequent. Ongeveer 3-10% van de AML patiënten hebben MLL translocaties. Het MLL gen, dat zich op het chromosoom 11q23 bevindt, codeert voor MLL eiwitten die de genexpressie en celcyclus-controle reguleren via chromatinemodificatie. Deze eiwitten reguleren de expressie van de homeobox (HOX) genen. HOX genen zijn een groep van transcriptiefactoren die betrokken zijn in de ontwikkeling van celdifferentiatie bij zoogdieren en ook een kritische rol spelen in de hematopoïese. MLL fusie eiwitten zijn niet meer in staat deze gen expressie correct te reguleren. Overexpressie van HOX genen resulteert in een toegenomen aantal zelfvernieuwende hematopoïetische stamcellen en een verminderde differentiatie. Translocaties van 11q23 hebben betrekking op meer dan 60 verschillende chromosomale partner loci. MLL herschikkingen zijn de frequentste cytogenetische afwijkingen (25%) bij secundaire AML dat ontstaat na het gebruik van DNA topoisomerase inhibitoren zoals etoposide. Bovendien zijn MLL herschikkingen ook de meest voorkomende recurrente cytogenetische afwijkingen (70%) bij leukemie op kinderleeftijd [10], dit in tegenstelling tot volwassen leukemie, waar minder dan 10% van de gevallen een MLL herschikking hebben. Het wordt frequenter gevonden bij acute lymfatische leukemie (ALL) dan bij AML. MLL herschikkingen komen bij 15-20% voor bij kinderen met AML en bij 3% van de volwassenen met AML. De meest frequente translocaties bij ALL zijn t(4;11)(q21;q23) en t(11;19)(q23;p13), maar bij AML komen andere translocaties vaker voor. Ongeveer 50% van de pediatrische AML met een MLL herschikking bestaat uit een translocatie t(9;11)(p22;q23) tussen chromosoom 9 en 11. De andere 50% bestaat voornamelijk uit t(6;11)(q27;q23), t(10;11)(p12;q23) en t(11;19)(q23;p13). Volwassen AML patiënten hebben ongeveer dezelfde distributie van translocaties met uitzondering van t(6;11)(q27;q23), dat een relatief hogere frequentie heeft in volwassen AML [40]. De translocatie partners blijken in 2 functionele categorieën te vallen: genen die coderen voor signaalmoleculen die normaal gelokaliseerd zijn in het cytoplasma en genen die coderen voor nucleair factoren betrokken in verschillende aspecten van de transcriptie regulatie [41]. De prognose voor zowel de novo als secundaire leukemieën met MLL herschikkingen zijn gerelateerd aan een intermediaire tot slechte overleving afhankelijk van de translocatiepartners [40].

21 Hoofdstuk 1. Inleiding Andere cytogenetische afwijkingen Verlies van chromosoom 7 en verlies van chromosoom 5 zijn karakteristiek voor therapie- gerelateerde AML door chemo- of radiotherapie. Ook deleties van de korte arm van chromosoom 17 worden frequent gevonden in AML, vaak als deel van een ongebalanceerde translocatie met chromosoom 5, wat resulteert in een dicentrisch chromosoom (5;17). De 17p deletie heeft vaak een verlies van het tumor suppressor gen TP53 tot gevolg. Het merendeel van deze cytogenetica wordt in de ongunstige risicogroep gestoken Prognostische indeling Op basis van prognose kunnen de hierboven besproken karyotypen ingedeeld worden in drie groepen (1.5). De drie meest frequente translocaties t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21) en inv(16)(p13;q22) komen voor bij ongeveer 10-15% van de patiënten, meestal jonger dan 60 jaar. Deze hebben een relatief goede prognose met lange termijn overleving en potentiële genezing in ongeveer 60-80% van de gevallen [36]. Translocaties met een slechte prognose zoals inv(3)(q21q26) of t(3 ;3), t(6;9)(p23;q34), t(v ;11) en MLL herschikkingen worden ingedeeld in de groep met ongunstige prognose. AML zonder detecteerbare afwijkingen of andere cytogenetische wijzigingen vormen de groep met intermediaire prognose in welke een lange termijn overleving wordt behaald in ongeveer 25-30% van de gevallen [34]. Gunstig Intermediair Ongunstig Karyotype volgens prognostische indeling t(8 ;21)(q22 ;q22), t(15;17)(q22;q21), inv(16)(p13.1 ;q22) or t(16 ;16)(p13.1 ;q22) t(9 ;11)(p22 ;q23) Inv(3)(q21 ;q26.2) of t(3 ;3)(q21 ;q26.2), t(6 ;9)(p23 ;q34), t(v ;11)(v ;q23), MLL herschikkingen, -5 or del(5q), -7 ; abnl(17p), complex karyotype Tabel 1.5: Indeling van de karyotypen in drie grote groepen volgens prognostische significantie Genmutaties Bij 40% van de AML patiënten worden geen cytogenetische afwijkingen gevonden (cytogenetisch normale (CN)-AML)). Verschillende studies hebben het belang van mutaties bij AML aangetoond [42] [43]. Deze mutaties bestaan uit puntmutaties, deleties en inserties. Ondertussen is al een waaier aan moleculaire veranderingen geïdentificeerd waaronder mutaties in het Nucleofosmine-1 (NPM1) gen, het fms-related tyrosine kinase 3 (FLT3) gen, het CCAAT/enhancer-binding protein

22 Hoofdstuk 1. Inleiding 15 alpha (CEBPA) gen, mutaties van het Wilms Tumor 1 gen (WT1) duplicaties in het mixed lineage leukemia (MLL) gen en nog vele anderen. Deze moleculaire merkers worden hierna verder in detail beschreven. Een tabel van de meest frequente moleculaire merkers is terug te vinden in (1.6) NPM1 Definitie en incidentie Het nucleofosmine1 (NPM1) gen codeert voor een NPM1eiwit dat voornamelijk in de nucleolus gelokaliseerd is waar het verschillende functies uitoefent ([44]). Het werkt samen met tumorsupressor p53 in de controle van celproliferatie en apoptose. Daarnaast speelt het een rol in het DNA herstel en de biogenese van ribosomen. Het NPM1 gen behoort tot de nieuwe categorie van genen die zowel als oncogen of als tumorsupressor kunnen functioneren. Dit is afhankelijk van de gen-dosering, de mate van expressie en de interagerende partners [43]. Mutaties in dit gen zijn zeer frequent bij AML en worden bij ongeveer 30% van de volwassen en bij 6-8% van de kinderen met AML gevonden [45]. Het komt vaker voor bij AML patienten met een normaal karyotype (50-60%), typisch met een FAB M4 morfologie[19]). Bij deze patienten wordt een sterke correlatie gevonden tussen NPM1 mutaties en FLT3-ITD mutaties (zie ). Leukemische blastcellen met deze mutatie vertonen een lage tot afwezige CD34 expressie. Er is een hogere prevalentie in het vrouwelijk geslacht. Er bestaat een sterke associatie met FLT3- interne tandem duplicaties (ITD) mutaties in patiënten met een normaal karyotype. NPM1 mutaties zijn zo goed als afwezig in de recurrente chromosomale afwijkingen t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21) en inv(16)(p13;q22) alsook in andere cytogenetische wijziginen. Bovendien komen mutaties in het NPM1 gen zelden voor bij AML met CEBPA mutaties [46]. Pathogenese NPM1 is voornamelijk gelokaliseerd in de nucleolus. Het vergemakkelijkt het transport van ribosomale eiwitten doorheen het nucleair membraan. Een stoornis van NPM1 resulteert in een cytoplasmatische locatie van het NPM eiwit. Hierdoor kan het eiwit zijn functie niet meer uitoefenen wat leidt tot een ontregeling van de myeloïde cellen [43]. Er zijn verscheidene varianten van de NPM1 mutatie, maar bijna allen bestaan ze uit een insertie van 4 baseparen in exon 12 van het gen. Dit resulteert in een eiwit met een gewijzigde C-terminus [45]. Ondertussen zijn er reeds 50 varianten beschreven. Prognose NPM1 mutaties zijn geassocieerd met complete remissie en een relatief gunstige prognose, behalve in aanwezigheid van een bijkomende FLT3-ITD mutatie. Op basis van deze observatie werd AML met gemuteerd NPM1 mutatie in afwezigheid van FLT3- ITD mutatie recent verplaatst naar de gunstige risico groep. Bijgevolg worden jonge volwassenen met

23 Hoofdstuk 1. Inleiding 16 dit genotype behandeld met standaard chemotherapie. Zij zullen geen baat hebben bij een allogene stamceltransplantatie [47] FLT3 Definitie en incidentie Het Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) gen codeert voor een type III receptor tyrosine kinase die de hematopoiëse reguleert. De receptor bestaat uit een extracellulair domein, een transmembranair domein en een cytoplasmatische kinase domein dat op zijn beurt uit twee delen bestaat. De receptor wordt geactiveerd door binding van het FLT3 ligand op het extracellulair domein. De geactiveerde receptor kinase zal vervolgens verschillende cytoplasmatische effector-moleculen fosforyleren en activeren die betrokken zijn bij de apoptose, proliferatie en differentiatie van hematopoietische cellen in het beenmerg [48]. Mutaties van het FLT3-gen zijn aanwezig bij % van de volwassen en bij 5-15% van de kinderen met AML. Het hoogste percentage (40%) wordt gevonden bij patienten met een normaal karyotype. In deze groep kent de NMP1 mutatie een sterke correlatie met FLT3-ITD mutaties [14]. De mutatie wordt in mindere mate (27%) gezien bij AML patiënten met een translocatie t(15;17)(q22;q21) [49] en is eerder zeldzaam bij andere cytogenetische afwijkingen [50]. Op basis van het type mutatie wordt een onderscheid gemaakt tussen interne tandem duplicaties (ITD) enerzijds en puntmutaties, kleine inserties en deleties anderzijds. In deze laatste groep kunnen de mutaties zich in twee functionele domeinen van de receptor bevinden, namelijk het juxtamembraan (JM) domein en het tyrosine kinase domein (TKD). Dit wordt verduidelijkt in figuur 1.3. Figuur 1.3: Schematische presentatie van de FLT3 receptor, overgenomen uit [14] FLT3 interne tandem duplicaties bevinden zich voornamelijk in het JM domein. FLT3-ITD maakt het merendeel van de FLT3 wijzigingen uit, namelijk ongeveer 30 % van de volwassen AML patiënten

24 Hoofdstuk 1. Inleiding 17 met een normaal karyotype [36]. JM (2%) mutaties en TKD mutaties (5-10%) komen in mindere mate voor en hun prognostische waarde wordt nog betwist. Ze zullen bijgevolg niet meer besproken worden. FLT3 -ITD De FLT3-ITD mutaties vinden plaats in exonen 14 en 15 van het JM domein. Er wordt vermoed dat een verandering in het JM domein verantwoordelijk is voor de dimerisatie en receptor activatie. Deze duplicaties in dit domein variëren in lengte 3 tot 400 nucleotiden [14]. Figuur 1.4: FLT3 signaalwegen in AML, overgenomen uit [51] FLT3-ITD codeert voor abnormale receptoren die dimeriseren zonder de binding van een ligand (zie 1.4). Deze FLT3-ITD receptoren ondergaan niet alleen homodimerisatie, maar ook heterodimerisatie met wild type FLT3 receptoren [50]. Deze ligand-onafhankelijke receptordimerisatie wordt gevolgd door autofosforylatie en activatie van downstream signalering betrokken bij celproliferatie, differentiatie en overleving. Dit omhelst downstream proliferatieve signaalwegen zoals de Janus kinase 2 (JAK2), activatior van transcriptor 5 (STAT5) en de mitogeen geactiveerde proteïne kinase (MAPK) signaalweg. Dit resulteert in een constante expressie van cycline D1, c-myc en het anti-apoptotisch gen p21 met ongecontroleerde celgroei als gevolg (zie figuur 1.5). Prognose en invloed op behandeling AML patiënten met een FLT3-ITD mutatie hebben een ongunstige prognose. Ze reageren minder goed op de standaardbehandeling met chemotherapie en hebben een hoger risico op herval [52]. Therapie van AML met FLT3-ITD mutaties is een klinisch dilemma. Gezien de zwakke resultaten na standaard chemotherapie, moeten nieuwe modaliteiten geëvalueerd worden. Allogene hematopoïetische stamcel transplantatie (HSCT) wordt aangeraden bij patiënten die een hoog risico hebben om te

25 Hoofdstuk 1. Inleiding 18 Figuur 1.5: Mechanismen van de FLT3-ITD pathogenese in AML (uit [14]) hervallen. Hoewel voldoende bewijs van klinische trials ontbreekt, moet allogene HSCT overwogen worden bij patiënten met deze mutatie die jonger zijn dan 60 jaar. Bij hen weegt de toegenomen overlevingskans op tegen de geassocieerde nevenwerkingen van HSCT [52]. Daarnaast zijn er nu ook klinische trials met een aantal verschillende orale FLT3 tyrosine kinase inhibitoren worden op dit moment geëvalueerd. Hun aandeel in de behandeling van AML blijkt tot nu toe zwak te zijn, maar ze kunnen veilig gecombineerd worden met chemotherapie [14] CEBPA Definitie en incidentie Het CCAAT enhancer binding protein alpha (CEBPA) gen is gelokaliseerd op chromosoom 19q13. Het codeert voor een leucine zipper transcriptiefactor. Mutaties in het CEBPA gen vindt men bij 5-10% van de volwassen AML patiënten en 6% van de kinderen met AML. Het komt vaker voor bij AML patiënten met het FAB subtype M1 en M2 en patiënten met een normaal karyotype (10-20%) [53]. Pathogenese AML patiënten met CEBPA mutaties kunnen verdeeld worden in 2 groepen, namelijk deze met een enkele CEBPA mutatie (1-2%) en deze met een dubbele CEBPA mutatie (4-8%). In de meerderheid van de dubbele CEBPA mutaties zijn beide allelen gemuteerd. Deze biallelische mutaties bestaan voornamelijk uit een amino- terminale mutatie op het ene allel en een carboxy- terminale mutatie op het andere allel (zie 1.6) [54].

26 Hoofdstuk 1. Inleiding 19 Figuur 1.6: Mutaties in het N-terminale deel en het C-terminale deel van het CEBPA gen [55] Het amino-terminale deel van het CEBPA eiwit bezit de transactivatie domeinen (TAD1 en TAD2) en het carboxy-terminale deel bevat de DNA bindende leucine zipper regio (LZ) betrokken in DNA binding en eiwit dimerisatie [43]. Het CEBPA eiwit kan op bepaalde promotor en enhancer regio s binden en op deze manier de proliferatie en differentiatie van verschillende cellen controleren [19]. Mutaties in TAD1 en TAD2 zullen leiden tot de expressie van een verkort eiwit. Mutaties in het LZ daarentegen verstoren de regio verantwoordelijk voor DNA binding. Hierdoor kan het eiwit zijn correcte functie als transcriptiefactor niet meer volbrengen [36]. Verstoring van de normale werking van CEBPA zorgt voor een selectieve blokkade in de vroege granulocyt ontwikkeling. Prognose In vroegere studies werden gevallen met CEBPA mutatie een gunstige prognose toegeschreven [54]. Recentere data bevestigen dat deze gunstige prognose voornamelijk geobserveerd wordt bij patiënten met dubbele CEBPA mutaties [56]. AML patiënten met een normaal karyotype en drager van een dubbele CEBPA mutatie zullen een langere overleving hebben [53]. Bovendien hebben patiënten met enkelvoudige CEBPA mutaties frequenter bijkomende mutaties in het NPM1 en het FLT3 gen dan patiënten met een dubbele CEBPA mutatie [56]. De patiënten met een enkelvoudige CEBPA mutatie hebben in aanwezigheid van FLT3 of NPM1 geen bijkomend gunstige impact. Screening voor CEBPA mutaties zou aldus beperkt moeten worden tot de groep met intermediaire risico cytogenetica waarbij geen FLT3 of NPM1 mutatie wordt gevonden. Alleen de aanwezigheid van een dubbele CEBPA mutatie zou in rekenschap moeten gebracht worden bij risicostratificatie [57] IDH1 en IDH2 Mutaties in de isocitraat dehydrogenase-1 en 2 (IDH1 en IDH2) genen zijn beschreven bij respectievelijk 8% en 19% van de AML gevallen met een normaal karyotype. Deze genen coderen voor enzymen betrokken in de energiehuishouding van de cel. Het mechanisme van hoe de IDH mutaties bijdragen aan kanker is vooralsnog onduidelijk [58].

27 Hoofdstuk 1. Inleiding 20 Beide mutaties hebben een ongunstige impact op de lange termijn overleving [58]. In tegenstelling tot IDH1 mutaties komen IDH2 mutaties zelden voor bij AML patiënten met andere cytogenetische afwijkingen. De IDH1 mutatie zorgt voor een ongunstige impact op de prognose bij AML patiënten met een NPM1 mutatie in afwezigheid van een FLT3-ITD mutatie. Bovendien wijst een studie van Takahashi et al. uit dat patiënten met een IDH1 mutatie een hoger risico op herval hebben in afwezigheid van een FLT3-ITD mutatie [14] KIT Het v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viraal oncogen homoloog (KIT) gen codeert voor een transmembranaire tyrosine kinase receptor [59]. De KIT receptor kinase speelt een rol bij de proliferatie en differentiatie van bepaalde celtypen waaronder geslachtscellen, mastcellen en de hematopoiëtische stamcellen [43]. Expressie van c-kit wordt in ongeveer 4% van deze stamcellen gevonden, waarvan 70% CD34 positief is. Bij AML komen KIT mutaties voor in 20-30% van de patiënten met een inv(16)(p13;q21) of t(8;21)(q22;q22). Aanwezigheid van deze mutatie heeft een negatieve impact op de prognose bij AML patiënten met deze normaliter gunstige cytogenetica [60]. Ze zijn mutueel exclusief met FLT3 mutaties in deze patiënten [43] MLL-PTD Hoewel de meeste genherschikkingen van het MLL gen resulteren uit chromosomale translocaties zoals besproken bij de cytogenetica van AML patiënten, komen herschikkingen van MLL gen op zichzelf voor in 5% van de AML patiënten met een normaal karyotype [61]. Deze herschikking bestaat uit een partiële tandem duplicatie (PTD) in het N-terminale deel van het MLL gen. Deze mutatie wordt frequent gezien bij gevallen met een geïsoleerde trisomie 11 en bij gevallen waarbij er sprake is van therapie gerelateerde secundaire AML [43]. MLL-PTD bestaat meestal uit een duplicatie van een genoom regio gaande van exon 5 tot 11 dat zich in het intron 4 van het MLL gen insereert. De regio codeert voor de DNA bindende domeinen van het MLL eiwit. Duplicatie van deze domeinen verhoogt de affiniteit van MLL om te binden met zijn doelwit DNA waardoor de normale functie ontregeld wordt. Anderzijds zorgt de duplicatie voor een abnormale opvouwing van het eiwit waardoor de autoregulatorische domeinen van MLL minder werkzaam zijn. De aanwezigheid van MLL-PTD zorgt voor van een dominant negatieve inhibitie van het andere wild type allel in AML blasten [61]. Het MLL-PTD bij deze patiënten is geassocieerd met een slechtere prognose [61]. AML patiënten met deze mutatie hebben een kortere complete remissie duur en ziektevrije overleving. AML patiënten met een MLL-PTD mutatie hebben frequent een bijkomende FLT3 mutatie (30-40%) terwijl geen associatie gevonden wordt met een NPM1 of CEBPA mutatie [62]. Aanwezigheid van deze FLT3 mutatie bij dragers van een MLL-PTD mutatie zorgt voor een acuut beeld van de leukemie, met ken-

28 Hoofdstuk 1. Inleiding 21 merkend een maligne infiltratie in verschillende organen. FLT3-ITD mutaties en MLL-PTD mutaties werken dus samen om tot een versnelde maligne transformatie te leiden [63] RAS De RAS genen coderen voor een familie van membraan geassocieerde receptor -eiwitten, die betrokken zijn in verschillende signaalwegen. Er zijn 3 functionele RAS genen: N-RAS, K-RAS en H-RAS. Mutaties in RAS gen nemen plaats in codon 12, 13 en 61 en veroorzaken een constitutieve activatie van het RAS eiwit [64]. NRAS mutaties worden gevonden in ongeveer 11% van de patiënten en KRAS mutaties in 5%. Deze laatste worden geassocieerd met FAB type M4 en bij patiënten met een inv(16)(p13;q22). NRAS mutaties zijn omgekeerd gecorreleerd met FLT3-ITD mutaties ([65]). Ondanks het feit dat RAS signaalcascades een belangrijke rol spelen in de pathogenese van AML is de prognostische waarde van RAS mutaties onduidelijk [14]. Recentere studies wijzen op een verhoogd risico op herval bij patiënten die drager zijn van een RAS mutatie [65] Gen expressie Overexpressie van bepaalde genen hebben ook een invloed op de prognose bij AML. De genen waarvan op dit moment hun rol bij AML is aangetoond zijn: het ecotropic virus integration-1 (EVI1) gen, het brain and acute leukemia cytoplasmic (BAALC) gen en het Wilms tumor1 (WT1) gen. Zij worden hieronder uitgebreider besproken EVI1 Het ecotropic virus integration-1 (EVI1) gen is gelokaliseerd op chromosoom 3q26. Dit gen wordt opgereguleerd als resultaat van een inv(3)(q21;q26) of t(3;3)(q21;q26) [66]. Deze overexpressie wordt gezien in 10% van de AML patiënten. Hoge expressie van het EVI1 gen heeft een negatieve prognostische impact op de ziektevrije overleving [67] BAALC Het Brain and acute leukemia, cytoplasmic (BAALC) gen is gelokaliseerd op chromosoom 8q22.3 en wordt alleen gevonden in zoogdieren. BAALC komt tot expressie in neuro-ectoderm weefsels en hematopoïetische voorlopercellen. In hematopoïetische cellen is de expressie van BAALC beperkt tot het compartiment van de stamcellen. Er is geen expressie van BAALC in rijpe cellen in het beenmerg of het perifeer bloed. Een hogere BAALC expressie is geassocieerd met een frequenter voorkomen van FLT3-ITD, CEBPA en MLL-PTD mutaties, alsook een hoge ERG expressie (zie 1.6). Hogere BAALC expressie kent ook een positieve correlatie met multidrug resistentie (MDR1) genen

29 Hoofdstuk 1. Inleiding 22 betrokken in chemoresistentie. Dit vertaalt zich in een hogere resistentie bij initiële inductietherapie [68]. BAALC overexpressie is een onafhankelijke ongunstige risicofactor bij de novo AML patiënten met een normaal karyotype. Patiënten met een hoge expressie van dit gen behalen minder vaak een complete remissie na inductietherapie en hebben een slechtere overleving [69] WT1 Het Wilms Tumor 1 (WT1) gen is gelokaliseerd op de korte arm van chromosoom 11 en codeert voor een transcriptiefactor betrokken in verschillende processen van celgroei, differentiatie en apoptose [70]. Het speelt een grote rol in de embryonale ontwikkeling van de nieren en de gonaden. Terwijl WT1 expressie zeer laag is in normale hematopoiëtische cellen, wordt dit gen wel hoog tot expressie gebracht in de vroege voorlopercellen in het beenmerg. Differentiatie van voorlopercel naar een rijpere bloedcel gaat gepaard met een downregulatie van WT1 expressie. WT1 wordt ook hoog tot expressie gebracht in hematologische (waaronder AML) en andere maligniteiten waaronder de Wilms niertumor bij kinderen, een aantal types van longkanker, prostaat- en borstkanker. Hierbij is de mate van overexpressie omgekeerd gecorreleerd met de differentiatiegraad van het maligne proces [71]. Deze eigenschappen maken WT1 een aantrekkelijke merker voor minimale restziekte detectie (MRD). Bij AML zijn de WT1 waarden hoger in de groep met de gunstige cytogenetica, voornamelijk bij patiënten met een t(15;17)(q22;q21) en t(8;21)(q22;q22). De prognostische waarde van WT1 overexpressie bij diagnose zowel voor volwassenen als voor kinderen is alsnog onduidelijk. Verschillende studies spreken elkaar hier in tegen [72] [56]. Een hogere WT1 waarde na chemo-inductie zou een negatieve voorspeller zijn voor een hoger risico op herval en mortaliteit [73]. Gen Biologische karakteristieken Klinische significantie NPM1 Mutaties leiden tot abnormale cytoplasmatische lokalisatie van het eiwit. Mutaties worden gevonden in 25%-35% of AML (45%-64% AML met normaal karyotype; 35%-40% del(9q); ongeveer 15% trisomie Voorlopige ziekte entiteit (WHO 2008). In jongere volwassenen patiënten, voorspelt een NPM1 mutatie zonder bijkomende FLT3-ITD mutatie voor het behalen van CR en een gunstige DFS en OS. 8). Er bestaat een associatie met FLT3-ITD (ongeveer 40%), FLT3 TKD (10%-15%), en IDH mutaties (ongeveer 25%). CEBPA Regulator van transcriptiefactoren in de hematopoiëse. Mutaties komen voornamelijk voor bij AML gevallen met normaal karyotype (10%-18%), en AML met del(9q) (ongeveer 40%). Voorlopige ziekte-entiteit (WHO 2008) Mutaties geassocieerd met een hogere CR graad en een gunstigere RFS en OS.

30 Hoofdstuk 1. Inleiding 23 FLT3 -ITD -IKD IDH1, IDH2 KIT WT1 RUNX1 MLL-PTD Lid van de klasse III receptor kinase familie; FLT3 en zijn ligand spelen een belangrijke rol in de proliferatie, overleving en differentiatie van hematopoiëtische voorlopercellen. FLT3-ITD wordt gevonden in ongeveer 20% van alle AML (normaal karyotype: 28%-34%) Insertie site van de ITD voornamelijk in het JM domein; in ongeveer 30% in het tyrosine kinase 1 domein. FLT3 TKD puntmutaties gevonden in 5%-10% van alle AML. Cytosolische (IDH1) en mitochondriale (IDH2) metabolische enzymen katalyseren de oxidatieve decarboxylatie van isocitraat naar ketoglutaraat; betrokken in cellulaire verdediging van oxidatieve schade. Mutaties gevonden in ongeveer 16% van de AML, associatie met CN-AML. Lid van de klasse III receptor kinase familie; KIT en zijn ligand spelen een belangrijke rol in de proliferatie, overleving, differentiatie en functionele activatie van hematopoiëtische voorlopercellen. Mutaties voornamelijk gevonden in CBF-AML (25%- 30%). Transcriptiefactor betrokken in de regulatie, van apoptose, proliferatie en differentiatie van de hematopoiëtische stamcellen. Mutaties gevonden in 10%-13% van CN-AML. Transcriptiefactor nodig voor de definitieve hematopoiëse. Mutaties gevonden in 5%-13% van AML; geassocieerd met trisomie 13, trisomie 21, en een normaal karyotype. Mutaties geassocieerd met MLL-PTD; omgekeerde correlatie met de aanwezigheid van CEBPA en NPM1 mutaties. Geassocieerd met een ongedifferentieerde morfologie (FAB M0). DNA bindend eiwit dat de genexpressie in hematopoiëse reguleert, mogelijks door middel van epigenetische mechanismen. MLL-PTD gevonden in 5%-11% van het normale karyotype AML, en tot 90% van AML met trisomie 11. FLT3-ITD geassocieerd met een inferieure overleving; non-jm FLT3-ITD mogelijks geassocieerd met een slecht eindresultaat. In AML met FLT3- ITD moet rekening gehouden worden met allogeneïsche HSCT. De prognostische significantie is controversieel. IDH2 mutaties worden frequenter gevonden in oudere patiënten. IDH1 en mogelijks ook IDH2 mutaties houden een hoger risico in op herval en inferieure OS in moleculaire laag-risico CN-AML (gemuteerd NPM1 zonder FLT3-ITD). Mutaties geassocieerd met een inferieur eindresultaat in CBF-AML. Op dit moment is geen data beschikbaar dat het gebruik van KIT mutatie status in therapiekeuze ondersteunt. Klinische trials die KIT inhibitoren evalueren zijn op komst. Prognostische significantie is in zekere mate controversieel; de meeste studies rapporteren een negatieve prognostische impact. De prognostische significantie wordt onderzocht.; de eerste data wijzen op een associatie met een lagere CR graad en een kortere RFS en OS. In initiële studies geassocieerd met een kortere CR duur, inferieure RFS en EFS, maar niet OS. In multivariabele analyses meestal niet een onafhankelijke prognostische factor.

31 Hoofdstuk 1. Inleiding 24 TET Behoort tot een 3-ledige familie van goed bewaarde genen; eiwitfamilie ongekend, mogelijk betrokken bij de epigenetische regulatie. Mutaties worden gevonden in een wijd spectrum van myeloïde neoplasmen; MDS (20%), MPN (12%), secondair AML (25%); frequentie in de novo AML wordt onderzocht. BAALC Biologische functie ongekend. Hoge BAALC expressie is gecorreleerd met deze van de genen die in hematopoiëtische voorlopercellen tot expressie komen en deze die betrokken bij chemoresistentie. ERG Leden van de ETS familie van transcriptiefactoren ERF herschikkingen spelen een rol bij andere kankers. Komen sterk tot expressie in CN, complex karyotype, en megakaryoblastisch AML. EVI1 EVI1 eiwit betrokken in de regulatie van transcriptiefactoren die kritisch zijn voor de hematopoiëse en in de epigenetische regulatie. Een verstoorde expressie van EVI1 gevonden in AML met inv(3)(q21q26.2) of t(3; 3)(q21;q26.2); EVI1 overexpressie wordt eveneens gevonden in ongeveer 10% van de ongeselecteerde AML; geassocieerd met -7 en t(11q23)/mll herschikkingen. MN1 MN1 gen heeft de rol van een transcriptiecoregulator. Geassocieerd met cytogenetische abnormaliteiten in andere types kanker. Klinische significantie tot op heden nog onduidelijk Hoge BAALC expressie geassocieerd met een inferieure CR graad, DFS, en OS. Hoge ERG expressie wordt geassocieerd met een inferieure CR graad en EFS. Hoge ERG expressie heeft voornamelijk een impact op de prognose in CN- AML met NPM1 gemuteerd zonder FLT3- ITD. Verstoorde EVI1-expressie geassocieerd met een lage CR graad en een inferieure overleving; het effect komt het meest tot uiting in de cytogenetische intermediaire risico AML. Allogene HSCT kan de overleving van AML met een hoge EVI1 verhogen. Hoge expressie wordt geassocieerd met het NPM1 wild-type en BAALC en MN1 upregulatie. In CN-AML geassocieerd met mir-126. Hoge MN1- expressie is gecorreleerd met een lagere CR, een kortere DFS, en OS. Een lage MN1-expressie lijkt in een studie op een respons te wijzen op therapie met ATRA bij oudere AML patiënten. Tabel 1.6: Recurrente genetische abnormaliteiten in volwassen AML: Biologische karakteristieken en klinische significantie

32 Hoofdstuk 1. Inleiding Minimale restziekte Definitie Het doel van de therapie bij AML patiënten is de eliminatie van maligne cellen voor het bekomen van complete remissie (morfologisch of moleculair) en een volledig herstel van de hematopoiëse in het beenmerg. De kans op herval van de ziekte hangt af van de kwaliteit van de remissie. Moderne behandelingen bekomen een complete morfologische remissie bij de meeste patiënten. Echter, een kleine hoeveelheid van de initiële leukemische cellen worden niet uitgeroeid na inductietherapie. Dit zijn de leukemische stamcellen (LSC, zoals hoger besproken) die voor een herval bij AML kunnen zorgen [29]. Dit kleine percentage LSC dat in het beenmerg blijft resideren na therapie wordt de minimale restziekte (Minimal Residual Disease, MRD) genoemd. De grootte van dit LSC compartiment varieert sterk tussen verschillende AML patiënten. Het is aangetoond dat deze grootte in relatie kan gebracht worden met de prognose van de patiënt. Patiënten met een grotere LSC populatie bij diagnose hebben een grotere kans op aanwezigheid van minimale ziekterest en op herval, met als gevolg een lagere overlevingskans [31]. MRD monitoring wordt verricht na het einde van de inductie en na de eerste consolidatie therapie. MRD waarden worden gebruikt voor de risico stratificatie van de patiënt en de evaluatie van de doeltreffendheid van de behandeling. Aan de hand van de MRD detectie kan men beslissen om de postremissie therapie vroegtijdig stop te zetten of deze net aan te houden om respectievelijk over- of onderbehandeling te voorkomen [66] Technieken Om de MRD op een objectieve en gevoelige manier op te sporen wordt gebruik gemaakt van flowcytometrie of polymerasekettingreacties (PCR) [29] Flowcytometrische detectie van MRD Flowcytometrische detectie van MRD doet men aan de hand van het specifieke fenotype gedetecteerd bij diagnose, namelijk de leukemie geassocieerde immunofenotypen (LAIPs) [66]. Een vaak voorkomend probleem is dat er niet voor elke patiënt duidelijke LAIP kan gevonden worden. Eén van de oorzaken hiervan is de grote heterogeniteit binnen AML. Immuunfenotypische verschuivingen waarbij een AML opkomt waarvan de leukemische cellen een ander immuunfenotype vertonen, en cellijn switch waarbij een lymfatische leukemie kan veranderen in een myeloïde leukemie, hebben als gevolg dat de LAIP die bij diagnose geïdentificeerd werden onbruikbaar worden voor MRD detectie omdat ze vals negatieve resultaten opleveren [74].

33 Hoofdstuk 1. Inleiding Kwantitatieve PCR detectie van MRD Moleculaire technieken kunnen ook gebruikt worden voor detectie van MRD. Real-time quantitatievepolymerase chain reaction (RQ-PCR) is hiervoor de methode bij uitstek. Doelwitten voor PCR zijn voornamelijk fusiegen transcripten. Het gebruik van fusiegenen laat een zeer specifieke en sensitieve MRD detectie toe, maar deze toepassing is gelimiteerd tot 25% van de AML gevallen. Andere doelwitten zijn genmutaties kwantificeerbaar door mutatie-specifieke primers en genen die tot overexpressie komen [75]. De moleculaire wijzigingen worden gedetecteerd door PCR met een specificiteit hoger dan die waarmee de flowcytometer leukemische cellen detecteert. Echter, niet alle patiënten hebben zulke genetische detecteerbare afwijkingen.

34 Hoofdstuk 2 Doelstelling De prognose van AML is zeer heterogeen. Patiënten met een normaal karyotype hebben baat bij bijkomende screening naar genetische afwijkingen die hun ziekteverloop en respons op therapie kunnen voorspellen. In deze masterproef werd gezocht naar de verschillende determinanten die een invloed hebben op de prognose. Hierbij wordt vooral de focus gelegd op de rol van FLT3, NPM1 en CEBPA mutatie bij patiënten met een normaal karyotype. Bij de diagnose van AML zal men bij patienten met of zonder translocaties met PCR technieken mutaties opsporen in FLT3, NPM1 en CEBPA. Vervolgens worden verschillende klinische data omtrent het ziekteverloop van de patiënt verzameld aan de hand van het elektronisch patiëntendossier. Deze analyse laat toe het prognostisch belang van de gevonden mutaties te evalueren. 27

35 Hoofdstuk 3 Methodologie 3.1 Patiëntenreeks Voor deze studie worden 75 AML patiënten uit het Universitair Ziekenhuis te Gent (UZ Gent) geïncludeerd. Deze AML populatie omvat 11 bloedstalen en 89 beenmergstalen verzameld tussen september 2010 en februari Van de 75 patiënten gediagnosticeerd met AML hebben we 9 kinderen en 66 volwassen. Van de kinderen en volwassen hebben we respectievelijk 4 en 21 bijkomende recidiefstalen. Herval wordt gedefinieerd als het herverschijnen van meer dan 20% blasten in het beenmerg, ongeacht de tijd na diagnose. Diagnose van de patiënt is gebaseerd op morfologie, immunofenotypering en cytogenetica van de leukemische cellen. De stalen worden zo snel mogelijk verwerkt of levend ingevroren voor latere verwerking. Ook het diagnostisch staal van een patiënt met een herval, binnen de observatieperiode ( ), wordt opgenomen in deze studie. Naast de variabelen bepaald in het Laboratorium voor Klinische Biologie in het Universitair Ziekenhuis te Gent, wordt voor klinische gegevens (leeftijd, therapie, mortaliteit) een beroep gedaan op het Elektronisch Patiënten Dossier (EPD) van het UZ Gent. 3.2 Diagnostiek van acute leukemie In het Laboratorium voor Klinische Biologie in het Universitair Ziekenhuis te Gent bij vermoeden van AML het volgende te gebeuren: - Het maken van uitstrijkjes zowel van bloed als beenmerg waarbij 1 gekleurd wordt en de overige als reserve dienen bewaard te worden. - Een microscopische bepaling van de aard van de leukemie met een telling van het aantal blasten. - Het staal wordt verdeeld voor de nodige flowcytometrische en moleculaire onderzoeken. - Bepaling van het immunofenotype van de leukemische blasten m.b.v. 8-kleuren flowcytometrie. - Bepaling van de cytogenetica via karyotypering en FISH technieken. - Moleculaire uitwerking bij bevestiging leukemie (AML). 28

36 Hoofdstuk 3. Methodologie Microscopie Bij vermoeden van acute leukemie wordt een uitstrijkje gemaakt om twee zaken na te gaan: aanwezigheid van een verhoogd aantal blasten, en de aard van de acute leukemie. Het beenmerg wordt volledig nagezien en gedifferentieerd. Uit de telling wordt het aantal blasten bepaald. De myeloïde oorsprong kan m.b.v. een myeloperoxidase kleuring. Het beenmerg of bloeduitstrijkje wordt 1 minuut met het mengsel formol-ethanol gefixeerd. Het uitstrijkje wordt gedurende 3 minuten met de myeloperoxidase-kleurstof gekleurd en vervolgens bedekt met hematoxyline gedurende 3 minuten. Het uitstrijkje kan met objectief 50x of eventueel 100x met immersie-olie bekeken worden. Cellen met veel peroxidasekorrels kleuren sterk tot zwak rood, de kernen van de leukocyten kleuren blauw. Dit laat ons toe myeloblasten en monoblasten van lymfoblasten te onderscheiden. Myeloblasten en monoblasten kleuren positief, daar waar lymfoblasten negatief aankleuren Flowcytometrie Principe van flowcytometrie Flowcytometrie is een techniek die tegelijkertijd verschillende fysische karakteristieken van cellen meet én analyseert. M.b.v. lichtverstrooiing wordt de grootte en de granulariteit of interne complexiteit van de cellen gemeten. Daarnaast zal door toevoegen van fluorochromen specifiek het immunofenotype van de cellen bepaald worden. Deze fluorochromen zijn antilichamen gemerkt met een fluorescente molecule en gericht tegen specifieke antigenen op de te onderzoeken cellen, in dit geval de leukemische cellen. Voor de immunofenotypering van AML stalen wordt gebruik gemaakt van de flowcytometrie, m.b.v. 8-kleuren panels. De 3 laserbundels (rood, blauw, violet) in deze studie hebben een golflengte van respectievelijk 633 nm, 488 nm en 405 nm Flowcytometrie bij AML Op basis van de morfologie wordt de beslissing genomen om m.b.v. een aantal merkers een eerste screening uit te voeren (zie tabel 3.1). Immunofenotypering is allereerst van belang om een AML te onderscheiden van een ALL. FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 V450 V500 cympo cy CD79a CD34 CD19 CD7 CD3 cycd3 CD45 Tabel 3.1: Eerste screening met cellijn specifieke antilichamen

37 Hoofdstuk 3. Methodologie 30 Zodra is vastgesteld dat de acute leukemie een AML betreft, worden bijkomende merkers ingezet voor de volledige fenotypering van de AML (zie tabel 3.2) m.b.v. 7 tot 8-kleuren buizen. Buis FITC PE PerCP-Cy5.5 PE-Cy7 APC APC-H7 V450 V500 1 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 HLA-DR CD45 2 CD35 CD64 CD34 CD117 IREM2 CD14 HLA-DR CD45 3 CD36 CD105 CD34 CD117 CD33 CD71 HLA-DR CD45 4 Tdt CD56 CD34 CD117 CD7 CD19 HLA-DR CD45 5 CD15 NG2 CD34 CD117 CD22 CD38 HLA-DR CD45 6 CD42 CD203c CD34 CD117 CD123 CD4 HLA-DR CD45 CD61 7 CD41 CD25 CD34 CD117 CD42b CD9 HLA-DR CD45 Tabel 3.2: Volledige AML fenotypering Aan de hand van deze merkers kan men de uitrijping van de cellen nagaan. Typische merkers voor AML blasten zijn CD34, CD117, CD45 en HLA-DR. De uitrijping voor elke cellijn staat weergeven in tabel 3.3. Granulocytaire uitrijping Algemene merkers CD45 CD13 CD33 cympo Vroeger merkers CD34 CD38 CD117 CD123 HLA-DR Late merkers CD15 CD64 CD10 CD11b CD35 CD16 Monocytaire uitrijping Algemene merkers CD45 CD33 CD13 HLA-DR Vroeger merkers CD34 CD117 Late merkers CD64 CD36 CD11b CD35 CD114 CD4 CD15 IREM2 Erythroïde uitrijping Vroeger merkers CD45 CD34 CD33 CD13 CD117 Late merkers CD36 CD71 CD105 Megakaryocytair CD41 CD42a CD42b CD61 Tabel 3.3: Myeloïde antigenen Buis 1 bevat bijvoorbeeld antilichamen voor de myeloïde differentiatie tot rijpe segmentkernige granulocyt. Buis 2 daarentegen bevat merkers eigen aan de monocytaire differentiatielijn. En buis 3 bevat merkers typisch voor de erythroïde cellijn. De vierde buis is gericht op aberrante expressie van lymfatische antigenen op myeloïde cellen. Een voorbeeld van een cross-lineage merker is CD19. De antilichamen in buis 5 herkennen een aantal merkers die vooral een prognostische waarde voor

38 Hoofdstuk 3. Methodologie 31 AML patïenten inhouden. Zo is NG2 geassocieerd met de aanwezigheid van MLL afwijkingen, die in ongeveer 10% van de AML patiënten aanwezig zijn. Ter herkenning van basofielen, dendritische cellen, mastcellen en megakaryoblastaire cellen zijn voor buis 6 merkers geselecteerd ter identificatie van deze populaties. Voor de megakaryocytaire reeks is een combinatie gemaakt van CD61 en CD42, merkers die beiden al vroeg in de megakaryocytaire uitrijping tot expressie komen. Bij positiviteit kan dit worden bevestigd via CD41 en CD42b (buis 7). Vervolgens wordt aan de hand van een combinatie van merkers voor elke patiënt, indien mogelijk, een leukemie-geassocieerd immunofenotype (LAIP) opgesteld dat patiënt-specifieke opvolging mogelijk maakt Cytogenetica Karyotypering De leukemische cellen worden in cultuur gebracht voor één of meerdere dagen tot wanneer een voldoende groot aantal bereikt wordt. In het stadium van de metafase wordt de deling van deze cellen stopgezet door toevoeging van een colchicine oplossing. Nadien worden de cellen blootgesteld aan een hypotone oplossing (0.075M KCl) en gefixeerd met mengsel van alcohol en azijnzuur. De chromosomen worden gekleurd via een G-banding (trypsin-giemsa-wright) techniek. Deze techniek duurt 1 tot 2 weken en laat toe grote deleties, amplificaties en translocaties te detecteren Fluorescentie in situ hybridisatie Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) is een techniek die gebruik maakt van fluorescent gemerkte probes om specifieke nucleïnezuursequenties aan te duiden. FISH kan gebruikt worden om gericht translocaties en chromosomale afwijkingen aan te tonen. Een kweek is hierbij niet noodzakelijk waardoor dit proces maar 1 tot 2 dagen duurt. Hierbij wordten dubbelstrengige DNA moleculen van de te onderzoeken chromosomen, door het opdrijven van de temperatuur, enkelstrengig gemaakt. Vervolgens zullen verschillende probes complementair met dit DNA binden. In de routine diagnostiek wordt gebruik gemaakt van probes gericht tegen de meest voorkomende MLL herschikkingen en fusiegenen zoals PML-RARA, RUNX1-RUNX1T1, CBFB-MYH1 en DEK-NUP214. Ook deleties zoals monosomie of deletie van de lange arm van chromosoom 5 en 7 of trisomie 8 kunnen gedetecteerd worden Moleculaire diagnostiek bij AML Bij de diagnose van een nieuwe acute leukemie wordt het diagnostische staal van die patiënt standaard eerst gescreend op genherschikkingen en andere chromosomale afwijkingen, waarvoor RNA als basis

39 Hoofdstuk 3. Methodologie 32 voor de PCR reacties wordt gebruikt. Als er geen translocatie of andere afwijking wordt gevonden, wordt er verder gescreend voor genmutaties. Hiervoor wordt DNA gebruikt Isolatie van de witte bloedcellen DNA of RNA nodig voor moleculaire testen worden geïsoleerd uit witte bloedcellen zodat aanwezige DNasen en voornamelijk RNasen in volbloed verwijderd worden. Daarom worden de rode bloedcellen (RBC) eerst gelyseerd en blijven de witte bloedcellen (WBC) over. Deze pellet van witte bloedcellen wordt bewaard in 75% ethanol bij temperaturen lager dan -70 C. Voor deze toepassing wordt gebruik gemaakt van een aangekochte Erythrocyte Lysis (EL) Buffer. Rode bloedcellen worden gelyseerd en witte bloedcellen blijven intact in de EL-buffer. Deze EL-buffer bevat ammoniumchloride, kaliumbicarbonaat en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) dat met het magnesium aanwezig in het staal bindt en helpt met het remmen van nuclease activiteit. Als deze buffer aan een bloedstaal wordt toegevoegd, ontstaat er een verschil in osmotische druk waarbij de RBC water opnemen om zo tot een iso-osmotische druk te komen. Hierbij wordt er zodanig veel water opgenomen dat de RBC lyseren. Door het staal op ijs te zetten zal de activiteit van RNasen die vrijkomen na lyse verminderen. Door dan telkens te centrifugeren worden de WBC gescheiden van de oplossing met RNasen, DNasen en gelyseerde rode bloedcellen. De stabiliteit van vers afgenomen beenmerg of perifeer bloed voor RNAtoepassingen is beperkt door de aanwezigheid van RNasen, zodat de WBC-isolatie zeker binnen de 48h na afname moet uitgevoerd worden Isolatie van RNA Voor de mrna-isolatie wordt gebruik gemaakt van de RNeasy Mini Kit (QIAGEN) manueel of m.b.v. QIAcube waardoor dit proces volledig geautomatiseerd verloopt. Het isoleren van RNA is gebaseerd op een combinatie van twee technieken: de selectieve binding van het RNA aan een silicamembraan en de centrifugatietechniek. De stalen worden vooraf gelyseerd en vervolgens gehomogeniseerd in aanwezigheid van een guanidine isothiocyanate (GITC) bevattende buffer die onmiddellijk de RNase activiteit inactiveert. Hierdoor wordt de isolatie van intact RNA verzekerd. Dan wordt ethanol toegevoegd om gepaste bindingscondities te verkrijgen en worden de stalen overgebracht op een kolom met silicagel membraan waarop het totale RNA (met uitzondering van RNA-moleculen korter dan 200 nucleotiden) zich bindt. Vervolgens wordt genomisch DNA gedegradeerd via behandeling met DNase, worden alle contaminanten weggewassen en wordt het RNA geëlueerd met water. Aan de hand van een spectrofotometer (NanoDrop ND-2000 ) kan de zuiverheid en de concentratie van het bekomen RNA gemeten worden. Een hoeveelheid van 1,5 tot 2 µl van het RNA staal wordt op het toestel gebracht en het toestel berekent de concentratie en zuiverheid a.h.v. de gemeten optische densiteit.

40 Hoofdstuk 3. Methodologie Polymerase kettingreactie of polymerase chain reaction (PCR) Via PCR wordt, uitgaande van een kleine hoeveelheid DNA, op een snelle manier een grote hoeveelheid DNA geproduceerd. Hierop kan later verdere analyse worden uitgevoerd. Voor deze reactie hebben we specifieke primers nodig. Dit is een kleine stuk enkelstrengig DNA dat zich hecht aan de uiteinden van het DNA fragment dat men wil amplificeren. Voor de amplificatie bestaat zowel de voorwaartse primer ( 5-3 -amplificatie) als de achterwaartse primer (3-5 -amplificatie). Vervolgens wordt de effectieve PCR uitgevoerd. Deze PCR-procedure bestaat uit 3 opeenvolgende stappen: Denaturatie: Door het opvoeren van de temperatuur tot +/- 96 C zullen de waterstofbruggen tussen de verschillende basen van het dubbelstrengig DNA breken, waardoor 2 enkelstrengen DNA ontstaan. Deze fungeren als template voor de aanmaak van 2 nieuwe strengen in de volgende stap. Hybridisatie: De vooraf bijgevoegde primers zullen in deze stap aanhechten. Dit gebeurt bij een temperatuur tussen de 40 C en 62 C. De grote range is te wijten aan primers, welke temperatuurspecifiek zijn. (Lengte en sequentie van de opeenvolgende basenparen zijn hierbij van belang) Elongatie: Het DNA-polymerase zal de enkelstrengige DNA-templates amplificeren. Dit enzym vertrekt vanaf het uiteinde van de primer en zal volgens de regels van de basenparing de precieze nucleotide inbouwen in de DNA-streng, complementair aan het DNA-template (5-3 -richting). Deze stappen worden een aantal cycli herhaald, totdat de nodige hoeveelheid DNA wordt bereikt Screening fusietranscripten Reverse transcriptie De eerste stap in het proces van de PCR reactie is het omzetten van RNA naar DNA. Hierbij wordt gebruik gemaakt van een het reverse transcriptase (RT). Dit zal op basis van de RNA-template een enkelstrengig complementair copy DNA (cdna) synthetiseren. Voor het starten van de cdna synthese is een oligonucleotide primer nodig. De primer bindt ter hoogte van het RNA en het cdna wordt verlengd naar het 5 einde van het mrna door middel van de RNA-afhankelijke DNA polymerase activiteit van het RT. Aan de hand van het bekomen cdna kan men de eigenlijke PCR amplificatie starten. Multiplex PCR Voor dit doeleinde maken we gebruik van de multiplex RT-PCR. Dit wil zeggen dat er gedurende één PCR reactie meerdere doelwitsequenties tegelijkertijd gescreend worden. Na een eerste PCR ronde wordt een tweede PCR uitgevoerd op het eerste PCR product om de specificiteit te verhogen. Dit noemt men een nested PCR. Deze multiplex RT-PCR laat screening van 28 verschillende translocaties en andere chromosomale herschikkingen toe: - MLL herschikkingen met verschillende fusiepartners (AF1p, AF1q, AF1X, AF4, AF6, AF9, AF10, AF17, AF19, ELL, ENL)

41 Hoofdstuk 3. Methodologie 34 - Translocaties t(1;19)(q23;p13), t(17;19)(q22;p13), t(12;21)(p13;q22), t(9;21)(q13;q22) en TAL1 deletie - Translocaties t(8;21)(q22;q22), t(3;21)(q26;q22), t(16;21)(q24;q22), t(15;17)(q22;q21), t(6;9)(p23;q34), t(9;9)(p11;q13), t(11;17)(q23;q21), t(5;17)(q13;q11), t(3;5)(q25;q34) en inv(16)(p13;q22) - Translocaties t(9;12)(q34;p13), t(5;12)(q31;p13), t(9;22)(q34;q11), t(12;22)(p13;q12) Identificatie van de juiste fusietranscripten gebeurt in 2 stappen. In een eerste stap wordt m.b.v. parallelle multiplex PCR reacties gescreend. Iedere multiplex PCR reactie bevat een andere primer mix, specifiek voor de detectie van een verschillende groep chromosomale herschikkingen. Zodra de screening positief is, wordt in de tweede stap de specifieke genherschikking opgespoord met individuele primerreacties. M.b.v. gelelektroforese worden de bekomen PCR producten vervolgens aangekleurd en gevisualiseerd. Door het aanleggen van een spanningsveld worden de PCR-producten gescheiden op basis van hun grootte. De gevonden translocatie wordt, indien ter beschikking, bevestigd met de desbetreffende kwantitatieve real-time PCR. Ook alle follow-ups zullen geanalyseerd worden door deze techniek Screening mutaties Standaard wordt naar mutaties in het FLT3, CEBPA en NPM1 gen gescreend. Met het doel zowel FLT3-ITD mutaties, NPM1 mutaties en CEBPA mutaties tegelijk te analyseren, maken we gebruik van een multiplex PCR strategie. Hierbij worden 2 parallelle reacties uitgevoerd. In een eerste multiplex reactie worden mutaties opgespoord in het NPM1 gen, het FLT3 gen en het C-terminale deel van het CEBPA (bzip) opgespoord. In een tweede multiplex reactie worden de domeinen TAD1 en TAD2 in het N-terminale deel van het CEBPA gen geamplificeerd. Eerst wordt het DNA geamplificeerd met PCR, waarna het gescheiden wordt op basis van grootte m.b.v. capillaire electroforese. Deze analyse is gebaseerd op de verschillen in fragmentlengte waarbij een verschil van 1 basepaar kan gedetecteerd worden. Dit laat ons niet toe om puntmutaties op te sporen aangezien ze niet gepaard gaan met een lengteverschil van de bestudeerde sequentie. Er zijn meer dan 50 varianten van de NPM1 mutatie, maar bijna allen bestaan ze uit een insertie van 4 baseparen in exon 12 van het gen. Een positief resultaat voor deze mutatie geldt dus vanaf 4 bp. Voor het FLT3-ITD is dit meer variabel en worden inserties vanaf 1 bp als een positieve mutatie beschouwd. Voor TAD1, TAD2 en het bzip van het CEBPA gen worden deleties en inserties vanaf 1 bp als positief beschouwd. Om de exacte mutatie in dit gen te achterhalen kan nadien nog een DNA-sequentie analyse worden verricht. Amplificatie van PCR producten Er wordt gestart van DNA aan een concentratie van ongeveer 50 ng/µl. Zoals hogerop vermeld worden twee parallelle reacties ingezet, namelijk multiplex 1 en multiplex 2. Voor het bereiden van

42 Hoofdstuk 3. Methodologie 35 de PCR mix wordt gebruik gemaakt van nucleotiden (dntp s), een buffer, RNase -DNase vrij water. Daarnaast wordt voor de amplificatie van elk hierboven vernoemd gen of domein een specifiek voorwaartse (forward) en een fluorescent gelabeld achterwaartse (reverse) primer toegevoegd. Als laatste wordt het DNA-polymerase Taq Gold (AmpliTaq Gold DNA Polymerase, Applied Biosystems) toegevoegd aangezien dit enzym zeer temperatuur gevoelig is. Deze mix heeft een volume van 23 L waaraan dan 2 L van het te onderzoeken DNA wordt toevoegd. Na incubatie wordt het PCR programma gestart op de Veriti (Applied Biosystems) Capillaire elektroforese De bekomen PC producten wordt geanalyseerd aan de hand van de ABI 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems), waarbij ze gescheiden worden op basis van hun grootte. Hiervoor moet het DNA eerst gedenatureerd worden m.b.v. formamide. Vervolgens worden de PCR producten gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit. Wanneer de DNA-fragmenten een detectorvenster in het capillair passeren, worden de fluorescerende labels geëxciteerd door een laser. De uitgezonden fluorescentie wordt opgevangen en opgeslagen. Aan de hand van een software programma wordt dit omgezet in pieken op een elektroferogram. Interpretatie en bevestiging resultaten Deze elektroferogrammen laten eenvoudige fragmentanalyse toe. Een piek van een bepaalde lengte wijst op aanwezigheid van DNA van het gewone wild type allel waarvan de lengte gekend is of kan wijzen op een mutatie. Voor een correcte interpretatie van de resultaten, wordt bij elke analyse 3 controles ingezet. De nontemplate controle bestaat uit water en mag na deze screening geen PCR producten vertonen. De positieve en negatieve controle bestaan respectievelijk uit DNA afkomstig van het perifeer bloed van een normale donor, en uit DNA afkomstig van een donor met gekende mutatie. De negatieve controle zal dus wild type (WT) pieken vertonen in een gekend gebied. De positieve controle vertoont aberrante pieken waarvan de lengte ook gekend is. Alle patiëntstalen moeten duidelijke WT-pieken vertonen volgens de verwachte lengtes. Bij de aanwezigheid van een mutatie wordt een extra piek gezien met een grotere lengte (inserties) of met een kortere lengte (deleties) in vergelijking met de WT-piek.

43 Hoofdstuk 3. Methodologie Elektronisch patiëntendossier Voor deze studie worden verscheidene klinische parameters bestudeerd. Dit wordt gedaan aan de hand van het elektronisch patiëntendossier. Bestudeerde variabelen zijn onder andere geslacht, herval, leeftijd bij diagnose, de verschillende therapievormen, graad van invasie en datum van overlijden. Eindpunten zoals lange termijn overleving werden bekeken, alsook de complete remissie graad en de ziektevrije overleving. 3.4 Statistische werkwijze Bij de verwerking van de gegevens in deze studie wordt gebruik gemaakt van niet-parametrische testen. De categorische variabelen worden vergeleken door middel van de Fisher Exact test of de Chi Kwadraat test afhankelijk van het aantal steekproeven. Voor de gepaarde testen wordt gebruik gemaakt van de Mc Nemar test. Bij de vergelijking van continue variabelen wordt gebruik gemaakt van de Mann-Whitney U test of de Kruskal-Wallis test afhankelijk van het aantal steekproeven. Voor de gepaarde test van continue variabelen wordt de Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test toegepast. De totale overleving ( overall survival of OS) wordt gemeten vanaf het moment van diagnose tot hun overlijden, onafhankelijk van de oorzaak. Dit geldt tot de datum van de laatste opvolging voor de patiënten die nog in leven waren tijdens deze studieperiode. Het ziektevrij interval ( disease free survival of DFS) wordt bepaald voor alle patiënten die complete remissie (CR) bereiken. Het wordt gemeten vanaf de datum van diagnose tot herval of andere ziekten bij patiënten die leefden tot de laatste opvolging (namelijk tot 24/02/12). De overlevingscurves van de OS en DFS worden berekend door gebruik te maken van de Kaplan Meier methode. De log - rank test wordt gebruikt om de verschillen tussen de overlevingscurves te vergelijken. Multivariabele analyses worden niet uitgevoerd in deze studie vanwege het beperkt aantal AML gevallen. Van al deze analyses hierboven, worden de resultaten als significant beschouwd bij een P-waarde minder dan 0,05 aan beide zijden. SPSS versie 18.0 wordt gebruikt voor statistische analyse.

44 Hoofdstuk 4 Resultaten 4.1 Patiëntenpopulatie In deze studie wordt er gebruik gemaakt van bloed en beenmerg stalen van 75 patiënten met AML. De karakteristieken van deze patiënten staan beschreven in onderstaande tabel (4.1). Dit zijn patiënten die gedurende de periode van september 2010 tot februari 2012 ofwel gediagnosticeerd zijn met AML ofwel een recidief kregen in die periode. Karakteristieken N 75 Leeftijd Gemiddelde (jaar) 52 Mediaan (jaar) 58 Standaardafwijking (jaar) 23.5 Min, Max (jaar) 0 94 Jonger dan 60 (%) 55 Kinderen (%) 12 Geslacht Man (%), Vrouw (%) AML type Primair (%), Secundair (%) Herval Recidieven N, (%) Fab M0 23 M1 12 M2 13 M3 5 M4 7 M5 6 M6 1 M7 0 Totaal 66 Overleving Nog in leven (%) 44.6 Tabel 4.1: Karakteristieken van de 75 AML patiënten in deze studie 37

45 Hoofdstuk 4. Resultaten Leeftijd Kinderen versus volwassenen Van de 75 AML patiënten is het merendeel volwassen. Slechts 9 kinderen werden gediagnosticeerd met AML binnen de bestudeerde tijdspanne. Klinische en laboparameters worden geanalyseerd en vergeleken tussen kinderen en volwassen met AML. AML op kinderleeftijd gaat gepaard met een hogere graad van centrale invasie (P=0.049) en hepatosplenomegalie (P=0.005). Er wordt geen verschil gevonden voor de andere paramaters. Als de overleving wordt vergeleken tussen volwassenen en kinderen, hebben kinderen met AML een hogere overleving (P=0.047) dan volwassenen met AML. Dit wordt geïllustreerd in onderstaande grafiek (zie figuur 4.1A). Dit is niet alleen te wijten aan de verhoogde sterftekans op oudere leeftijd door comorbiditeiten, maar ook aan het feit dat volwassenen frequenter een secundaire AML vertonen. Figuur 4.1: A. Overlevingscurve van de totale overleving bij AML. Kinderen hebben een significant betere overleving dan volwassenen (P=0.047). B. Overlevingscurve van de ziektevrije overleving bij volwassenen en kinderen met de novo AML. AML op kinderleeftijd is in de meeste gevallen de novo in tegenstelling tot de AML bij volwassenen. Daarom wordt de vergelijking herhaald tussen kinderen en volwassenen met de novo AML. Dan blijkt echter dat er geen verschil in overleving is (P=0.198) (Zie figuur 4.1B).

46 Hoofdstuk 4. Resultaten Volwassenen <60j versus ouderen (>60j) Op basis van leeftijd kunnen we de patiënten opdelen in 2 groepen, namelijk een groep met een leeftijd boven 60 jaar ( > 60 jaar) en een groep patiënten met een leeftijd onder 60 jaar (< 60 jaar). Als we de eindpunten vergelijken voor deze 2 groepen, blijkt een hogere leeftijd ( > 60 jaar) geassocieerd te zijn met een lagere totale overleving (P=0.001) en ziektevrije overleving (P=0.001). Dit wordt geïllustreerd door figuur 4.2. Figuur 4.2: A. Overlevingscurve van de totale overleving (OS) bij AML. Patiënten >60 jaar hebben een siginificante slechtere overleving (P=0.001) dan de patiënten < 60 jaar. B. Overlevingscurve van de ziektevrije overleving. Ook hier heeft oudere leeftijd een slechtere overleving (P=0.001) Algemeen besluit Patiënten in de groep > 60 jaar hebbben een lagere overleving dan patiënten gediagnosticeerd met AML < 60 jaar. Kinderen blijken een gunstigere overleving te hebben dan volwassenen. Als alleen de primaire AML in rekening wordt gebracht, dan is er geen verschil in overleving tussen kinderen en volwassenen. Uit de resultaten blijkt dat de leeftijd op het moment van de diagnose een hoge voorspellende waarde heeft voor de prognose van AML patiënten. Dit is conform de literatuur [76][2][66][43].

47 Hoofdstuk 4. Resultaten Cytogenetica Cytogenetische afwijkingen Van de 75 AML patiënten in deze studie wordt het karyotype bepaald vanwege de hoge prognostische waarde zoals al besproken. Een groot deel heeft daarbij een afwijkend karyotype (66% ) terwijl 25 (33,3% ) AML patiënten cytogenetisch geen afwijkingen tonen (cytogenetisch normale (CN)-AML). De distributie van de AML patiënten met chromosomale afwijkingen is weergegeven in tabel 4.2. Bij screening naar genherschikkingen blijken 19 AML patiënten drager te zijn van een translocatie. In de groep met gunstige translocaties (22%) is inv(16)(p13;q22) veruit de meest frequente. Slechts 1 patiënt bezit een t(8 ;21)(q22; q22) translocatie. Prognostische cytogenetica Chromosomale afwijking Aantal Gunstig t(8;21)(q22;q22) 1 t(15;17)(q22;q21) 4 inv(16)(p13.1;q22) of t(16;16)(p13.1;q22) 6 Ongunstig Inv(3)(q21;q26.2) of t(3;3)(q21;q26.2) 2 t(6;9)(p23;q34) 1 t(v;11)(v;q23), MLL herschikkingen 4-5 or del(5q), -7 ; abnl(17p) of complex karyotype 17 Intermediair t(9;11)(p22;q23) 1 overige karyotypen 14 CN-karyotype 25 Tabel 4.2: Indeling cytogenetica in 3 grote groepen volgens prognostische waarde In de groep met een ongunstige cytogenetica worden de ongebalanceerde afwijkingen (70,8%) het meest frequent aangetroffen. In 14 gevallen wordt noch aan de definitie van gunstig noch van ongunstig karyotype voldaan. Bijgevolg worden deze patiënten ingedeeld in de intermediaire risicogroep. Samen met de groep AML patiënten die geen afwijkende cytogenetica vertonen, omvat deze groep met een intermediair risico meer dan de helft van alle patiënten Overlevingsduur volgens risicogroep De verschillende cytogenetische risicogroepen zoals hierboven weergegeven worden vergeleken met betrekking tot de totale overleving en de ziektevrije overleving. De gemiddelde overleving valt af te lezen in onderstaande tabel 4.3.

48 Hoofdstuk 4. Resultaten 41 Cytogenetica Totale overleving (OS) Ziektevrije overleving (DFS) Aantal Gemiddelde (maand) Mediaan (maand) Gemiddelde (maand) Mediaan (maand) Gunstig Intermediair Ongunstig Tabel 4.3: Overleving volgens cytogenetica Met behulp van de log-rank test wordt het verschil in overleving tussen de 3 prognostische groepen berekend. Er blijkt geen significant verschil te zijn in overleving tussen de groep met de gunstige cytogenetica en de intermediaire cytogenetica (P=0.483). Er is wel een significant verschil in overleving tussen de groep met gunstige cytogenetica en de ongunstige cytogenetica (P=0.006) en tussen de groep met intermediaire cytogenetica en ongunstige cytogenetica (P=0.026). Dit is te zien in figuur 4.3. De P waarden zijn weergeven in tabel 4.4. Figuur 4.3: A. Overlevingscurve van de totale overleving bij AML op basis van de cytogenetica. De verschillende p-waarden worden in een tabel hieronder weergeven. B. Overlevingscurve van de ziektevrije overleving bij AML

49 Hoofdstuk 4. Resultaten 42 Totale overleving Ziektevrije overleving Gunstig versus intermediair Gunstig versus ongunstig Intermediair versus ongunstig Tabel 4.4: P-waarden behorende bij figuur Besluit Uit de resultaten blijkt dat cytogenetica een belangrijke prognostische waarde heeft. Patiënten die echter geen afwijkend karyotype vertonen (CN-AML) en dat geldt voor ongeveer 33% van de nieuw gediagnosticeerde AML gevallen in onze bestudeerde populatie, worden als intermediaire risico beschouwd. Voor deze groep zal de detectie van moleculaire afwijkingen in belangrijke mate bijdragen tot de prognose (zie verder). 4.4 Recidieven Patiëntenkarakteristieken Van de 75 besproken AML patiënten hebben 25 onder hen een recidief gekregen. De klinische en hematologische paramaters bij diagnose worden vergeleken tussen de groep die een recidief (relapse) heeft gekregen in de bestudeerde periode en de groep van non-relapsers. De karakteristieken van deze patiënten zijn terug te vinden in tabel 4.5. Karakteristieken Relapsegroep Non-relapsers P-waarde N % N % N Leeftijd Gemiddelde (jaar) 47 54,1 0,172 Geslacht Man /Vrouw 9/16 22/28 0,341 Type AML Primair ,162 Secundair ,162 Blasten na inductie Blastenpercentage (%) 9,2 37 9,0 0,782 therapie LDH Gemiddelde (U/l) ,632 CD34 positief Aanwezig ,137 WBC Gemiddelde (aantal per µl) ,1 0,949 Cytogenetica Gunstig ,944 Intermediair Ongunstig

50 Hoofdstuk 4. Resultaten 43 WT1 overexpressie Aanwezig n, (%) ,465 NPM1 mutatie Aanwezig n, (%) ,494 FLT3 mutatie aanwezig n, (%) ,134 CEBPA mutatie Aanwezig n, (%) ,450 Centrale invasie ,407 Hepatosplenomegalie ,416 OS Gemiddelde (maand) 13,7 0,003 DFS Gemiddelde (maand) 13,7 0,753 Tabel 4.5: Klinische en hematologische parameters van de relapse groep en de non-relapsers bij AML Besluit Verschillende univariabele testen werden gedaan om het effect van klinische parameters op de recidiefkans na te gaan. Geen van deze heeft een statistisch significant resultaat. Bij herval blijken alle patiënten met een NPM1 mutatie deze mutatie te behouden, hetzelfde geldt voor de FLT3 mutatie. 4.5 Moleculaire afwijkingen NPM1 en FLT3 mutatie NPM1 mutatie en FLT3-ITD in de gehele AML populatie Patiëntenkarakteristieken Statistische analyse werd verricht om de impact van NPM1 mutaties en FLT3-ITD op overleving en ziektevrij verloop te evalueren in de gehele populatie. Detectie van deze mutaties gebeurt alleen bij de patiënten waarbij geen translocatie met een gekende prognose wordt gevonden. Van de 56 patiënten voor wie deze mutaties bepaald zijn, bezitten 15 de NPM1 mutatie (26.7%) en zijn 10 (17,8%) positief voor FLT3-ITD. Analyse toont aan dat 6 patiënten drager zijn van zowel een NPM1 als een FLT3- ITD mutatie (FLT3+/NPM1+). Op basis van de aanwezigheid van een FLT3 mutatie en/of een NPM1 mutatie worden de patiënten onderverdeeld in 4 groepen. De karakteristieken van de bestudeerde patiëntenpopulatie worden weergegeven in tabel 4.6.

51 Hoofdstuk 4. Resultaten 44 Karakteristieken NPM1+/FLT3-ITD- NPM1+/FLT3-ITD+ NPM1-/FLT3-ITD- NPM1-/FLT3-ITD+ N= N (%) N(%) N(%) N(%) Leeftijd (gemiddelde/- 43.4/ / / /59.0 mediaan) Type AML de novo secundair CD34 4 (44.4) 3 (50) 29 (78.4) 2 (50) WBC LDH (U/l) Blasten% na inductie Blasten% bij diagnose in beenmerg Blasten% bij diagnose in perifeer bloed Gunstige cytogenetica (8.1) 0 Intermediaire cytogenetica 8 (88.9) 5 (83.3) 19 (51.4) 3 (75) Ongunstige cytogenetica 1 (11.1) 1 (16.7) 15 (40.5) 1 (25) Invasie in het bot. huid 1 (11.1) 1 (16.7) 2 (5.4) 0 of meningen Herval 0 4 (66.7) 12 (32.4) 1 (25) CEBPA mutatie 0 1 (16.7) 1 (3.3) 0 WT1 overexpressie 6 (66.7) 6 (100.0) 23 (62.2) 3 (75) Tabel 4.6: Karakteristieken van de AML patiënten met een FLT3 en/of NPM1 mutatie Deze tabel toont aan dat de NPM1 en FLT3 mutaties vaker worden gezien in de populatie met een intermediaire cytogenetica waarvan het merendeel een normaal karyotype bezit. Deze worden verderop apart besproken. Individuele klinische en laboparameters De verschillende distributies van kwantitatieve variabelen en kwalitatieve variabelen (zoals hierboven in de tabel wordt weergeven) worden onderzocht en vergeleken tussen de 15 AML patiënten met een NPM1 mutatie en 41 AML patiënten met het wild type NPM1 (ongeacht de FLT3-ITD status). Deze analyse wordt ook verricht voor de 10 patiënten met een FLT3 mutatie en 46 patiënten met het wild type FLT3 (ongeacht de NPM1 mutatiestatus). Hiervan kan alleen weerhouden worden dat AML bij dragers van een NPM1 mutatie een lagere graad aan CD34 positieve blasten vertoont (P=0.024). Voor dragers van een FLT3 mutatie wordt een hogere witte bloedcel (WBC) telling (P=0.002) en LDH

52 Hoofdstuk 4. Resultaten 45 waarden (P=0.002) opgemerkt. Wat het FAB subtype betreft worden de FLT3 mutaties min of meer evenredig in alle morfologische subgroepen gedetecteerd. In vergelijking met het wild-type FLT3, wordt de FLT3 mutatie in een hogere frequentie aangetroffen in de M0 FAB subgroep (P=0.016). Een overzicht van de P-waarden kan gevonden worden in tabel 4.7. Karakteristieken FLT3-ITD+ vs NPM1+ vs NPM1+/FLT3- vs NPM1-/FLT3+ vs FLT3-ITD-(P=) NPM1-(P=) NPM1-/FLT3-(P=) NPM1-/FLT3-(P=) Geslacht Leeftijd FAB classificatie Type AML CD WBC LDH (U/l) Blasten% na inductietherapie Blasten% in beenmerg Blasten% in perifeer bloed Cytogenetica Invasie in het bot, huid of meningen HSM Herval CEBPA mutatie WT1 overexpressie Tabel 4.7: Univariabele analyse bij AML patiënten met FLT3 en/of NPM1 mutatie Om de invloed van NPM1 en FLT3-ITD mutaties op elkaar te vermijden, worden deze analyses nogmaals herhaald voor de populatie met een NPM1 mutatie en wild type FLT3-ITD (NPM1+/FLT3-ITD-, n=9) versus de AML populatie met zowel wild type NPM1 als FLT3-ITD (n=37), alsook voor de populatie met een FLT3 mutatie en een wild type NPM1 (FLT3-ITD+/NPM1-, n=4) versus de AML populatie met zowel wild type NPM1 als FLT3-ITD (n=37). Hieruit blijkt dat patiënten met een NPM1 mutatie maar zonder FLT3-ITD (NPM1+/FLT3-ITD-) een lager risico hebben op herval (P=0.048). Daarnaast kunnen we besluiten dat bij AML patiënten met FLT3-ITD maar zonder een NPM1 mutatie (FLT3-ITD+/NPM1-) een hogere WBC telling (P=0.05) en hogere LDH waarden (P=0.002) gezien wordt. Dit is consistent met de resultaten gevonden met de vergelijking FLT3-ITD+ versus FLT3-ITD-, ongeacht de NPM1 mutatiestatus. Hier moet rekening

53 Hoofdstuk 4. Resultaten 46 gehouden worden met het feit dat de FLT3+/NPM1- groep (n=4) een zeer kleine groep is waardoor de analyse minder power heeft. Overleving bij NPM1 en FLT3-ITD mutaties In de gehele cohorte blijkt het dragen van een NPM1 mutatie geen significante invloed te hebben op de totale overleving (P=0.318) en de ziektevrije overleving (P=0.294). Dit verandert niet als we de FLT3 positieve patiënten uit de cohorte weren. Het dragen van een FLT3 mutatie blijkt ook geen impact te hebben op de prognose in deze bestudeerde doelgroep (P=0.765). De bestudeerde populatie wordt vervolgens opgesplitst in 4 groepen op basis van de aanwezigheid van een NPM1 en/of FLT3 mutatie. In onderstaande tabel worden de gemiddelde en mediane waarden van de totale en ziektevrije overleving opgegeven voor elke subgroep. De patiënten met het NPM1+/FLT3- genotype hebben de relatief meest gunstige overleving. NPM1/FLT3 status Totale overleving (OS) Ziektevrije overleving (DFS) Aantal Gemiddelde (maand) Mediaan (maand) Gemiddelde (maand) Mediaan (maand) NPM1+/FLT NPM1+/FLT NPM1-/FLT NPM1-/FLT Tabel 4.8: Overleving volgens FLT3/NPM1 status Het verschil in overleving tussen de verschillende subgroepen wordt weergeven in figuur 4.4. Dit is voor alle combinaties niet sigificant (zie tabel 4.9). Wel wordt er bij de patiënten met een (NPM1+/FLT3-) genotype een relatief gunstig verloop opgemerkt.

54 Hoofdstuk 4. Resultaten 47 Figuur 4.4: A. Overlevingscurve van de totale overleving bij AML met het NPM1/FLT3-ITD genotype. De verschillende p-waarden worden in een tabel hieronder weergeven. B. Overlevingscurve van de ziektevrije overleving bij AML met NPM1/FLT3-ITD genotype. Totale overleving Ziektevrije overleving P(NPM1-/FLT3+ versus NPM1+/FLT3+) P(NPM1-/FLT3+ versus NPM1+/FLT3-) P(NPM1-/FLT3+ versus NPM1-/FLT3-) P(NPM1+/FLT3- versus NPM1+/FLT3+) P(NPM1+/FLT3- versus NPM1-/FLT3-) P(NPM1-/FLT3- versus NPM1+/FLT3+) Tabel 4.9: P-waarden behorende bij figuur NPM1 en FLT3 in de populatie met een normaal karyotype Patiëntenkarakteristieken De prognostische waarde van deze mutaties wordt opnieuw nagegaan, maar ditmaal bij de CN- AML patiënten. Binnen de bestudeerde AML populatie bevinden zich 25 AML gevallen met een normaal karyotype. Van deze 25 CN-AML patiënten hebben 11 (44%) patiënten een NPM1 mutatie en 5 patiënten (20%) een FLT3 mutatie. Deze FLT3 mutatie komt niet afzonderlijk voor, maar gaat altijd

55 Hoofdstuk 4. Resultaten 48 gepaard met een bijkomende NPM1 mutatie (FLT3+/NPM1+). De karakteristieken van de CN-AML populatie zijn weergegeven in tabel Karakteristieken NPM1+ /FLT3- NPM1+ /FLT3+ NPM1- /FLT3- NPM1-/ FLT3+ N= N (%) N(%) N(%) N(%) Leeftijd (gemiddelde/mediaan) 36.8/ / /61.5 / CD34 2 (40.0) 3 (50) 12 (85.7) / WBC / LDH (U/l) / Blasten% na inductie / Blasten% bij diagnose / in beenmerg Blasten% bij diagnose / in perifeer bloed Gunstige cytogenetica / Intermediaire cytogenetica 5 (100.0) 6 (100.0) 14 (100.0) / Ongunstige cytogenetica / Invasie in het bot, 1 (16.7) 1 (20.0) 2 (7.1) / huid of meningen Herval 0 3 (50) 7 (50.0) / CEBPA mutatie 0 1 (16.7) 1 (10.0) / WT1 overexpressie 3 (50.0) 5 (100.0) 10 (71.4) / Tabel 4.10: Karakteristieken van de CN-AML populatie met NPM1 en/of FLT3 mutatie Individuele klinische en laboparameters Binnen de CN-AML groep worden de klinische variabelen vergeleken tussen de 11 dragers van een NPM1 mutatie (NPM1+) en de 14 patiënten met een wild type (NPM1-). Daarnaast wordt de distributie van kwantitatieve variabelen en kwalitatieve variabelen onderzocht voor de 5 patiënten met een FLT3-ITD mutatie (FLT3-ITD+) en de 20 patiënten met een wild type FLT3 (FLT3-). Hiervan kan alleen weerhouden worden dat de FLT3-ITD mutatie geassocieerd is met een hogere WBC telling (P=0.006). De NPM1 mutatie is daarentegen geassocieerd met een lagere WBC telling (P=0.044) en een bijhorend lager LDH (P=0.009).

56 Hoofdstuk 4. Resultaten 49 Om de invloed van FLT3-ITD te vermijden, worden de 5 patiënten met deze FLT3-ITD mutatie uit onze doelgroep weggelaten. Alle vergelijkingen worden nu herhaald (zie tabel 4.11). Voor de populatie met een NPM1 mutatie en wild type FLT3 (NPM1+/FLT3-ITD-, n=6) versus de AML populatie met zowel wild type NPM1 als FLT3 (NPM1-/FLT3-ITD-, n=14), wordt geen bijkomend verschil in klinische determinanten gevonden op 2 na. Zoals valt af te lezen uit onderstaande tabel, wordt voor dragers van een NPM1 mutatie in afwezigheid van een FLT3-ITD mutatie (NPM1+/FLT3-ITD-, n=6) een verminderd risico op herval teruggevonden (P=0.044). Ook wordt AML bij deze groep gediagnosticeerd op jongere leeftijd (P=0.009). Karakteristieken FLT3-ITD+ vs NPM1+ NPM1+/FLT3- NPM1-/FLT3+ FLT3-ITD-(P=) vs NPM1- (P=) vs NPM1-/FLT3- (P=) vs NPM1-/FLT3- (P=) Geslacht Leeftijd Type AML FAB classificatie CD , WBC , LDH (U/l) , Blasten% na inductie , Blasten% in beenmerg , Blasten% in perifeer , bloed Invasie in het bot, huid , of meningen Herval , CEBPA mutatie , WT1 overexpressie , Tabel 4.11: Statistische analyse van de CN-AML populatie met NPM1 en/of FLT3 waarden Om de invloed van een FLT3 mutatie na te gaan bij AML patiënten die drager zijn van een prognostisch gunstige NPM1 mutatie, worden vergelijkende analysen gemaakt tussen de populatie met een FLT3 mutatie en een NPM1 mutatie (FLT3-ITD+/NPM1+, n=5) versus de AML populatie met wild type FLT3-ITD en NPM1 mutatie (FLT3-ITD-/NPM1+, n=6). Er wordt geen verschil in klinische en hematologische parameters gevonden voor de bestudeerde populaties. Een bijkomende FLT3 mutatie bij patiënten met een NPM1 mutatie is geassocieerd met een hogere leeftijd en herval, maar zoals kan afgelezen worden uit de tabel is deze associatie niet statistisch significant.

57 Hoofdstuk 4. Resultaten 50 Overleving Voor de dragers van een NPM1 mutatie (NPM1+) wordt er een trend naar een betere overleving gezien. Voor de populatie met een FLT3 mutatie (FLT3+) wordt geen verschil gezien in overleving in vergelijking met patiënten die deze mutatie niet dragen. In vergelijking met AML patiënten zonder NPM 1 mutaties (NPM1-/FLT3-ITD-), hebben de patiënten met een NPM1 mutatie in afwezigheid van een FLT3 mutatie (NPM1+/FLT3-ITD-) een betere prognose zowel wat ziektevrije overleving (mediaan= 19 maand, P=0.036) als wat totale overleving (mediaan= 19 maand; P=0.047) betreft. De gemiddelde en mediane overleving van de bestudeerde groepen wordt hieronder weergeven in tabel NPM1/FLT3 status Totale overleving (OS) Ziektevrije overleving (DFS) Aantal Gemiddelde (maand) Mediaan (maand) Gemiddelde (maand) Mediaan (maand) NPM1+/FLT NPM1+/FLT NPM1-/FLT NPM1-/FLT3+ 0 Tabel 4.12: Overleving volgens FLT3/NPM1 status bij CN-AML. Zoals valt af te lezen uit deze resultaten vermindert een FLT3 mutatie de relatief gunstigere prognose bij patiënten met een NPM1 mutatie. Om de impact van deze FLT3 mutatie op deze populatie na te gaan, wordt de overleving van patiënten met NPM1 en FLT3 mutatie vergeleken met patiënten met een NPM1 mutatie en wild type FLT3 (zie figuur 4.5).

58 Hoofdstuk 4. Resultaten 51 Figuur 4.5: A. Overlevingscurve van de totale overleving bij CN-AML met het NPM1/FLT3-ITD genotype. De verschillende p-waarden worden in een tabel hieronder weergeven. B. Overlevingscurve van de ziektevrije overleving bij CN-AML met NPM1/FLT3-ITD genotype. Totale overleving Ziektevrije overleving P(NPM1+/FLT3+ versus FLT3-/NPM1+) P(NPM1+/FLT3+ versus FLT3-/NPM1-) P(FLT3-/NPM1+ versus FLT3-/NPM1-) Tabel 4.13: P-waarden behorende bij figuur 4.5 Het genotype (FLT3-/NPM1+) heeft een duidelijk betere overleving dan de patiënten zonder een mutatie (FLT3-/NPM1-) (P=0.047) en de patiënten met zowel een FLT3 als een NPM1 mutatie (NPM1+/FLT3+) (P=0.032). Er wordt geen verschil in overleving (P=0.699) gezien tussen de groep met dubbele mutaties (NPM1+/FLT3+) en de groep met wild type NPM1 en FLT3 (FLT3-/NPM1-). De invloed van NPM1 op de prognose van de AML patiënten met een normaal karyotype en drager van een FLT3 mutatie kan niet berekend worden aangezien er in de populatie met een normaal karyotype alle patiënten met een FLT3 mutatie een bijkomende NPM1 mutatie dragen. De gunstige prognose die het dragen van deze laatstgenoemde mutatie met zich meebrengt, kan de ongunstige impact van FLT3 mutaties op de prognose bij AML patiënten verminderen.