Recente moleculaire inzichten in de etiologie, risicobepaling en behandeling van kinderen met acute lymfatische leukemie.

Transcriptie

1 Academiejaar Recente moleculaire inzichten in de etiologie, risicobepaling en behandeling van kinderen met acute lymfatische leukemie. Dorien Vanden Bossche Promotor: dr. Tim Lammens Scriptie voorgedragen in de 2de Master in het kader van de opleiding tot MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3 Voorwoord Aan het einde gekomen van deze masterproef kijk ik terug op een boeiende en leerzame ervaring. Reeds van bij het begin had dit onderwerp mijn interesse en deze is gedurende het verloop van de scriptie alleen maar toegenomen. In dit voorwoord wil ik de gelegenheid aangrijpen om een aantal mensen in de bloemetjes te zetten. Eerst en vooral wil ik mijn promotor, dr. Tim Lammens, bedanken voor zijn nauwgezette begeleiding. Hij stond steeds paraat om al mijn vragen te beantwoorden en om me op de goede weg te helpen bij de realisatie van deze masterproef. Door zijn gestructureerde aanpak kon ik al het werk aan deze thesis mooi verdelen over de gegeven periode van twee jaar en werd mijn interesse voor het onderwerp steeds weer aangewakkerd. Speciale dank gaat ook uit naar mijn ouders en naar Eleonore Smalle en Timo Tembuyser voor hun constante steun en luisterbereidheid. Zonder hun schouderklopjes zou de weg hiernaartoe er compleet anders uit gezien hebben. Dorien Vanden Bossche Gent, zondag 2 maart 2014 III

4 Inhoud Voorwoord... III 1 Abstract Inleiding Algemeen Epidemiologie Etiologie Classificatie Morfologische classificatie Immunologische classificatie (WHO-classificatie) Symptomen Diagnose en follow-up Cytomorfologisch onderzoek Cytochemische kleuringen Immunofenotypering met flow cytometrie Cytogenetica (karyotype) Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) Moleculaire biologie Minimal residual disease (MRD) Behandeling Remissie-inductie fase Consolidatie (intensificatie) therapie Onderhoudsbehandeling Transplantatie Methodologie Resultaten Kenmerken van het germline genoom Classificatie en risicopredictie via nieuwe moleculaire merkers Huidige prognostische factoren en risicostratificatie Early T-cell precursor ALL (ETP-ALL) IKZF MicroRNAs Methylatie BCR-ABL-like IV

5 4.2.7 Long non-coding RNAs (lncrnas) Behandeling: chemoresistentie, gevoeligheid en farmacogenetica Methotrexaat Asparaginase Discussie Referentielijst V

6 1 Abstract Acute lymfatische leukemie (ALL) is een maligne aandoening van lymfoïde progenitorcellen. ALL treft zowel kinderen als volwassenen, met bij kinderen een piek incidentie tussen de leeftijd van 2 en 5 jaar. Met de moderne behandelingsmogelijkheden kan men 80 tot 85% van de kinderen met ALL genezen. Het is cruciaal dat nieuwe behandelingsmodaliteiten gecreëerd worden die er voor zorgen dat we verdere vooruitgang boeken in de overleving van ALL-patiënten, terwijl de toxische bijwerkingen van de huidige (intensieve) regimes worden gereduceerd. In deze masterproef worden de recente moleculaire inzichten in de etiologie, risicobepaling en behandeling van kinderen met acute lymfatische leukemie onderzocht. Inzichten in de etiologie van ALL en het stellen van de correcte diagnose kennen een centrale rol in de individuele risicostratificatie en de therapeutische beslissingen. De moderne therapeutische concepten zijn namelijk gebaseerd op een individuele risicostratificatie bij de diagnose en gedurende follow-up. Om de moleculaire inzichten van de voorbije jaren op deze domeinen in kaart te brengen kwamen er drie grote lijnen aan bod, die uitgebreid onderzocht werden. Eerst en vooral werden de kenmerken van het germline genoom onder de loep genomen. Hierbij werd onderzocht welke overgeërfde genetische variaties bijdragen aan de predispositie tot pediatrische ALL. Vervolgens werd de classificatie en risicopredictie via nieuwe moleculaire merkers onderzocht. Patiënten worden ingedeeld in risicogroepen (en daarmee samenhangende behandeling) op basis van een aantal prognostische factoren. Enkele moleculaire merkers die onderwerp waren van recent onderzoek werden hier stelselmatig onderzocht, met specifieke interesse voor hun mogelijke prognostische betekenis. Ten slotte werd er aandacht besteed aan de recente trends in de behandeling van ALL. Hierbij werd er vooral gefocust op de invloed van polymorfismen op de werkzaamheid en op de toxiciteit van chemotherapeutica. In de nabije toekomst zal dit een belangrijke rol spelen in de gepersonaliseerde behandeling van kinderen met ALL. 1

7 2 Inleiding 2.1 Algemeen Leukemie is een kwaadaardige woekering van leukocyten of voorlopers daarvan. Er treedt dus een ongecontroleerde groei van cellen op. De mechanismen, die er voor zorgen dat celdeling en celdifferentiatie in overeenstemming zijn met de behoeften van het organisme, zijn verstoord (Figuur 1). (1,2,3) Figuur 1. De ontwikkeling van leukemie vereist een hematopoëtische stamcel of een voorloper, die ontsnapt aan de normale mechanismen van homeostatische controle die groeifactor signalen, differentiatie, apoptose en zelfvernieuwing regelt. Overgenomen uit ref. 3. De leukemieën kunnen opgedeeld worden in acute en chronische leukemieën. Bij acute leukemie is er een ophoping van onrijpe cellen of blasten, omdat de cellen niet alleen ongeremd gaan prolifereren maar ook hun vermogen tot differentiatie geheel of gedeeltelijk verloren hebben. Dit onderscheidt acute leukemieën van chronische leukemieën, waarbij de cellen nog differentiëren en waar er vooral een toename is van rijpere hematopoïetische cellen. Let wel: de term blast slaat op jonge, ongedifferentieerde cellen en betekent niet per definitie dat het om maligne cellen gaat. Het zijn meestal het hoge aantal en de morfologische context die bepalen of het kwaadaardige cellen betreft. De acute en de chronische vorm kunnen elk nog verder opgedeeld worden op basis van welke cellijn in de hematopoïese is aangetast, de myeloïde ofwel de lymfoïde cellijn. (1) De vier hoofdvormen zijn dus: - Acute myeloïde leukemie (AML) - Acute lymfatische leukemie (ALL) - Chronische myeloïde leukemie (CML) - Chronische lymfatische leukemie (CLL) Binnen deze thesis beperken we ons tot de groep van de acute lymfatische leukemie. Bij ongeveer 80% van de kinderen met de diagnose leukemie zijn de maligne cellen primitieve precursoren van B- lymfocyten en het overige deel zijn T-cel leukemieën. De abnormale cel kan ontstaan in verschillende stadia van de differentiatie. (1,2,4) 2

8 2.2 Epidemiologie ALL, de meest voorkomende pediatrische maligniteit, vertegenwoordigt 75% van leukemie in de pediatrische populatie, met een piek incidentie tussen 2 en 5 jaar. (2,5) In alle leeftijdsgroepen is er een kleine mannelijke predominantie en een duidelijke predominantie bij kinderen van het blanke ras. Er blijkt geen verschil in prognose te zijn afhankelijk van ras/etniciteit, alhoewel zwarte en Latijns-Amerikaanse kinderen vaker geconfronteerd worden met ernstigere vormen van ALL. (2,6) Met de moderne behandelingsmogelijkheden kan men 80 tot 85% van de kinderen met ALL genezen. (1,2,3) 2.3 Etiologie Alhoewel de oorzaak van ALL onbekend is, is het onwaarschijnlijk dat maligne transformatie het gevolg is van één enkele event. Het is een opeenvolging van diverse processen die genetische en epigenetische (epigenetisch: zie en 4.2.7) veranderingen veroorzaken. (4) Mogelijke blootstellingen die kunnen bijdragen aan maligne transformatie zijn straling (bv. radiotherapie), toxische stoffen (bv. benzeen), infectieuze agentia (bv. Human T cell lymphotropic virus type 1 of HTLV-1) en erfelijke genetische abnormaliteiten (bv. Down syndroom). (1,2,4) Eerdere onderzoeken hebben ook aandacht geschonken aan de genetische variabiliteit in xenobiotisch metabolisme, DNA herstel signaalcascades en celcyclus checkpoint functies die in interactie met omgevings-, dieet-, maternele en andere externe factoren de ontwikkeling van ALL kunnen in de hand werken. (5) Enkele van de genetische veranderingen die worden teruggevonden bij kinderen met ALL zijn reeds aanwezig in de hematopoëtische cellen nog voor de geboorte. Het bewijs hiervoor is afkomstig uit polymerase chain reaction (PCR) studies op de bloed spots (gekend als Guthrie cards), die bij de geboorte verkregen worden om te testen op aangeboren afwijkingen van het metabolisme en op endocriene stoornissen. (2) De prenatale oorsprong (of aanzet) van sommige ALL vormen werd verder aangetoond met behulp van genetische studies van identieke tweelingen met concordante leukemie en door de detectie van leukemie specifieke fusiegenen in neonatale bloed spots. (7) Tenslotte wordt leukemie frequent geassocieerd met bepaalde chromosomale afwijkingen en genetische syndromen. Zo bestaat er een verhoogd risico op acute leukemie bij kinderen met een constitutionele chromosomale afwijking zoals Down syndroom, Bloom syndroom en Fanconi anemie. 3

9 2.4 Classificatie Er worden twee vormen van classificatie gehanteerd: de morfologische classificatie en de immunologische classificatie. (1) Morfologische classificatie De klassieke morfologische classificatie is de FAB-(French-American-British)-indeling. Deze indeling was oorspronkelijk gebaseerd op de microscopische verschijning van de leukemische cellen op een Wright-Giemsa gekleurd uitstrijkje. De FAB-classificatie brengt drie morfologische groepen naar voor, L1, L2 en L3 genoemd. (6) Het L1 subtype bestaat uit kleine uniforme blasten met een vaag cytoplasma, een ronde of ovale nucleus en onduidelijke of afwezige nucleoli. De cellen zijn groter dan de kleine mature lymfocyten en het chromatine is meer homogeen en minder gecondenseerd. Dit subtype komt het frequentst voor. (4,6) Het L2 subtype bestaat uit grotere heterogene blasten met een matige hoeveelheid bleek basofiel cytoplasma, een ovale of onregelmatige nucleus, duidelijke nucleoli en minder homogeen chromatine. Dit subtype komt minder frequent voor. (4,6) Het L3 subtype bestaat uit grote blasten met een grote hoeveelheid duidelijk basofiel cytoplasma en veel vacuoles in het cytoplasma. Het nucleair chromatine is klompvormig en er zijn meerdere prominente nucleoli. Dit subtype is eerder zeldzaam en wordt gezien bij de diagnose van Burkitt lymfoom/leukemie. (4,6) Voor deze indeling kan men zich tevens baseren op het histologisch onderzoek van een beenmergbiopt of van een weefselinfiltraat na kleuring met hematoxiline en eosine (Figuur 2). (6) Figuur 2. De morfologie van ALL in uitstrijkjes en paraffine coupes. (A, B) ALL L1. (C D) ALL L2. (E, F) Morfologische bevindingen bij een patiënt met precursor B-ALL met hypodiploïdie, gelijkend op een hooggradig, matuur B-cel lymfoom (A, C, E, Wright- Giemsa stain) (B, D, F, hematoxyline-eosine; originele vergroting van 60x oil immersion). Overgenomen uit ref. 6. 4

10 2.4.2 Immunologische classificatie (WHO-classificatie) Voor deze classificatie baseert men zich op de aan- en afwezigheid van verschillende celoppervlakte antigenen. Op die manier maakt men een onderscheid tussen enerzijds B-ALL en anderzijds T-ALL. (1) Een specifiek immunofenotype, geïdentificeerd op het moment van de diagnose, kan ook gebruikt worden voor de evaluatie van de minimale residuele ziekte (minimal residual disease of MRD) op verschillende tijdspunten in de behandeling. (4) In een minderheid van de gevallen van ALL brengen de blasten antigenen tot expressie die normaal op myeloïde cellen teruggevonden worden (vb. CD13, CD33). Deze noemen we de bifenotypische leukemieën en presenteren zich klinisch noch als ALL, noch als AML. (4) 2.5 Symptomen De woekerende blasten verdringen de normale bloedaanmaak in het beenmerg, wat zich uit in anemie, leukopenie en trombocytopenie met de daarbij horende klachten en symptomen. (1) Anemie leidt tot bleekheid, vermoeidheid, kortademigheid bij geringe inspanning, hartkloppingen, soms pijn op de borst of zelfs myocardinfarct. (1,2,6) Leukopenie leidt tot koorts en infecties. (2) Trombocytopenie leidt tot bloedingen, die spontaan kunnen optreden, vooral blauwe plekken, tandvlees- of neusbloedingen, maar ook overvloedige menstruatie of persisterend bloedverlies na kleine traumata.. (2) Wanneer het centrale zenuwstelsel betrokken is, wat wel vaker voorkomt bij ALL, kunnen patiënten zich presenteren met symptomen van verhoogde intracraniale druk (hoofdpijn, braken) of met uitval van craniale zenuwen. (1) Hoeveel tijd er verloopt tussen het ontstaan van de leukemie en het optreden van symptomen is niet bekend, maar men neemt aan dat acute leukemie relatief snel verloopt en snel tot symptomen leidt. Desondanks kan men stellen dat leukemie in de beginfase sluipend verloopt en pas laattijdig klachten veroorzaakt, wanneer de ziekte het hele beenmerg heeft aangetast. Op het ogenblik van de diagnose van acute leukemie zullen de maligne cellen meestal ook aanwezig zijn in het bloed; uiteindelijk kunnen ze alle organen van het lichaam infiltreren. Het meest zijn lymfeklieren, lever en milt aangedaan, wat zich uit in lymfadenopathie en hepatosplenomegalie. Ook hersenvliezen,tandslijmvlies, huid en geslachtsorganen zijn vaak aangetast. Naast deze frequent voorkomende symptomen treden er soms verschijnselen op van verhoogd metabolisme en verhoogde celafbraak, wat zich manifesteert als koorts, anorexie, jicht of botpijn. (2) 5

11 2.6 Diagnose en follow-up De diagnose leukemie kent een multimodale benadering die cytomorfologie, cytochemisch onderzoek, immunofenotypering, flow cytometrie, chromosoom analyse (karyotypering), diverse fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) technieken en andere moleculaire analyses zoals quantitative polymerase chain reaction (qpcr) combineert. (8) Cytomorfologisch onderzoek In het algemeen is het parallelle cytomorfologisch onderzoek van perifeer bloed en beenmerg wenselijk. (8) De bloedtelling zal het volgende resultaat tonen: het aantal witte bloedcellen (WBC) zal meestal gestegen zijn (maar kan ook normaal of gedaald zijn), een laag aantal rode bloedcellen en een laag aantal trombocyten. Aan de hand van morfologisch onderzoek van het bloed en/of beenmerg zal men de origine van de blasten bepalen (T of B). Dit dient bevestigd te worden met immunofenotypering. (1) In sommige gevallen van ALL, zoals in precursor T-cel ALL of bij herval, vindt men belangrijke manifestaties terug op extramedullair niveau. Men kan dus ook biopten nemen van lymfenodi, testes, huid of centraal zenuwstelsel (CZS), wanneer er indicatie is voor de betrokkenheid van deze extramedullaire locaties. (4) Cytochemische kleuringen Voor cytomorfologie en cytochemie bij patiënten bij wie men een acute leukemie vermoedt, zijn meer dan 5 uitstrijkjes van beenmerg en perifeer bloed aan te raden. De uitstrijkjes worden gedroogd aan de lucht zonder fixatie. Dit wordt gevolgd door een Pappenheim of May Gruenwald Giemsa (MGG) kleuring. (8) Om het type acute leukemie te bepalen gebruikt men de Sudan black, myeloperoxidase (MPO) en nonspecifieke esterase (NSE) kleuringen. Deze kleuringen zijn klassiek positief bij AML en negatief bij ALL. (1,8) Cytochemische kleuringen zijn ook nuttig in het onderscheid tussen B-ALL en T-ALL. Maligne T- lymfocyten reageren met de zure fosfatase kleuring, terwijl de B-cellen positief kleuren met PAS (periodic acid shiff). Deze classificatie dient bevestigd te worden met immunofenotypering. (1,8) Immunofenotypering met flow cytometrie Immunofenotypische analyse wordt gebruikt om de morfologische diagnose van ALL te bevestigen en om verdere subtypes te onderscheiden (afhankelijk van het maturatiestadium waarin de blasten zich bevinden). Een specifiek immunofenotype, geïdentificeerd bij de diagnose, kan ook gebruikt worden 6

12 om de MRD te evalueren met behulp van flow cytometrie op verschillende tijdspunten in de behandeling. (4) Om het immunologische subtype te identificeren gebruikt men meestal antilichamen tegen CD19, CD79a en CD22 (meestal gevonden bij de B-ALL), antilichamen tegen CD10 ( the common ALL antigen ) en antilichamen tegen CD3 en CD7 (meestal gevonden bij T-ALL). (4) Cytogenetica (karyotype) Voor cytogenetisch onderzoek wordt beenmerg verkozen boven perifeer bloed, omdat de cultuur van metafasen gunstiger is en omdat de proportie van maligne cellen normaal groter is in het beenmerg. Ten minste 5x10 7 cellen moeten gekweekt worden in verschillende parallelle korte termijn culturen over periodes van en 48u om voldoende aantal metafasen te verkrijgen. De cultuur kan bevorderd worden door toevoeging van specifieke groeifactoren. Dit wordt gevolgd door de toediening van colchicine kort na de preparatie van de metafasen. Vervolgens worden er kleuringen uitgevoerd met Giemsa (G-), Quinacrine (Q-) of reverse (R-) banding technieken. Tenslotte worden de metafasen geanalyseerd met behulp van digital picture capture systems. Voor het onderzoek bij een vermoeden van ALL, zijn er minstens 25 metafasen nodig. (8) Cytogenetische abnormaliteiten worden geïdentificeerd in 60 tot 80% van de ALL patiënten. Leukemiecellen kunnen op meerdere manieren een afwijkend chromosomenpatroon vertonen. Er kunnen ofwel numerieke afwijkingen, ofwel structurele afwijkingen ofwel een combinatie van beiden aanwezig zijn. Diverse chromosomale afwijkingen zijn gecorreleerd met prognose (Zie Specifieke cytogenetische abnormaliteiten). Dit onderzoek is dus uiterst belangrijk omdat het prognostische informatie geeft en dus de te volgen therapie bepaalt. (1,2,8) Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) Een FISH analyse kan zowel op metafase als interfase nuclei uitgevoerd worden en vereist geen vitale cellen. De hybridisatie gebeurt s nachts, zodat de analyses 24u na aankomst van het sample in het laboratorium uitgevoerd kunnen worden. Minstens 100 interfase nuclei zouden moeten geëvalueerd worden. (8) Veelal zijn FISH analyses een bevestiging van de karyotypering (zie punt 4), maar deze techniek laat toe om ook kleinere afwijkingen te detecteren (niet zichtbaar via karyotypering) Moleculaire biologie Moleculaire analyse gebeurt door middel van PCR-gebaseerde technieken waarbij leukemie-specifieke moleculaire merkers worden nagekeken en gekwantificeerd (Zie Specifieke cytogenetische abnormaliteiten). Moleculaire analyses onthullen genetische merkers in 60 tot 80% van de patiënten met ALL. Verschillende van deze merkers kunnen opgevolgd worden tijdens de behandeling Deze 7

13 technieken hebben geen vitale cellen nodig hebben en kunnen dus op bewaard materiaal toegepast worden. (8,9) Minimal residual disease (MRD) De graad van reductie van de leukemische cellen in een vroeg stadium van de remissie-inductie therapie heeft een onafhankelijk prognostisch belang. (5) Morfologische methoden om het antwoord op behandeling te meten zijn echter niet specifiek en niet sensitief genoeg om deze celreductie op een betrouwbare manier weer te geven. DNA gebaseerde PCR analyse van clonale antigenreceptor genherschikkingen, RNA gebaseerde PCR analyse van leukemiespecieke fusiegenen (dit zijn vormen van qpcr) of flow cytometrische detectie van afwijkende immunofenotypes, laten dit wel toe met een heel hoge sensitiviteit, men spreekt hierbij over het bepalen van Minimale Residuele Ziekte (MRD, Minimal Residual Disease) (Figuur 3). Op die manier kunnen patiënten met een zeer laag of juist hoog risico op herval met succes geïdentificeerd worden, en kan het therapieplan daarop worden afgestemd (wat we risicostratificatie noemen). Het opvolgen van MRD tijdens en na de behandeling kan gebruikt worden voor de vroege detectie van een dreigend herval zodat vroegtijdig kan worden ingegrepen. (5) Figuur 3. Kaplan Meier curve van het relapse-free interval in functie van de aanwezigheid of afwezigheid en het niveau van residuele ziekte bij patiënten met ALL met een eerste complete remissie op het einde van de inductietherapie. P<0.001 voor de vergelijking tussen patiënten met residuele ziekte en deze zonder residuele ziekte en voor de vergelijking tussen patiënten met 10 2 residuele blasten en deze met <10 2 residuele blasten. Negen van de 15 patiënten met een hoog niveau van residuele ziekte ( 10 2 blasten) overleed, in tegenstelling tot 4 van de 118 met een lager niveau van residuele ziekte (<10 2 blasten). Het aantal patiënten dat weergegeven wordt onder de grafiek is het aantal met een standaard of zeer hoog risico van wie beenmergstalen beschikbaar waren. Bij 18 patiënten werd residuele ziekte gedetecteerd, maar was dit niet gekwantificeerd. Overgenomen uit ref

14 2.7 Behandeling De behandeling van ALL bestaat typisch uit een remissie-inductie fase, een consolidatie (of intensificatie) fase en een onderhoudsbehandeling om residuele ziekte te elimineren. In een vroeg stadium van de therapie wordt ook het centrale zenuwstelsel (CZS) behandeld om herval, toe te schrijven aan een afzondering van leukemische cellen in deze locatie, te vermijden. (2) Remissie-inductie fase Het doel van de remissie-inductie behandeling is om meer dan 99% van de initiële leukemische celhaard uit te roeien en om de normale hematopoëse en gezondheidsstatus te herstellen. Daartoe zijn meerdere kuren van intensieve chemotherapie noodzakelijk die telkens leiden tot een fase van aplasie, dat wil zeggen diepe beenmergsuppressie met de daaraan verbonden grote risico s op infectie en bloeding. Deze behandeling duurt 4 tot 6 weken en bestaat typisch uit de toediening van een glucocorticoïd (dexamethasone, prednisone of prednisolone), vincristine en één of twee andere geneesmiddelen: L-asparaginase en een anthracycline. Men begint dus met een of meer remissieinductiekuren waarbij men streeft naar complete remissie (CR). Dit is een situatie waarin men bij microscopisch onderzoek geen aanwijzingen meer vindt voor leukemie. Al is het bereiken van CR een voorwaarde om een kans te maken op genezing, op zichzelf betekent dit jammer genoeg niet dat een patiënt genezen is: klaarblijkelijk bevindt zich onder de morfologische detectiegrens in de meerderheid van de gevallen nog een aanzienlijke hoeveelheid leukemische cellen. Daarom zou zonder verdere behandeling bijna alle patiënten na verloop van tijd hervallen. De MRD wordt gemeten na 2 weken van remissie-inductie en bij patiënten met hoge hoeveelheden residuele blasten wordt de behandeling geïntensiveerd. De intensificatie van het inductie regime kan beoogd worden met de toevoeging van cyclophosphamide, asparaginase of cytarabine. Het gebruik van doelgerichte therapieën tijdens de inductie (vb.: de tyrosine kinase inhibitor imatinib voor Philadelphia positieve [Ph+] ALL) hebben de CR sterk begunstigd voor deze subtypes van ALL. (2) Klinische remissie kan nu geïnduceerd worden bij 96-99% van de kinderen. Falen van de inductie (gedefinieerd als meer dan 25% blasten in het beenmerg op dag 29 of op het einde van de inductieperiode) is weinig frequent (2% tot 5% van de gevallen) en is geassocieerd met een zeer slechte prognose. (2) Alhoewel de remissie uiteindelijk wel zal kunnen bereikt worden bij deze patiënten, zal de duurzaamheid van deze remissie meestal significant inferieur zijn ten opzichte van patiënten die snel reageerden op de inductie therapie. Een snelle respons op de inductie therapie is een belangrijke prognostische factor (Zie Huidige prognostische factoren en risicostratificatie), met een klaring van perifere blasten op dag 7/8 en van beenmergblasten op dag 15 als gevalideerde tijdspunten in vele protocolschema s. (2,11,12,13) 9

15 2.7.2 Consolidatie (intensificatie) therapie Eens de patiënt in remissie is, zal de consolidatietherapie toegediend worden, die de remissie van het beenmerg zal versterken. Het primaire doel van de consolidatie is om de residuele leukemische blasten uit te roeien en zo het risico op herval te reduceren. Tijdens deze fase zal ook de preventieve therapie voor het CZS toegediend worden. (2,4,11) Deze eerste fase van intensieve therapie duurt meestal 6 tot 12 maanden. De intensiteit van de behandeling is steeds afhankelijk van de prognostische risicocategorie waartoe de patiënt behoort. (2) Onderhoudsbehandeling Kinderen met ALL hebben een lange termijn onderhoudsbehandeling nodig ter preventie van of als anticipatie op een herval. De duur van deze onderhoudsbehandeling varieert gewoonlijk tussen 2 en 3 jaar. Aangezien jongens over het algemeen slechtere resultaten vertonen dan meisjes, hebben jongens mogelijks een voordeel bij het uitbreiden van de onderhoudsbehandeling tot 3 jaar. (2,7,11) Transplantatie In geselecteerde gevallen, bij hoog risico-patiënten of bij onvoldoende respons op de conservatieve therapie, kan een beenmergtransplantatie worden uitgevoerd. Hierbij wordt het aangetaste beenmerg volledig vernietigd met krachtige chemotherapie. Daarna gebeurt een transplantatie met allogeen donormerg. (2,11) 10

16 3 Methodologie In dit literatuuronderzoek werden drie fasen doorlopen. Tijdens de eerste fase van de literatuurstudie, de voorbereiding, werden de te bereiken doelen opgesteld. Eens dit gebeurd was werd een onderzoeksprotocol ontwikkeld. In dit onderzoeksprotocol werden de zoektermen geformuleerd, werden limieten bepaald en werd beslist welke bronnen zouden worden geraadpleegd om de literatuurstudie te doen. Voor deze literatuurstudie werd gebruik gemaakt van de elektronische databanken PubMed en Web of Science. Om aan de vraagstelling tegemoet te komen werd beslist om deze literatuurstudie te richten op de moleculaire ontwikkelingen die zich situeren in de voorbije vijf jaar. Als filter stelde ik dus published in the last 5 years in. In beide databanken werden specifiek volgende zoektermen ingegeven om tot artikels te komen voor de inleiding: acute lymphoblastic leukemia, pediatric, epidemiology, classification, diagnosis, treatment. Bij het zoeken naar relevante artikels voor de inleiding werden de zoekopdrachten beperkt tot reviews. Voor de resultaten werd tevens afgesproken om tot 5 jaar terug te gaan. Als filter stelde ik dus ook published in the last 5 years in. Alvorens over te gaan tot de opzoeking van relevante artikels voor de resultaten van deze masterproef werd in samenspraak met de promotor, dr. Tim Lammens, een selectie gemaakt van de topics die we aan bod willen laten komen. Op basis van deze afspraken werden de volgende zoektermen geformuleerd om tot artikels te komen voor de resultaten: acute lymphoblastic leukemia, pediatric, microrna, methylation, ETP, BCR-ABL-like, Ikzf1, SNP, methotrexate, asparaginase, ARID5B, lncrna. In een tweede fase werd dan de eigenlijke literatuurstudie gedaan. Deze tweede fase bestond uit de datacollectie en de data-extractie. Voor de datacollectie werden de vooropgestelde zoektermen en databases gebruikt. Een eerste selectie van artikels werd gemaakt door een analyse van de titel. De selectie werd dan verder doorgevoerd door de abstracts van de artikels uit de eerste selectie te lezen. Indien een titel als relevant werd bestempeld, volgde onmiddellijk de analyse van het abstract om meteen het artikel te selecteren of uit te sluiten. De eerste en tweede selectie gebeurden dus in één tijd. Daarna werden de overgebleven artikels in hun volledigheid geanalyseerd. Dit was dan de dataextractie. De artikels werden geanalyseerd met de vraagstelling van de literatuurstudie in het achterhoofd. In de derde fase van de literatuurstudie werden de resultaten van het literatuuronderzoek gerapporteerd. Hierbij werd per topic een grondige analyse gedaan van de geselecteerde artikels, waarna een structurering volgde in een overzichtelijke zelfgeschreven tekst. Dit kon dan later samengevoegd worden, met weglating van de informatie die irrelevant is voor de vraagstelling van dit literatuuronderzoek. 11

17 4 Resultaten 4.1 Kenmerken van het germline genoom De etiologie van pediatrische ALL blijft slecht begrepen. De initiatie van leukemogenese gebeurt tijdens het foetale leven of kort na de geboorte en wordt meest waarschijnlijk veroorzaakt door meerdere genetische factoren en omgevingsfactoren. (14) Twee recente genome-wide association studies (GWAS) verlenen overtuigend bewijs dat overgeërfde genetische variaties bijdragen aan de predispositie tot pediatrische ALL. (15,16) Beide studies vonden sterke associaties tussen varianten op 10q21.2 (ARID5B) en 7p12.2 (IKZF1) en het risico op pediatrische ALL. Zowel ARID5B als IKZF1 zijn betrokken bij de regulatie van transcriptie en differentiatie van B-lymfocytaire voorlopers. (14) In de studie van Healy et al. werd een poging gedaan om 15 van de initiële GWAS signalen uit de studies van Papaemmanuil et al. (GWA1) en Trevino et al. (GWA2) te repliceren. Dit leverde sterk significante associaties op in chromosomale regio 10q21.2. De 5 SNP s uit deze regio hebben betrekking op het ARID5B gen en zijn sterk geassocieerd met het risico op B-ALL. (14,17) In de studie van Trevino et al. werden de SNP s in ARID5B geassocieerd met B-hyperdiploïde ALL, welke een betere respons vertoont op methotrexaat (MTX) chemotherapie dan de andere ALLsubtypes. Deze respons is deels te wijten aan de grotere accumulatie van MTX polyglutamaten (MTX- PG) in B-hyperdiploïde ALL blastencellen dan bij niet-b-hyperdiploïde ALL blastencellen. Daarom werd er onderzocht of deze SNP s geassocieerd zijn met het klinische fenotype van MTX-PG accumulatie. Er werd bevonden dat dezelfde allelen van SNP s in ARID5B (rs en rs ), die geassocieerd zijn met B-hyperdiploïde ALL, ook geassocieerd zijn met grotere MTX-PG accumulatie (Zie Methotrexaat). (16) Op deze manier kunnen deze germline SNP s in ARID5B ook geassocieerd worden met outcome na behandeling van ALL. De associatie tussen het ARID5B SNP genotype en accumulatie in de leukemische cellen van MTX-PG vormt namelijk een verklaring voor het bestaande verband tussen ARID5B en ALL-herval. (18,19) 12

18 4.2 Classificatie en risicopredictie via nieuwe moleculaire merkers Huidige prognostische factoren en risicostratificatie De moderne therapeutische concepten zijn gebaseerd op een individuele risicostratificatie bij diagnose en gedurende de behandeling. Het is algemeen aanvaard dat een strenge risico-evaluatie op het moment van diagnose nodig is om onderbehandeling en overbehandeling te voorkomen. Patiënten worden ingedeeld in risicogroepen (en daarmee samenhangende behandeling) op basis van een aantal prognostische factoren. Vijf prognostische factoren zijn van belang op het moment van diagnose en gedurende de eerste maanden van behandeling. Deze factoren zijn (1) leeftijd op moment van de presentatie, (2) WBC op moment van de presentatie, (3) specifieke cytogenetische abnormaliteiten, (4) betrokkenheid van het CZS en (5) snelheid van initiële respons op chemotherapie. (2) Leeftijd op moment van de presentatie De risicogroepen die gedetermineerd worden door de leeftijd van de patiënt zijn de volgende drie: leeftijd minder dan 1 jaar (zuigelingen ALL), standaard risico ALL bij leeftijd tussen 1 en 10 jaar en hoog risico ALL bij leeftijd van 10 jaar of meer. De zuigelingen groep is een zeer hoog risico subcategorie van patiënten die meestal de t(4;11)(q21;q23) MLL genherschikking vertonen. Deze zuigelingen hebben tevens meestal een zeer hoog aantal WBC bij presentatie en een hoge frequentie van extramedullaire ziekte. Adolescenten (ouder dan 10 jaar) hebben over het algemeen ook een slechte prognose (Figuur 4). (2) Figuur 4. Kaplan-Meier curve van de event-free survival (EFS) in functie van de leeftijd op het moment van de diagnose van acute lymfatische leukemie. Overgenomen uit ref

19 WBC op moment van de presentatie Een WBC count van meer dan 50000/µL op het moment van de diagnose, is geassocieerd met een hoog risico op herval. Patiënten met extreem hoge WBC counts op het moment van de diagnose ( /µL) hebben een hoger risico op falen van de behandeling. (2) Specifieke cytogenetische abnormaliteiten Zowel structurele als numerieke afwijkingen bepalen de risicoclassificatie (zie ook FISH, KARYO en MOLECULAIR) (Figuur 5). Voor wat betreft numerieke afwijkingen onderscheidt men volgende deelgroepen: Hyperdiploïdie (20-25% van de pediatrische B-All populatie) wordt gedefinieerd als een chromosomenaantal van 50 of hoger of een DNA index van 1,16 of meer. Hyperdiploïdie is geassocieerd met een goede prognose. (2) Hypodiploïdie (5% van de pediatrische B-ALL populatie) wordt gedefinieerd als een chromosomenaantal van 45 of lager (of een DNA index < 1) en wordt geassocieerd met een slechte prognose. Haploïdie (23 chromosomen) heeft een nog slechtere prognose. (2) De prognostisch relevante structurele chromosomale afwijkingen zijn onderstaande translocaties: De translocatie t(12;21)(p13;q22) genereert het TEL-AML1 fusiegen. Dit is een gebalanceerde translocatie die gedetecteerd wordt met behulp van FISH of PCR. Deze translocatie is aanwezig in 25% van de pediatrische B-ALL patiënten en algemeen word aangenomen dat deze een gunstige prognostische factor is. (10) De translocatie t(9;22)(q34;q11.2) vormt het BCR-ABL fusiegen en staat beter bekend als het Philadelphia chromosoom (Ph+). Deze translocatie is aanwezig bij 5% van de patiënten met pediatrische ALL en de aanwezigheid van deze bepaalt een heel slechte prognose. (10) De translocatie t(1,19)(q23;p13.3) geeft aanleiding tot het E2A-PBX1 fusiegen. Deze translocatie komt voor bij 5-10% van de kinderen met pre-b ALL. Het prognostisch belang is niet erg duidelijk, maar werd in enkele studies als ongunstig geïdentificeerd.. Deze patiënten worden ingedeeld bij de risicogroep met een intermediair tot hoog risico. (10) Herschikkingen met betrekking tot het MLL gen op 11q23 zijn een andere belangrijke groep ALL-geassocieerde afwijkingen. De t(4;11)(q21;q23) is de frequentst voorkomende MLL genherschikking (5% van alle kinderen met ALL). MLL herschikkingen worden meestal gezien bij zuigelingen met pro-b ALL, een hoog aantal witte bloedcellen, organomegalie en CZS aantasting. Deze translocatie is dan ook geassocieerd met een slechte prognose. (2) 14

20 Ongeveer 25% van de pediatrische B-ALL patiënten valt niet onder bovenvermelde genetisch afwijkende deelgroepen (men noemt dit B-other) en in deze groep van patiënten treedt frequent herval op. Voor T-cel ALL is het verband tussen structurele chromosomale afwijkingen en prognose veel minder duidelijk dan bij precursor B-cel ALL. (11) De translocatie t(1;14)(p33;q11) met TAL1 overexpressie is een frequent voorkomende afwijking (3% van alle T-cel ALL). TAL1 is een transcriptiefactor die de genexpressie moduleert en een belangrijke rol speelt in de hematopoiese. De prognostische betekenis van TAL1 overexpressie is nog controversieel. Homologe transciptiefactoren zoals TAL2 en LYL1 zijn eveneens betrokken in translocaties van TCR loci bij T-cel ALL. (11,20) Andere frequent voorkomende translocaties bij T-cel ALL zijn t(10;14)(q24;q11) en t(7;10)(q35;q24) die leiden tot HOX11 overexpressie. Deze translocaties worden gevonden in 4-7% van de pediatrische T-cel ALL en zijn geassocieerd met een goede prognose. (20) Figuur 5. Kaplan-Meier curve van de event-free survival (EFS) in functie van het biologische subtype van leukemie. Overgenomen uit ref

21 Tabel 1. Samenvattingstabel van de cytogenetische abnormaliteiten. Type afwijking Resultaat Frequentie Prognose Hyperdiploïdie chromosomenaantal 20-25% van de goed van 50 of hoger pediatrische B-All populatie Hypodiploïdie chromosomenaantal 5% van de pediatrische slecht van 45 of lager B-ALL populatie t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 fusiegen 25% van de goed pediatrische B-ALL populatie t(9;22)(q34;q11.2) BCR-ABL fusiegen 5% van de pediatrische heel slecht B-ALL populatie t(1,19)(q23;p13.3) E2A-PBX1 fusiegen 5-10% van de kinderen onduidelijk met pre-b ALL t(4;11)(q21;q23) MLL genherschikking 5% van de pediatrische slecht B-ALL populatie t(1;14)(p33;q11) TAL1 overexpressie 3% van alle T-cel ALL controversieel t(10;14)(q24;q11) HOX11 overexpressie 4-7% van de goed pediatrische T-cel ALL t(7;10)(q35;q24) HOX11 overexpressie 4-7% van de pediatrische T-cel ALL goed Betrokkenheid van het CZS De betrokkenheid van het CZS in ALL neemt verschillende vormen aan, namelijk aantasting van meningen, craniale zenuwen en in sommige manifeste gevallen van leukemie is er zelfs invasie van het parenchym van de hersenen. De betrokkenheid van het CZS op het moment van de diagnose is een ongunstige prognostische factor en wanneer dit wordt vastgesteld moet de therapie geïntensifieerd worden. (2) Snelheid van de initiële respons op de therapie Dit werd reeds uitvoerig besproken in het hoofdstuk MRD (pagina 8). 16

22 4.2.2 Early T-cell precursor ALL (ETP-ALL) De studie door Coustan-Smith en collega s (21) richtte de aandacht op een factor die een verklaring kan vormen voor de slechte overleving van T-ALL patiënten en hoe het gebruik van een risicofactorgebaseerde therapie kan opgenomen worden in het design van nieuwe protocollen voor de behandeling van T-ALL. Er werd een nieuwe subgroep van T-ALL, early T-cell precursor ALL (ETP-ALL), geïdentificeerd bij 17 (12%) van de 139 patiënten met T-ALL die behandeld werden in drie opeenvolgende clinical trials in het St Jude Children s Research Hospital (Memphis, TN, USA) over een periode van 15 jaar. (21,22) ETPs zijn een subgroep van thymocyten met kenmerken van stamcellen die het potentieel hebben om te differentiëren in verschillende lineages, lymphoïde en myeloïde. De onderzoekers formuleerden de hypothese dat patiënten met een ETP-ALL een slechtere respons op behandeling zouden hebben omwille van hun stamcel kenmerken. ETP-ALL patiënten werden gekarakteriseerd door een onvolgroeid immunofenotype met een tekort aan CD1a en CD8 expressie, een zwakke CD5 expressie en expressie van één of meer myeloïde of stamcel merkers. Single nucleotide polymorphism arrays toonden significant grotere genomische winsten en deleties in vergelijking met de non-etp ALL groep, wat wijst op een grotere genomische instabiliteit (Figuur 6). Een bijzondere sterkte van deze studie is de bevestiging in een onafhankelijke groep van 100 patiënten met T-ALL, behandeld in het ALL-2000 protocol van de Associazione Italiana Ematologica Oncologica Pediatrica (AIEOP). In deze cohorte werden 13 patiënten (13%) geïdentificeerd met een ETP-ALL fenotype. (21,22) 17

23 Figuur 6. Gen expressie en immunofenotypische kenmerken van ETP-ALL. (a) Ongecontroleerde cluster analyse van diagnostische beenmergstalen van 55 pediatrische patiënten met T-ALL, met gebruik van een set van genen die differentieel tot expressie gebracht wordt bij ETP. Eén cluster (aangeduid door rode balkjes) had een gen expressie profiel gelijkend op dat van ETP-cellen. (b) Flow cytometrische contour dot plots die de immunofenotypes illustreren van normale thymocyten (residueel materiaal van zuigelingen die een open hart operatie ondergingen), en van representatieve gevallen van ETP en typische T-ALL. Elke staal werd simultaan gelabeled met de aangeduide antilichamen (ccd3 = cytoplasmic CD3) en geanalyseerd met een LSRII flow cytometer en DIVA software door gebruik te maken van een log density en bi-exponentiële setting. De verticale en horizontale lijnen in elke plot komen overeen met afwezige immunofluorescentie. (c) De heat map toont de percentages aan van positieve leukemische cellen voor elke van de opgelijste merkers onder de 139 St Jude T-ALL patiënten die bestudeerd werden bij de diagnose; grijs wijst op ontbrekende data. Elke rij stelt één patient voor en elke kolom het percentage van positieve leukemische cellen met de aangeduide merker. (d) Heat map van de top 150 genen die differentieel tot expressie gebracht worden, gerangschikt volgens P-waarde. Overgenomen uit ref. 21. Een opvallende bevinding is dat de patiënten met ETP-ALL een zeer slechte respons op therapie vertoonden, wat aangeeft dat dit een van de slechtste pediatrische ALL subgroepen is. De 10-jaars overall survival en de cumulatieve incidentie van ofwel falen van remissie ofwel hematologisch herval voor de St Jude patiënten was 19% en 72% voor de ETP-ALL groep, versus 84% en 10% voor de 18

24 patiënten uit de non-etp groep (Figuur 7). Er was ook een duidelijk bewijs voor resistentie tegen geneesmiddelen. Zo vertoonden de ETP-ALL patiënten een significant hogere proportie van detecteerbare MRD in vergelijking met de non-etp ALL groepen. (21,22) Figuur 7. Kaplan-Meier curves van (a, d) overall survival, (b, e) event-free survival, en (c, f) de cumulatieve incidentie van het falen van remissie of van hematologisch herval bij patiënten met typische T-ALL (grijze lijn) versus ETP-ALL (zwarte lijn) behandeld volgens ofwel het St. Jude (a c) ofwel het AIEOP protocol (d f). De event-free survival curves beginnen op het einde van de remissie-inductie (dag 43 voor St. Jude en dag 33 voor AIEOP patiënten). De geschatte overleving na 10 en 2 jaar follow-up wordt weergegeven; de P-waarden zijn het resultaat van de log-rank test. Overgenomen uit ref. 21. Een recente studie van Inukai et al (2011) (23) bepaalde de betrouwbaarheid van een beperkt panel van celmerkers om ETP-ALL te identificeren, gebruik makend van een voorgaande cohorte. Dit celmerker profiel, dat ETP-ALL het best kon onderscheiden, werd dan toegepast op een cohorte van 91 patiënten met T-ALL uit de Tokyo Children s Cancer Study Group L99-15 studie. In deze studie werd allogene stamceltransplantatie (allo-sct) toegepast bij patiënten met een slechte respons op prednisone. Vijf van de 91 patiënten (5,5%) voldeden aan de ETP-ALL criteria. Er waren geen significante verschillen in de klinische kenmerken bij presentatie tussen deze vijf patiënten en de overige 86 patiënten. De respons op vroege remissie-inductie therapie was inferieur bij ETP-ALL patiënten in vergelijking met T-ALL patiënten. De ETP-ALL subgroep vertoonde een significant slechtere event-free survival (40% na 4 jaar) dan de T-ALL subgroep (70% na 4 jaar). Van belang is dat drie van de vier hervallen ETP- ALL patiënten overleefden na allo-sct, wat erop wijst dat allo-sct effectief kan zijn voor dit geneesmiddelen-resistent subtype van T-ALL. (23,24) 19

25 4.2.3 IKZF1 Het Ikzf1-gen (7p12.2) codeert voor Ikaros, een DNA-bindend zinkvinger proteïne. Sinds de ontdekking van dit gen, onafhankelijk door K. Georgopoulos et al. (25) en de groep van S. Smale, heeft het wetenschappelijk onderzoek zich sterk verdiept in Ikzf1. Ikaros functioneert als een regulator van transcriptie, genexpressie en van chromatine remodelling. De biologische rol van Ikaros bestaat uit het reguleren van de ontwikkeling en de functie van het immuunsysteem en het werkt als de belangrijkste regulator van de hematopoïetische differentiatie. Genomic profiling studies hebben aangetoond dat Ikzf1 zich gedraagt als een van de meest klinische relevante tumor suppressors bij ALL. (26) Eén van de meest diepgaande studies rond Ikaros is waarschijnlijk deze van Mullighan et al (27). In deze studie van Mullighan et al werd gebruik gemaakt van een high-resolution genomewide copynumber analysis om genetische afwijkingen te identificeren die geassocieerd zijn met overleving. Het meest opmerkelijk was de sterke associatie tussen deleties of mutaties van Ikzf1 en een sterk gedaalde overlevingskans in twee onafhankelijke cohortes, gekenmerkt door een verschillende samenstelling en verschillende therapieschema s. In een multivariate analyse was de associatie tussen Ikzf1-status en overleving onafhankelijk van leeftijd, WBC-count bij presentatie, cytogenetisch subtype en niveaus van MRD. Dit toont aan dat de detectie van veranderingen in Ikzf1 op het moment van diagnose nuttig kan zijn om patiënten te identificeren met een hoog risico op falen van de behandeling. Bovendien zijn de kenmerken van genexpressie bij patiënten met ALL met een Ikzf1-deletie erg gelijkend op de kenmerken van BCR-ABL1-positieve ALL, een subtype van ALL waarbij Ikzf1-deletie zeer vaak voorkomt. Aangezien BCR-ABL1 ALL een slechte prognose heeft, suggereren deze bevindingen dat de mutatie in Ikzf1 een bepalende determinant is van een slechte outcome, zowel bij patiënten met BCR-ABL1-positieve als bij patiënten met BCR-ABL1-negatieve ALL. (27,28) Verder werd er vastgesteld dat Ikzf1-deleties significant correleren met een toegenomen frequentie van herval na 5 en 10 jaar en met resistentie voor chemotherapie. Opmerkelijk is dat de Ikzf1- associatie onafhankelijk is van BCR-ABL1 translocaties en andere risicofactoren. De pediatrische patiënten met Ikzf1-deleties vormen dus een groep met hoog risico ALL met een gestegen risico op herval. In de studie van Martinelli et al (28) werd dit onderwerp verder behandeld en onderzocht met behulp van SNP microarrays bij patiënten met BCR-ABL1 ALL. Hieruit bleek dat patiënten met Ikzf1-deleties een kortere cumulatieve mediane DFS en een hogere mediane CIR (cumulative incidence of relapse) hadden (Figuur 8 en 9). (28,29) 20

26 Figuur 8. Cumulatieve incidentie van herval bij de initiële behandeling van patiënten met Philadelphia chromosoom positieve acute lymfatische leukemia, behandeld met conventionele of experimentele therapie, waaronder een tyrosine kinase inhibitor (imatinib of dasatinib) en met een IKZF1- deletie, vergeleken met patiënten die behandeld werden volgens hetzelfde protocol, maar zonder een IKZF1-deletie (IKZF1 wild type [WT]). Overgenomen uit ref. 28. Figuur 9. Disease-free survival bij de initiële behandeling van patiënten met Philadelphia chromosoom positieve acute lymfatische leukemia, behandeld met conventionele of experimentele therapie, waaronder een tyrosine kinase inhibitor (imatinib of dasatinib) en met een IKZF1-deletie, vergeleken met patiënten die behandeld werden volgens hetzelfde protocol, maar zonder een IKZF1-deletie (IKZF1 wild type [WT]). Overgenomen uit ref. 28. Samengevat kunnen we stellen dat: Ikaros is een sterke klinische significante tumor suppressor bij B-ALL en voornamelijk bij hoog risico B-ALL. (26) Een matige daling van de activiteit van Ikaros (bv.: haploinsufficiëntie) is voldoende om bij te dragen aan leukemogenese. (26) Genetische veranderingen in Ikzf1 kunnen dienen als een prognostische marker voor de overleving van B-ALL patiënten. (26) 21

27 De status van Ikzf1-deleties is een onafhankelijke prognostische factor. De hoge frequentie van voorkomen van deze Ikzf1-lesies verhoogt de prognostische power nog ten opzichte van andere hoog risico cytogenetische abnormaliteiten. (26) Samengevat illustreren deze bevindingen de prognostische kracht van het in kaart brengen van Ikzf1-deleties. In de toekomst zal dit een bijkomende belangrijke factor vormen in de risicostratificatie bij de diagnose, wat zal leiden tot een verfijnde stratificatie in de verschillende behandelingsgroepen. (30,31) Voor wat betreft de impact van IKZF1 deleties op prognose in de T-ALL subgroep is veel minder gekend (alhoewel waargenomen in minstens 5% van de T-ALL patiënten). (26) MicroRNAs Recent zijn de microrna (mirna, mir) moleculen opgekomen als nieuwe speler op het vlak van genregulatie bij normale ontwikkeling en kankerbiologie. MicroRNAs zijn kleine (± 21 nucleotiden) niet-coderende RNAs die evolutionair bewaard zijn gebleven. Ze regelen de expressie van genen die coderen voor proteïnen door de degradatie van het corresponderende mrna of door het onderdrukken van translatie (figuur 10). In het humane genoom zijn meer dan 1000 micrornas geïdentificeerd. Men schat dat zij verantwoordelijk zijn voor de regulatie van ongeveer 30% van de menselijke genen. (32,33) De algemene biogenese pathway van mirna begint met de synthese van een primair transcript (primirna) door het RNA polymerase II (Pol II). Dit pri-mirna wordt gekarakteriseerd door een typische haarspeldstructuur (± 70 nucleotiden). In de kern worden deze pri-mirnas bewerkt door het ribonuclease Drosha. Dit leidt tot de vorming van het precursor mirna (pre-mirna), hetgeen vervolgens getransporteerd wordt naar het cytoplasma met behulp van exportin-5. In het cytoplasma wordt het pre-mirna dan verder verwerkt door het RNase Dicer met vorming van de mirnamirna* duplex. Vervolgens worden in het Dicer-complex de beide strengen uit elkaar gehaald. Tijdens dit proces knipt Dicer 20 tot 25 nucleotiden van de basis van de haarspeld af en levert zo een matuur mirna af. In de duplex is mirna de guide streng die samen met een argonaut-eiwit (Agoeiwit) in het RNA-induced silencing complex (RISC) zal verwerkt worden. Met mirna* wordt de passenger streng bedoeld die afgebroken wordt. Wanneer het mirna dan bindt aan een (onvolkomen) complementaire mrna sequentie (meestal t.h.v. de 3-prime untranslated region, 3 UTR) zal dit resulteren ofwel in de degradatie van het mrna ofwel in de inhibitie van de translatie van het target mrna. In beide gevallen leidt dit tot een daling van de overeenkomstige proteïneniveaus (figuur 10). (32,34,35) 22

28 Figuur 10. Biogenese van micrornas. Na de synthese door polymerase II wordt het primaire mirna transcript (pri-mirna) bewerkt door Drosha. Dit resulteert in het precursor mirna (premirna). Exportin 5 levert het pre-mirna af aan het cytoplasma. Verdere bewerking door Dicer genereert het mature mirna. De binding en ontwinding door het Argonaut-bevattende RNA Induced Silencing Complex (RISC) resulteert in het transport naar het target mrna. Dit resulteert dan uiteindelijk in de degradatie van of de inhibitie van translatie van het target mrna. * wijst op de passenger streng die afgebroken wordt. Overgenomen uit ref. 32. Verschillende recente publicaties rapporteerden dat de expressieniveaus van mirnas een aanvulling zouden kunnen zijn op de diagnostische methodieken en de strategieën voor classificatie van ALL die op dit moment gebruikt worden in de klinische praktijk. (32) Verschillende studiegroepen publiceerden reeds over mirnas en mirna-signaturen die gebruikt kunnen worden om ALL te onderscheiden van andere hematologische maligniteiten. (32) De meest gedetailleerde studies met betrekking tot mirna-expressie bij de verschillende genetische subgroepen van pediatrische ALL werden gepubliceerd door Schotte en collega s. (35,36) 23

29 Eerst onderzochten ze dit fenomeen door 113 (105 gekende en 8 nieuwe) mirna-genen te kloneren die tot expressie komen in leukemische cellen. Door 19 geselecteerde mirna-genen te kwantificeren kon men aantonen dat deze genen een afwijkende expressie vertonen bij ALL in vergelijking met normale CD34+ cellen. Men observeerde zowel opregulatie (14/19) als neerregulatie (5/19) van de expressie. (35) In een meer recente publicatie van Schotte et al. (36) werden de expressieniveaus van 397 micrornas nagegaan bij 81 pediatrische ALL patiënten en 17 gezonde controles. Het doel van deze studie was om duidelijk te maken welke mirnas uniek zijn voor de zeven verschillende subgroepen van pediatrische ALL (BCR-ABL1, MLL-herschikte, ETV6-RUNX1, E2A-PBX1, hyperdiploïde, B-other en T-ALL) (Tabel 2). Met uitzondering van BCR-ABL1-positieve en B-other ALL, vertoonden alle subgroepen een unieke mirna-signatuur die ze onderscheidt van alle andere subtypes en van de gezonde controles. BCR-ABL1 en B-other ALL waren niet te onderscheiden als afzonderlijke groepen. Dit wijst erop dat BCR-ABL1 en B-other ALL meer heterogene subgroepen zijn en/of dat mirnas een mineure rol spelen in deze subgroepen. (32,33,36) Tabel 2. De meest specifieke mirnas per subtype van ALL. Overgenomen uit ref. 33. Verder toonden deze auteurs ook aan dat de ETV6-RUNX1-groep op basis van de mirna-expressie onderverdeeld kan worden in twee groepen, weliswaar zonder prognostische verschillen. Eén van deze twee subgroepen vertoont een mirna-signatuur die gedeeltelijk overlapt met die van de 24

30 hyperdiploïde groep (gemeenschappelijke hoge expressie van mir-30b, mir-151, mir-331, mir-545). Dit suggereert dat ze een gemeenschappelijke onderliggende biologie hebben. (32,33,36) In de studie van Schotte et al. (36) werd onderzoek gedaan naar de expressie van mirnas in cellen die resistentie vertoonden aan enkele individuele chemotherapeutische agentia (vincristine, daunorubicine, prednisolone en L-asparaginase) (Tabel 3). Dit leidde tot de volgende bevindingen: (33,36) Resistentie aan vincristine en daunorubicine wordt gekarakteriseerd door een ± 20-voudige opregulatie van mir-125b, mir-99a en mir-100. In totaal waren er 20 verschillende mirnas op basis waarvan men resistentie aan vincristine en/of daunorubicine kon definiëren. (33,36) Er werden geen mirnas gevonden die een onderscheid konden maken in prednisolone respons. (33,36) L-asparaginase resistentie kon enkel geassocieerd worden met lage expressie van mir (33,36) Tabel 3. Overzicht van de meest specifieke mirnas die geassocieerd zijn met resistentie tegen enkele veel gebruikte geneesmiddelen in de behandeling van pediatrische ALL. Overgenomen uit ref. 33. Naast deze studie zijn er diverse andere auteurs die de rol van mirnas in classificatie, resistentie, en prognose hebben geëvalueerd. Dit valt echter buiten het bestek van deze masterproef Methylatie Het begrip methylering beschrijft de toevoeging van een methylgroep aan een cytosine, waardoor een methylcytosine gevormd wordt (figuur 11a). In de regel gebeurt dit slechts als deze cytosine (C) gevolgd wordt door een guanine (G), de zogenaamde cytosinefosfaatguanine(cpg)-sequentie (de p staat voor de fosfaatgroep die de C en de G aan elkaar verbindt; dit in tegenstelling tot een C en een G uit twee verschillende DNA-strengen die complementair zijn). In het genoom bevinden zich zogenaamde CpG-eilanden, CG-rijke gebieden in de promotorregio van het gen, dat is de DNAsequentie die ervoor zorgt dat de transcriptie van een gen kan plaatsvinden. Normaal gesproken zijn deze gebieden gehypomethyleerd (Figuur 11b), waardoor het DNA toegankelijk is voor transcriptiefactoren en transcriptie kan plaatsvinden. (37) 25

31 Figuur 11. (a) Vorming van 5-methylcytosine onder invloed van het enzym DNA-methyltransferase (DNMT). DNMT katalyseert de methylering op de 5-positie van de cytosinering, waarbij S-adenosylmethionine donor is van de methylgroep (CH3); 26

32 (b,c) methylering en samenhangende processen onder normale omstandigheden en bij neoplastische transformatie; (b) normaal gesproken is het cytosinefosfaatguanine(cpg)-eiland in de promotorregio (exon 1) van het tumorsuppressorgen ongemethyleerd en kan derhalve transcriptie daarvan plaatsvinden; de startplaats van de transcriptie is namelijk toegankelijk voor het zogenaamde transcriptiecomplex dat bestaat uit histonacetyltransferase (HAT), transcriptiefactoren (TF) en coactivatoren (CA); het ongemethyleerde DNA is daardoor beschermd tegen de activiteit van DNA-methyltransferasen (DNMT s) en transcriptierepressiecomplexen die methylcytosinebindende proteïnen (MBP) en histondeacetylasen (HDAC) bevatten; buiten de promotorregio (exon 2 en 3) zijn de gemethyleerde CpG s gemethyleerd gebonden aan repressieve MBP HDAC-complexen; (c) tijdens carcinogenese worden steeds meer CpG-eilanden gemethyleerd, waardoor transcriptie wordt voorkomen en het tumorsuppressorgen wordt geïnactiveerd; in de tumorcel vindt door tussenkomst van DNMT s hypermethylering van CpG s in de promotorregio plaats; HDAC-MBP-repressiecomplexen binden aan de startplaats van de transcriptie ten koste van het transcriptiecomplex. Overgenomen uit ref. 37. Gedurende de voorbije jaren is onze kennis betreffende de globale patronen van genomische veranderingen bij pediatrische ALL sterk toegenomen. Toch zijn er weinig studies die aandacht geven aan de genome-wide epigenetica van pediatrische ALL. Dit is verbazingwekkend, aangezien CpG hypermethylatie van tumor suppressor genen frequent voorkomt bij verschillende neoplastische aandoeningen. (38) In de studie van Davidsson et al. (38) werd een grootschalige analyse uitgevoerd met als doel het globale methylatie profiel te bepalen in patiënten met pediatrische ALL. Hiervoor werden primaire stalen onderzocht van de twee meest voorkomende genetische subgroepen van pediatrische ALL, nl. t(12;21)(p13;q22) leidend tot ETV6/RUNX1 en hoog-hyperdiploïde ALL (>50 chromosomen). Dit leidde tot de volgende bevindingen: (38) Transcriptie regulerende factoren waren vaak hypergemethyleerd. Sommige van deze genen (voornamelijk deze met een hypermethylatie-status in beide ALL subgroepen) zijn ook fysiologisch gehypermethyleerd bij vroege B-cel precursoren en dit zou dus geassocieerd zijn met een normale B-cel ontwikkeling. De genen, die niet gemeenschappelijk gehypermethyleerd zijn bij de twee genetische subgroepen, zijn hoogstwaarschijnlijk van belang bij leukemogenese. (38) Onder de genen met een significante methylatie van de promotor vertoonde slechts 30-60% een onderexpressie. Hypermethylatie op zich leidt dus niet noodzakelijk tot een verminderde genexpressie. Dit toont aan dat andere factoren naast de CpG-eiland methylatie een invloed hebben op de patronen van genexpressie. (38) De tri/tetrasome chromosomen bij de patiënten met hoog-hyperdiplïde ALL waren minder gemethyleerd dan hun disome tegenhangers. (38) De detectie van methylatie hotspots die specifiek zijn voor een subtype toont aan dat ETV6/RUNX1-positieve en hoog-hyperdiploïde ALL gekarakteriseerd worden door verschillende globale methylatie patronen (Figuur 12). (38) 27

33 Figuur 12. Vijfentachtig verschillende hotspot voor methylatie, afgeleid uit de promoter CpG island array, werden geïdentificeerd bij hoog-hyperdiploïde en bij ETV6/RUNX1-positieve ALL-patiënten. De hotspots die gemeenschappelijk waren voor beide genetische subtypes worden weergegeven als zwarte balkjes (n=30), de hotspots die uniek waren voor de patiënten met ETV6/RUNX1-positieve ALL zijn blauw (n=8), en de hotspots die uniek zijn voor de patiënten met hooghyperdiploïde ALL zijn rood (n=20). Overgenomen uit ref. 38. Naast de evaluatie van genomewide methylatie zijn er ook enkele studies die zich focussen op het onderzoek van de methylatie van een aantal genen. In de studie van Milani et al. (39) werden de patronen van DNA-methylatie van 416 genen geanalyseerd bij 401 kinderen met ALL. De meerderheid van de genen (n=391) die opgenomen waren in deze analyse, waren geselecteerd op basis van de resultaten van een onderzoek naar allel-specifieke genexpressie (ASE) van 8000 genen (40). Bij de selectie van deze genen was de hypothese dat de methylatie van CpG-sites in één promotor aanleiding geeft tot ASE door de expressie van één van de allelen te onderdrukken. (39,40) In deze studie werden voor het eerst significante verschillen in de methylatie patronen beschreven tussen B-cel precursor (BCP) en T-ALL en tussen subgroepen van BCP-ALL. Deze verschillen werden geïdentificeerd door gebruik te maken van hiërarchische clustering. Voor de eerste keer werden er ook veelbelovende resultaten beschreven voor de classificatie van ALL-subtypes op basis van methylatie patronen. De resultaten tonen aan dat een profiel van 40 genen een accuraat onderscheid maakt tussen vier subtypes van BCP-ALL. Additionele methylaties van 2 tot 43 genen maken een onderscheid tussen T-ALL en BCP-ALL en tussen subgroepen van BCP-ALL in paarsgewijze analyses. Binnen subtypes observeerde men dat meerdere genen sterk vergelijkbare methylatie patronen hebben in een ALL-subtype, alhoewel ze gelokaliseerd zijn op verschillende chromosomen. Er vormen zich dus interchromosomale netwerken die het onderwerp zijn van gemeenschappelijke epigenetische mechanismen die de genexpressie regelen. (39) Zeer interessant is dat een DNA-methylatie analyse potentieel gebruikt kan worden voor de stratificatie van patiënten met een verschillende klinische prognose. Bij de hiërarchische clustering van patiënten met het hoog-hyperdiploïde karyotype werd een subgroep gedefinieerd met een toegenomen 28

34 risico op herval (Figuur 13). Als dit bevestigd wordt, dan kunnen dergelijke data nuttig zijn bij de stratificatie van patiënten in verschillende protocollen voor intensiteit van behandeling. De hiërarchische clustering van patiënten met t(12;21) identificeerde ook een groep met verhoogd risico op herval, maar dit bleek uiteindelijk geen onafhankelijke prognostische waarde te hebben (Figuur 13). Niettemin werden in een explorerend onderzoek, waarin gebruik gemaakt werd van het methylatie level van individuele genen, additionele genen geïdentificeerd waarvan de methylatie levels correleerden met het risico op herval in elke van de hoofd subgroepen van ALL, waaronder t(12;21) en de T-ALL groepen. De sets van genen uit deze twee benaderingen overlappen gedeeltelijk. Voor de meerderheid van de genen correleert een hoog methylatie level met een gunstige prognose. In de toekomst kunnen data met betrekking tot methylatie van CpG-sites in een geselecteerd aantal genen hopelijk gebruikt worden om diagnostische tests te ontwikkelen die pediatrische ALL patiënten indelen in subgroepen. (39,41) 29

35 Figuur 13. Hiërarchische clustering om een onderscheid te maken tussen de subtypes van ALL op basis van methylatie profielen. In het dendrogram wordt elk individu weergegeven als een horizontale lijn en de kleur van de lijn komt overeen met het cytogenetisch subtype van het individu. De kleurencode voor de verschillende subtypes van ALL wordt weergegeven boven het dendrogram. De CpG sites zijn gegroepeerd op basis van het niveau van methylatie en ze worden weergegeven in de verticale kolommen. Hoge niveaus van methylatie worden weergegeven in het rood en lage niveaus van methylatie in het blauw, zoals te zien is op de schaal onder de figuur. Overgenomen uit ref

36 4.2.6 BCR-ABL-like In een studie van Den Boer et al. (2009) (42) werd recent een nieuw hoog-risico ALL-subtype geïdentificeerd aan de hand van genoomwijde genexpressie profilering. Met behulp van een 100-tal probe-sets konden de 190 onderzochte kinderen met ALL bij diagnose accuraat worden ingedeeld in de gekende genetische ALL-subtypes (T-ALL, ETV6-RUNX1+ ALL, hyperdiploidie, E2Aherschikking en BCR-ABL1+ ALL). Verscheidene patiënten met precursor B-cel ALL die niet tot deze subtypes behoorden, bleken echter een gemeenschappelijk genexpressie patroon te vertonen. Dit patroon was sterk vergelijkbaar met het genexpressie patroon van de prognostisch ongunstige BCR- ABL1+ ALL en werd dan ook BCR-ABL1-like ALL genoemd. Het aantal patiënten dat een herval kende was significant hoger dan bij patiënten met andere subtypes van precursor B-cel ALL (B-other) (37% vs 16%, P=0.020). De 5-jaars ziektevrije overleving was bij patiënten uit deze nieuwe subgroep daarenboven significant lager dan bij patiënten uit de B-other groep (59.5% vs 84.4%, P=0.012). Het genexpressie patroon en de ongunstige prognostische betekenis van het BCR-ABL1-like ALL-subtype werd bevestigd in een validatiecohorte van 107 nieuw-gediagnosticeerde pediatrische ALL-patiënten. Na multivariate analyse bleek het BCR-ABL1-like ALL-subtype in beide cohortes een onafhankelijke prognostische merker te zijn (Figuur 14). (42) Figuur 14. Kaplan-Meier curve van disease-free survival (pdfs) bij kinderen met precursor B-ALL. De COALL precursor B-ALL cohorte (links) bestond uit 145 patiënten van COALL-92/97 en negen van DCOG ALL-9 behandeld in het Sophia Children s Hospital. Als referentie gebruikte men de data van 22 patiënten met BCR ABL1-positieve ALL uit het COALL- 92/97 protocol. In de univariate analyse van pdfs, waarin men 30 BCR ABL1-like patiënten vergeleek met 119 precursor B-ALL patiënten (er werden vijf BCR ABL1-positieve patiënten uitgesloten): p= De curves waren ongeveer gelijk wanneer de negen DCOG patiënten werden uitgesloten. De DCOG precursor B-ALL cohorte (rechts) bestond uit 92 kinderen van DCOG-ALL8. Als referentie gebruikte men de data van 25 BCR ABL1-positieve patiënten uit de DCOG-ALL-7, 8, and 9. In de univariate analyse van pdfs, waarin men 14 BCR ABL1-like patiënten vergeleek met 77 precursor B-ALL patiënten (uitsluiting van BCR-ABL1-positieve patiënt): p= Overgenomen uit ref

37 Verdere genetische karakterisatie met array-cgh maakte zeven recurrente deleties en één recurrente amplificatie bekend in BCR-ABL1-like patiënten. Patiënten met BCR-ABL1-like en BCR-ABLpositieve ALL hadden meer recurrente abnormaliteiten dan diegenen met BCR-ABL1-negatieve precursor B-ALL. Deleties in chromosoom 9p en 20q kwamen het meest voor, terwijl recurrente amplificaties beperkt waren tot een duplicatie van chromosoom 21q21-q22. Deze intrachromosomale amplificatie is geassocieerd met een slechte prognose. De gedetaileerde analyse van gedeleteerde regio s van chromosoom 9p onthulde dat enkele patiënten een breekpunt hadden in het PAX5 gen (9p13.2). Omdat dit gen codeert voor een transcriptiefactor, essentieel voor de normale B-cel ontwikkeling, onderzocht men of andere genen betrokken in de normale B-cel ontwikkeling getroffen waren door focale deleties. De aangetaste genen waren de transcriptiefactoren IKZF1 (IKAROS), TCF3 (E2A), EBF1, PAX5 en de pre-b-cel receptor (pre- BCR) surrogaat light chain VPREB1. In de andere B-cel transcriptiefactoren werden geen deleties gevonden. In patiënten met BCR-ABL1-positieve ALL werden ook abnormaliteiten gevonden in IKZF1, PAX5 en VPREB1, wat (althans deels) de gelijkenis in gene-expression signature kan verklaren tussen BCR-ABL1-like en BCR-ABL1-positieve leukemieën (Tabel 4). (42) Tabel 4. Vaak voorkomende deleties in genen betrokken bij de B-cel ontwikkeling, karakteristiek voor BCR ABL1-like en BCR ABL1-positieve ALL. Overgenomen uit ref Long non-coding RNAs (lncrnas) Recent onderzoek heeft aangetoond dat een groot deel van het genoom transcriptie ondergaat naar non-coding RNA (ncrna). Er werden verschillende klasses van ncrna geïdentificeerd op basis van hun lengte en/of functie. Zo onderscheidt men onder andere ribosomale en transfer RNAs en micrornas (Zie MiRNA). Long ncrnas (lncrnas) zijn RNAs van meer dan 200 nucleotiden lang. Recent is gebleken dat ze essentieel zijn voor een grote verscheidenheid van biologische processen, waaronder de epigenetische controle van chromatine (43), promoter-specifieke genregulatie (44,45), inactivatie van het X- chromosoom (46,47), imprinting (48,49), nucleaire import (50), en het behoud van de structuur van het celkern 32