MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

Transcriptie

1 MASTER OF MEDICINE IN DE GENEESKUNDE

2

3 Inhoudsopgave Inhoudsopgave... Voorwoord Abstract Inleiding Algemene pathogenese en indeling Epidemiologie Etiologie Genetisch factoren Fysische factoren Ioniserende straling Niet-ioniserende straling Chemische factoren Virale factoren Leefstijl factoren Classificatie Cytomorfologische classificatie Immunofenotypische en cytogenetische classificatie Symptomen en kliniek Genetische defecten Numerieke afwijkingen Hyperdiploïdie Hypodiploïdie Near haploïdie Structurele afwijkingen B-ALL ETV6-RUNX E2A-PBX BCR-ABL (Philadelphia chromosoom) MLL herschikkingen T-ALL TAL HOX Diagnose Biologie Cytomorfologie (microscopie) Immunofenotypering Flowcytometrie Cytogenetica Conventionele cytogenetische analyse Fluorescence in-situ hybridisatie (FISH) Moleculaire evaluatie Polymerase chain reaction (PCR) Array Comparative Genomic Hybridization (acgh) analyse Radiografie Therapie Remissie-inductie fase Glucocorticoïden Asparaginase Imatinib en dasatinib... 15

4 2.8.2 Intensificatie fase (consolidatie fase) Onderhoudsfase Behandeling van het centraal zenuwstelsel Allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (Allo-HSCT) Risicostratificatie Aantal witte bloedcellen (WBC) Leeftijd Cytogenetische afwijking Minimal residual disease (MRD) CZS infiltratie Farmacogenetica Methodologie en doelstelling Pubmed Web of Science Resultaten Herval: prevalentie, prognose, outcome en therapeutische mogelijkheden Herval en klonaliteit Vaak voorkomende mutaties in signaaltransductiewegen en de implicaties voor innovatieve behandelingsopties bij herval van ALL Epigenetica CREBBP SETD JAK-STAT pathway Nucleoside metabolisme PRPS NT5C Glucocorticoïden pathway TBL1XR1 deleties Immunotherapie CAR T-cellen Cytokine release syndroom (CRS) Tumor lysis syndroom (TLS) Macrofaag activatie syndroom, neurotoxiciteit en aplasie Blinatomumab Discussie Referenties Bijlagen... I Bijlage 1: Kaplan-meier plots met ziektevrije en totale overleving van 2852 behandelde kinderen met primaire ALL tussen 1962 en I Bijlage 2: Respons van CREBBP mutante cellen op dexamethasone en vorinostat... II Bijlage 3: Chemo-resistentie tegen 6-MP en 6-TG bij NT5C2 mutante cellen.... III Bijlage 4: Afkortingen... IV

5 Voorwoord Het schrijven van deze scriptie is een eerste stap geweest om mezelf te kunnen verdiepen in een subdomein van de geneeskunde. Nu ik terugblik op mijn scriptie, ben ik nog steeds enorm tevreden met de keuze van dit onderwerp. Graag had ik op voorhand enkele mensen willen bedanken die voor mij een cruciale rol spelen in mijn studie en bij het schrijven van mijn masterscriptie. In de eerste plaats gaat mijn dank uit naar mijn promotor, prof. Dr. Tim Lammens, die mij in ieder opzicht steeds verder bracht in het leer- en schrijfproces. Hij stond te allen tijde klaar voor het nalezen van mijn tussentijdse versies, voor motiverende en opbouwende commentaar, voor verdere suggesties, voor aandachtspunten en verbeteringen, voor het beantwoorden van al mijn vragen en het verduidelijken van moeilijkere thema s die hier aan bod zullen komen. Verder wil ik mijn ouders bedanken, voor de onvoorwaardelijke steun en motivatie die zij mij altijd blijven geven in mijn studies. Zij zijn mijn eerste aanspreekpunt in moeilijkere tijden en zijn de meest trotse ouders wanneer mijn broer en ik slagen in onze persoonlijke doelen. Daarnaast wil ik ook graag mijn vriend danken voor zijn interesse en eeuwige geduld in mijn studies. Justine Vanderstraeten Oktober 2016

6 1. Abstract Achtergrond: Acute lymfatische leukemie, gekenmerkt door een ongecontroleerde proliferatie van onrijpe lymfoïde stamcellen, is de meest frequente kinderkanker en gaat vaak gepaard met herval (15-20%). Ondanks de vooruitgang van de prognose van primaire ALL bij kinderen (met een overleving van 80-85%), wordt herval geassocieerd met een zeer ongunstige prognose o.a. omwille van therapieresistentie. Herval van ALL is overigens één van de belangrijkste oorzaken van kankersterfte bij kinderen. Doelstelling: In deze literatuurstudie trachten we een verband te leggen tussen moleculaire afwijkingen die in verschillende pathways gevonden worden bij hervallen ALL patiënten en de mogelijkheid om deze afwijkingen specifiek te targeten met nieuwe therapeutische strategieën om zo de therapieresistentie terug te schroeven. Er wordt tevens weergegeven hoe de gemuteerde relapse kloon kan evolueren van bij de diagnose opdat men eventueel in een vroegtijdig stadium kan ingrijpen met doelgerichte therapieën en zo herval kan vermijden. Resultaten: In klinische studies van patiënten met herval werden diverse mutaties aangetroffen in verschillende signaaltransductiewegen. Therapieën werden reeds of worden nog steeds ontwikkeld om doelgericht te kunnen interfereren met mutante klonen: HDAC (histon deacetylase) inhibitoren werken in op epigenetische mutaties alsook op de glucocorticoïden resistentie, JAK-specifieke inhibitoren op JAK/STAT mutaties, small molecule inhibitoren en nucleotidase inhibitoren werken tot slot in op een verstoord nucleoside metabolisme. Anderzijds kan er bij zeer chemorefractaire patiënten gebruik worden gemaakt van immunotherapieën, zoals blinatumomab en CAR T-cellen, die het immuunsysteem van de patiënt manipuleren om de leukemie te bestrijden. Conclusie: Door uitgebreide genomische karakterisatie en door ontwikkeling van nieuwe doelgerichte en immunologische therapeutische mogelijkheden zijn er betere vooruitzichten in de behandeling en prognose van kinderen met herval van ALL. Deze recente behandelingen moeten echter nog verder klinisch getest en geoptimaliseerd worden om hun plaats in de standaard behandelingsschema s nauwkeurig te definiëren. 1

7 2. Inleiding 2.1 Algemene pathogenese en indeling Leukemie is een maligne aandoening van het beenmerg en bloed en wordt gekenmerkt door defecten in de progenitor of voorloper cellen (1). De progenitor cellen beschikken normaal over de capaciteit van uitrijping (ook wel differentiatie genoemd) tot de verschillende soorten bloedcellen en gecontroleerde celdeling (ook wel proliferatie genoemd) (2). Bij leukemie ontstaat er een overwoekering van al dan niet gedifferentieerde bloedcellen door een ongecontroleerde proliferatie en door het wegvallen van de normale regulatiemechanismen die tijdig zorgen voor apoptose of geprogrammeerde celdood (Figuur 1) (2, 3). Bij meer dan 25% infiltratie van deze leukemische cellen of lymfoblasten in het beenmerg, spreekt men van leukemie (4). Figuur 1. Verhouding bloedcellen bij gezonde patiënt versus patiënt met leukemie: er is een toename van het aantal, al dan niet gedifferentieerde, witte bloedcellen bij leukemie (3). Leukemie kan worden ingedeeld in een acute en chronische vorm. Bij acute leukemie ontstaat er in het beenmerg een ongecontroleerde groei van onrijpe bloedcellen (5). Dit in tegenstelling tot chronische leukemie waarbij de cellen wel nog normaal uitrijpen, maar waarbij net zoals bij acute leukemie de regulatie tot gecontroleerde proliferatie wegvalt. Op basis van de aangetaste cellijn kunnen chronische en acute leukemie verder onderverdeeld worden in lymfoïde en myeloïde leukemie met respectievelijk aantasting van de witte en de rode cellijn. Acute lymfatische leukemie kan verder worden opgesplitst in B-cel ALL en T-cel ALL (6). De indeling ziet eruit als volgt: 2

8 Acuut Chronisch Lymfatisch Acute lymfatische leukemie (ALL) Chronische lymfatische leukemie (CLL) Myeloiëd Acute myeloïde leukemie (AML) Chronische myeloïde leukemie (CML) Tabel 1. De verschillende vormen van leukemie. Deze masterproef legt zich hoofdzakelijk toe op de pediatrische acute lymfatische leukemie. 2.2 Epidemiologie Acute lymfatische leukemie (ALL) is de meest voorkomende kanker bij kinderen. De piekincidentie ligt tussen de leeftijd van 2 en 5 jaar, nochtans treft ALL zowel kinderen als volwassenen (1, 5). De ziekte treft iets meer jongens (±55%) dan meisjes (±45%) (5, 7). De totale incidentie is 1 tot 1,5 op inwoners (8). Ondanks het feit dat ALL de meest voorkomende kinderkanker is, is deze ziekte zeldzaam (4). De overlevingscijfers van ALL bij kinderen liggen op ongeveer 80% tot 85% (Bijlage 1) (9-11). Dit percentage kan opklimmen tot 90% in klinische studies (clinical trials) waar men gebruik maakt van risicostratificatie en therapie aangepast aan de farmacogenetica en farmacodynamica van de patiënt (12-15). De incidentie varieert naargelang de etniciteit. Het voorkomen van ALL is meer frequent bij het blanke ras (ook wel kaukasische ras genoemd) dan bij Afro-Amerikanen (5). Ook bij de hispanische (Latijns-Amerikaanse) populatie zou ALL, en dan voornamelijk B-cel ALL, frequenter voorkomen. T-cel leukemie echter zou meer voorkomen bij de zwarte populatie (4). Deze populatie wordt bovendien vaker getroffen door ernstigere vormen van leukemieën, gekarakteriseerd door een hoger initieel aantal witte bloedcellen (WBC) en/of door infiltratie in het centraal zenuwstelsel (CZS) (7, 8). Bij de indeling in B en T-cel acute lymfatische leukemie, maakt B-cel ALL 80-85% deel uit van ALL ten opzichte van T-cel ALL (15-20%) (5, 7). 2.3 Etiologie De exacte pathogenetische mechanismen voor het ontstaan van ALL zijn nog niet volledig bekend. Het is echter wel duidelijk dat één enkele hit of genetische afwijking niet kan leiden tot de ontwikkeling van leukemie. Men spreekt van een minimal two-hits model (16). 3

9 Bij dit model zijn naast een genetische afwijking in utero bijkomende genetische defecten door blootstelling aan exogene factoren (chemisch, fysisch, viraal, leefstijl) noodzakelijk voor de maligne ontwikkeling van ALL (Figuur 2) (5, 12). Zo werd aangetoond dat bij eeneiige tweelingen met leukemie waarbij de leukemische stamcellen via het bloed van de ene tweeling naar de andere gebracht worden, de concordantie slechts 5 à 10 % bedraagt. Dit betekent dat er postnataal een bijkomende blootstelling moet zijn om tot een tweede genetische afwijking of second hit te komen (5, 16-18). Zowel genetische, fysische en chemische factoren werden in verband gebracht met het onstaan van ALL, echter alles tesamen verklaren zij slechts een klein deel van de incidentie van ALL (5, 7, 19, 20). Figuur 2. Etiologie van acute lymfatische leukemie. Two-hits model met aangeboren genetische defecten en bijkomende defecten door blootstelling aan exogene factoren. Hierbij is ook een zekere toevalsfactor (chance) betrokken (12) Genetisch factoren In enkele gevallen (<5%) hebben patiënten met aangeboren syndromen (syndroom van Down, ataxie-telengiëctasie, Nijmegen-breakage syndroom, Bloom s syndroom) een predisponerende factor voor de ontwikkeling van ALL. Patiënten met Down syndroom hebben 10 tot 30 keer meer kans op het ontwikkelen van leukemie, en dan voornamelijk ALL (4, 5, 12, 20-22). Ook polymorfismen (i.e. aangeboren variatie van allelen) van bepaalde genen kunnen een predisponerende factor zijn voor ALL (12). Allelische varianten van IKZF1, ARID5B, CEBPE en CDKNA2 zijn geassocieerd met pediatrische ALL (23-26) Fysische factoren Ioniserende straling Blootstelling aan ioniserende straling is een sterk causale factor voor de ontwikkeling van leukemie. Dit werd bewezen na de atoombom in Hiroshima in 1945 met een significante 4

10 toename van het aantal gevallen met ALL (27). Hierbij ging het om hoge dosissen tot 200 msv. Ook lager gedoseerde ioniserende bestraling tijdens de zwangerschap geeft een significant verhoogd risico op ontwikkeling van leukemie bij het kind in utero (12, 19, 28, 29). Dit risico werd echter sterk verminderd door een reductie van röntgenfoto s (RX) bij zwangere vrouwen. De effecten van ioniserende straling kunnen tevens variëren naargelang de individuele variabiliteit en gevoeligheid voor bestraling (19) Niet-ioniserende straling De oorzakelijke invloed van elektromagnetische straling is nog steeds controversieel. Er is wel aangetoond dat blootstelling aan hoge dosissen (>0,4 mct) geassocieerd is met een verhoogd risico, maar de betrouwbaarheid van deze bevinding is laag (12, 19, 30). Bij lagere dosissen werd geen evidentie gevonden voor een toenemend risico op leukemie (19). De biologische mechanismen van elektromagnetische straling zijn nog onvoldoende aangetoond. Indien elektromagnetische straling effectief een mogelijk oorzakelijk verband zou hebben, zou het slechts in een klein aandeel van de patiënten met ALL mede aan de basis liggen van de pathogenese (19) Chemische factoren Toxines, benzeen, cytostatica, alkalische agentia, pesticiden, uitlaatgassen en topoisomerase II inhibitoren kunnen ALL veroorzaken, maar veroorzaken meer frequent AML. Deze blootstelling kan in utero of postnataal optreden (19, 31-35) Virale factoren Infecties zijn sterk geassocieerd met het ontstaan van ALL (12). Tijdens de industrialisering werd een toename van ALL bij kinderen vastgesteld in de steden. Twee Britse onderzoekers stelden elk hun eigen hypothese op over het mogelijke causale verband tussen infecties en ALL. Kinlen s population-mixing hypothese stelde dat door vermenging van een gevoeligere populatie met een andere geïnfecteerde populatie nieuwe infecties ontstonden (36, 37). Bij blootstelling aan deze nieuwe infecties, ontwikkelde de gevoeligere populatie ALL. Greaves delayed infection hypothese is gebaseerd op het two-hit model (38). Hij veronderstelde dat sommige kinderen reeds prenataal leukemische mutaties ontwikkelen, dit is de first hit. Wanneer deze kinderen vanaf de geboorte te weinig blootgesteld worden aan infecties door betere hygiënische omstandigheden, ontwikkelt hun immuunsysteem een abnormale respons bij een laattijdige blootstelling aan infecties. Dit is de second hit. Een normaal immuunsysteem moet echter vanaf de geboorte in aanraking komen met infecties om te kunnen uitrijpen tot een 5

11 matuur immuunsysteem (20). Influenza virussen zouden mogelijke oorzakelijke virussen kunnen zijn. Indien de biologische mechanismen van infecties als mogelijke oorzaak voor ALL nog verder worden onderzocht, zou men hierop in de toekomst eventueel profylactisch kunnen ingrijpen (12) Leefstijl factoren Factoren die eventueel leiden tot een verhoogd risico op leukemie zijn: alcoholgebruik, roken, maternale dieet en vitamine inname. Er is nog onvoldoende evidentie over het risico van roken en alcoholconsumptie tijdens de zwangerschap. Genetische vatbaarheid en predispositie kunnen de effecten hiervan bovendien beïnvloeden. Bij verhoogde consumptie van topoisomerase inhibitoren II in de maternele voeding is het risico op leukemie mogelijks verhoogd, voornamelijk bij AML (19, 28). 2.4 Classificatie Cytomorfologische classificatie Oorspronkelijk werd leukemie ingedeeld op basis van cytologie en morfologie van de maligne cellen volgens het French-American-British system (FAB) (39). Er wordt tegenwoordig afgestapt van dit systeem omdat het geen enkele prognostische info verschaft (8). Op basis van morfologie vinden we 3 soorten lymfoblasten: L1, L2 en L3. - L1: kleine lymfoblasten, homogeen chromatine, ronde/ovale nucleus, licht basofiel cytoplasma, weinig cytoplasma, komen frequent voor in pediatrische leukemie (5, 8) - L2: grotere cellen dan L1, minder homogene nucleus, ovale of onregelmatige nucleus, prominentere en soms multipele nuclei, meer cytoplasma (5, 8) - L3: vrij grote lymfoblasten, homogene cellen, sterk basofiel cytoplasma, vacuoles, grote ronde/ovale nuclei, onregelmatige nucleoli, dit type lymfoblasten is meestal gelinkt met Burkitt leukemie (5, 8) Immunofenotypische en cytogenetische classificatie De immunologische indeling gebeurt volgens de moderne World Health Organization (WHO) classificatie (2008) (Tabel 2) (40). Bij immunofenotypering kunnen door middel van flowcytometrie (Zie Flowcytometrie) specifieke merkers gevonden worden voor B-cel ALL en T-cel ALL. In de B-cellijn vindt men de merkers CD19, CD22, CD20 en CD79a. In de T-cellijn vindt men CD1a, CD3, CD4, CD5, CD7 en CD8 (41). Beiden zijn ook positief voor 6

12 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), een merker die enkel tot expressie komt bij onrijpe T en B cellen. B-ALL wordt verder onderverdeeld volgens specifieke genetische abnormaliteiten. Deze cytogenetische indeling laat risicobepaling toe (Tabel 2). Omwille van haar prognostische waarde heeft deze indeling de FAB classificatie vervangen (Zie Cytomorfologische classificatie) (4, 5). WHO classificatie (2008) B lymfoblastische leukemie/lymfoom B lymfoblastische leukemie/lymfoom, NOS B lymfoblastische leukemie/lymfoom met recurrente genetische abnormaliteiten B lymfoblastische leukemie/lymfoom met t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1 B lymfoblastische leukemie/lymfoom met t(v;11q23); MLL herschikking B lymfoblastische leukemie/lymfoom met t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 (ETV6-RUNX1) B lymfoblastische leukemie/lymfoom met hyperdiploidie B lymfoblastische leukemie/lymfoom met hypodiploidie B lymfoblastische leukemia/lymfoom met t(5;14)(q31;q32) IL3-IGH B lyfmoblastische leukemia/lymfoom met t(1;19)(q23;p13.3);tcf3-pbx1 T lymfoblastische leukemie/lymfoom Tabel 2. WHO classificatie van ALL (revisie in 2008). Immunofenotypische en cytogenetische indeling (40). 2.5 Symptomen en kliniek De symptomen van ALL zijn vaak niet specifiek en kunnen ofwel zeer acuut ofwel geleidelijk over een paar maanden optreden. De eerste symptomen die vaak vooraf gaan zijn koorts, nachtzweten, gewichtsverlies en algemene malaise. Ook lethargie (slaapzucht) kan hiermee gepaard gaan (4, 5, 8). Bij infiltratie van de ziekte in andere weefsels treden bijkomende symptomen op. De helft van de patiënten vertonen vergrote klieren wat wijst op een veralgemeende (maligne) lymfadenopathie. Ook splenomegalie en hepatomegalie kunnen aanwezig zijn. Bij infiltratie in het bot en gewricht, kunnen klachten van botpijn en gewrichtspijn optreden. Bij kinderen kan dit opgemerkt worden aan de hand van een asymmetrisch gangpatroon. Ook wanneer jonge kinderen niet leren stappen, moet men bedacht zijn op aanwezige botpijnen. In sommige gevallen kan de aantasting zo ver gaan dat het bot afgebroken wordt (i.e. osteopenie). Infiltratie 7

13 in het centraal zenuwstelsel (CZS) geeft een verhoging van de intracraniële druk wat aanleiding geeft tot hoofdpijn en braken (4, 5, 8). Bij ALL belemmeren de onrijpe leukemische cellen de normale aanmaak van bloedcellen. Dit leidt tot een tekort aan rijpe bloedcellen met anemie, leukopenie en trombocytopenie als gevolg. Anemie wordt gekenmerkt door moeheid, lethargie, kortademigheid en bleekheid. Trombocytopenie veroorzaakt (gingivale) bloedingen, hemorragieën, petechieën, echymosen en purpura. Leukopenie verklaart de hogere gevoeligheid voor (ernstige) infecties en de aanwezigheid van koorts (4, 5). 2.6 Genetische defecten Numerieke afwijkingen Hyperdiploïdie Een toename van het aantal chromosomen of hyperdiploïdie (>50 chromosomen) is één van de meest frequente genetische defecten bij pediatrische ALL (25-30%) en kent een zeer goede prognose (Figuur 3) (12). De betrokken chromosomen zijn meestal beperkt tot chromosomen 4, 6, 10, 14, 17, 18, 21, en X (1, 42). In 95% van de gevallen is er een toename van het aantal chromosomen 4, 6, 10 of 17 en deze zijn sterk geassocieerd met een gunstige prognose (42-45). De huidige vijfjaarsziektevrije overleving ligt op 80-90% (42) Hypodiploïdie Wanneer chromosomen verloren gaan, spreekt men van hypodiploïdie (<44 chromosomen). Hypodiploïdie komt voor bij 5-8% van de kinderen met ALL en gaat gepaard met een slechte prognose (46). Naargelang het overblijvende aantal chromosomen kunnen patiënten ingedeeld worden in lage hypodiploïdie (32-39 chromosomen), hypodiploïdie (40-43 chromosomen) en near diploïdie (44-45 chromosomen) (47). De prognose wordt minder gunstig bij een dalend aantal chromosomen (42) Near haploïdie Bij near haploïdie ligt het chromosomenaantal tussen 24 en 31 chromosomen en is het gelinkt aan een slechte prognose. In 2/3 van de gevallen van near haploïdie worden mutaties/deleties gevonden in IKZF3 en mutaties in de receptor tyrosine kinase (RTK)-RAS signaalweg (42, 48). 8

14 Figuur 3. Prevalentie van cytogenetische en moleculaire genetische defecten bij pediatrische acute lymfatische leukemie (12) Structurele afwijkingen B-ALL ETV6-RUNX1 Translocatie t(12;21)(p13;q22) resulteert in een fusieproteïne ETV6-RUNX1 of TEL-AML1 (42, 49, 50). Dit fusie-eiwit inhibeert de normale transcriptieactiviteit van AML1 hetgeen leidt tot een gewijzigde zelfvernieuwende capaciteit en een verstoorde maturatie van de hematopoëtische stamcel (51, 52). Deze translocatie kan niet worden gedetecteerd met de klassieke cytogenetische karyotypering, maar wel met FISH en/of RT-PCR (1, 42) (Zie Fluorescence in-situ hybridisatie (FISH) en Polymerase chain reaction (PCR)). Het is de meest voorkomende translocatie bij kinderen met B-ALL (±25%) en heeft een zeer goede prognose met een ziektevrije overleving van 90% (1, 42) E2A-PBX1 Translocatie t(1;19)(q23;p13) is sterk geassocieerd met B-ALL en kan voorkomen in een gebalanceerde en ongebalanceerde vorm der(19)t(1;19)(q23;p13) (1, 42, 43). De gebalanceerde variant werd vroeger geassocieerd met een slechte prognose, maar dankzij de huidige behandelingsmogelijkheden stijgen de overlevingskansen, hetgeen leidt tot een betere prognose 9

15 met een vijfjaarsziektevrije overleving van 84%. De translocatie leidt tot de fusie van DNA bindend domein PBX1 en de transactivatie domeinen van E2A. Dit fusie-eiwit verhindert de hematopoëtische differentiatie door het verstoren van de expressie van homeobox (HOX) genen en de transcriptie activiteit van E2A (42, 51). De prevalentie van deze translocatie bij pediatrische ALL is 6% (42, 53-56) BCR-ABL (Philadelphia chromosoom) Translocatie t(9;22)(q34;q11.2) van het ABL gen (Abl-oncogen 1) naar het BCR gen (breakpoint cluster gen) resulteert in de vorming van het Philadelphia chromosoom (57). Dit leidt tot de vorming van een nieuw fusie-eiwit BCR-ABL1 dat fungeert als een tyrosine kinase oncogen (5, 42, 43). Het verstoort de differentiatie, de geprogrammeerde celdood en wijzigt de zelfvernieuwende capaciteit van de hematopoëtische stamcel (51, 58). Omdat het BCR gen twee breekpunt gebieden bezit, zijn er 2 varianten van het fusie-eiwit: major BCR en minor BCR. Deze major variant komt voornamelijk voor bij CML (99%) en slechts in een kleine minderheid bij ALL. De minor variant komt frequenter voor bij ALL (42, 43). De prognose van kinderen met BCR-ABL1-positieve ALL is zeer slecht (57). Nochtans verloopt het herstel gunstiger dankzij het recent gebruik van imatinib mesylaat (een tyrosine kinase inhibitor) (5, 42). Het Philadelphia chromosoom komt meer voor bij volwassenen (25-30%) en is aanwezig in 3-5% van de pediatrische gevallen van ALL (5, 42). Bij 2/3 van deze patiënten worden er meerdere secundaire chromosomale defecten gedetecteerd (42) MLL herschikkingen Translocaties van het MLL (KMT2A) gen, gelegen op chromosoom 11, komen voor bij 2/3 van de zuigelingen met ALL en bij 1-2% van de oudere kinderen met ALL (59, 60). Het MLL gen codeert normaliter voor een eiwit met methyltransferase activiteit dat zorgt voor de regulatie van de hematopoëse (42). Bij genherschikkingen valt de methylatie van HOX genen weg met als gevolg een afwijkende proliferatie en overlevingscapaciteit van de hematopoëtische stamcellen (42, 51, 61). De meest voorkomende translocatie is t(4;11)(q21;q23) en vormt het fusie-eiwit MLL-AF4 (KMT2A-AFF1). Er zijn echter heel wat andere MLL-translocaties gekend, zoals t(11;19)(q23; p13.3) die het fusie-eiwit MLL-ENL vormt (42). De prognose is slecht (62). 10

16 T-ALL TAL1 Bij genherschikkingen in T-cel ALL zijn de T cel receptor genen (TCR) betrokken. Translocatie t(1;14)(p32~34;q11) leidt tot overexpressie van TAL1 met een afwijkende hematopoëse tot gevolg. Deze herschikking komt voor in 3-6% van de kinderen met ALL. Andere genen betrokken bij deze translocaties zijn TAL2, MYC, LYL1, HOX11 (12) HOX11 De translocatie t(10;14)(q24;q11) en zijn variant t(7;10)(q35;q24) herschikken HOX11 met respectievelijk TCRD en TCRB. Dit geeft aanleiding tot overexpressie van HOX11 wat leidt tot een afwijkende proliferatie en overlevingscapaciteit van de hematopoëtische stamcellen. Deze genherschikkingen komen voor in 4-7% van de kinderen met ALL en worden in verband gebracht met een gunstigere prognose (1). Cytogenetische afwijking Betrokken gen Klinische relevantie (prognose) Prevalentie bij kinderen hyperdiploïdie zeer gunstige prognose 25-30% hypodiploïdie near haploïdie ongunstige prognose, progressief met dalend chromosomenaantal ongunstige prognose 5-8% t(12;21)(p13;q22) TEL-AML1 zeer gunstige prognose 25% t(1;19)(q23;p13) E2A-PBX1 matig tot gunstige prognose 6% t(9;22)(q34;q11.2) BCR-ABL1 gunstigere prognose dankzij tyrosine kinase inhibitoren 3-5% Translocatie 11q23 t(4;11)(q21;q23) t(11;19)(q23; p13.3) MLL MLL-AF4 MLL-ENL ongunstige prognose, vooral bij zuigelingen t(1;14)(p32~34;q11) TAL1 3-6% t(10;14)(q24;q11) HOX11 gunstige prognose 4-7% Tabel 3. Genetische defecten met hun prognose en prevalentie. bij 2/3 zuigelingen, 1-2% bij oudere kinderen 11

17 2.7 Diagnose Voor de diagnosestelling is een combinatie van cytomorfologie, histologie, immunofentoypering en cytogenetica essentieel (5, 12, 63). Moleculaire technieken als RT- PCR en micro-array analyse zijn belangrijk voor verdere diagnostische en prognostische info. Voor de detectie van infiltratie van lymfoblasten in het centraal zenuwstelsel wordt na een lumbaal punctie het cerebrospinaal vocht (CSV) geëvalueerd (4, 8) Biologie In de acute setting is een bloedstaal een eerste stap tot de diagnose van leukemie. Hierbij wordt het CBC (complete blood count) gemeten waarbij de witte bloedcellen meestal verhoogd zijn (soms normaal of laag), de bloedplaatjes en rode bloedcellen verlaagd (respectievelijk trombocytopenie en anemie). Hypocalciëmie, hyperkaliëmie, hyperfosfatemie, hyperuricemie, hoog LDH en hoog creatinine wijzen op tumor lyse syndroom, dat soms kan voorkomen na behandeling. Onderzoek van een beenmerg aspiraat is noodzakelijk voor de definitieve diagnose (8) Cytomorfologie (microscopie) De morfologische beschrijving van lymfoblasten in het bloed en beenmerg zijn essentieel voor een correcte diagnose en indeling van ALL (Zie Cytomorfologische classificatie) (5) Immunofenotypering Immunofenotypering is noodzakelijk voor de diagnosestelling en voor classificatie van ALL in een T-cellijn en B-cellijn door detectie van specifieke merkers (5). Deze merkers komen tot expressie op het celoppervlak of in het cytoplasma van de lymfoblasten. Immunofenotypering gebeurt aan de hand van flowcytometrie (5, 7) Flowcytometrie Hierbij worden leukemische cellen gemerkt met antilichamen om te bepalen welke merkers tot expressie komen op het celoppervlak. De cellen gaan doorheen een flowcytometer. Bij de aanwezigheid van de gezochte merkers zullen de cellen in kwestie fluoresceren en kunnen de T en B lymfoblasten van mekaar gescheiden worden. Het resultaat is bepalend voor het indelen van de ziekte in subtypes (4, 20). Daarnaast wordt flowcytometrie ook gebruikt voor detectie van residuele leukemische cellen of minimal residual disease (MRD) na therapie (zie Minimal Residual Disease). 12

18 Deze laatste is de belangrijkste prognostische indicator voor het risico op herval (64). Flowcytometrie detecteert (net zoals PCR) reeds MRD in hoeveelheden die bij morfologische analyse (op perifeer bloed of beenmerg) niet kunnen worden waargenomen (2, 4, 12, 65, 66) Cytogenetica Het in beeld brengen van chromosomale defecten zorgt niet alleen voor een volledige diagnose, het leidt tevens tot verdere subclassificatie en heeft een belangrijke prognostische waarde (4, 5, 45) Conventionele cytogenetische analyse Bij conventionele cytogenetica stelt men een karyotype op met behulp van een bloed- en/of beenmergstaal. Nadeel van deze techniek is dat het enkel kan toegepast worden op delende cellen (in metafase) en dat ze technisch moeilijker uitvoerbaar is. Een alternatieve methode is de fluorescence in-situ hybridisatie (FISH) (5) Fluorescence in-situ hybridisatie (FISH) Bij FISH zorgt men voor hybridisatie van gemarkeerde (fluorescente) probes met het DNA in de nuclei van leukemische cellen. De nuclei bevinden zich in de metafase of interfase en leveren zo het voordeel dat deze techniek kan uitgevoerd worden op niet-levende cellen, in tegenstelling tot de conventionele cytogenetica. Bovendien is de FISH techniek sneller en gevoeliger (5, 67, 68) Moleculaire evaluatie Polymerase chain reaction (PCR) PCR is een gevoeligere en snellere techniek voor detectie van genherschikkingen. Reverse transcriptase PCR (RT-PCR) detecteert translocaties die resulteren in fusie-eiwitten. Quantitative RT-PCR (qpcr) detecteert en kwantificeert MRD, net zoals flowcytometrie (5, 65) Array Comparative Genomic Hybridization (acgh) analyse Dankzij de techniek van DNA microarray kunnen deleties of inserties in het DNA van leukemische cellen snel opgespoord worden en kan het chromosoomaantal worden bepaald (12). Dit leidt tot een nauwkeurigere identificatie en definiëring van de verschillende subklassen van ALL (45). Deze verdere subtypering levert een bijkomende prognostische significantie en verschaft een beter inzicht in de effecten van de therapie (2, 12, 20, 63, 67). 13

19 2.7.6 Radiografie Met een RX thorax kan een mediastinale massa gedetecteerd worden, hetgeen frequenter voorkomt bij T-ALL dan B-ALL (4). Bij kinderen kunnen tevens een vergrote thymus en lymfadenopathie via radiografie opgespoord worden (8). 2.8 Therapie De therapie van ALL bestaat uit 3 opeenvolgende fasen: remissie-inductie fase, intensificatie (of consolidatie) fase en een onderhoudsbehandeling. De totale behandeling duurt 2 tot 3 jaar. Naargelang de risicogroepen kunnen de intensiteit, toxiciteit en duur van de chemotherapie aangepast worden. Bij infiltratie van de leukemie in het CZS is er bijkomende intrathecale of systematische chemotherapie nodig. Enkel bij zeer hoog risico patiënten of bij het falen van de chemotherapie, is allogene stamceltransplantatie een alternatieve optie Remissie-inductie fase In deze eerste fase beoogt men een totale uitroeiing (eradicatie) van meer dan 99% van de initiële leukemische cellen en wordt de normale hematopoëse hersteld. 90 tot 95% van de patiënten bereikt deze fase van complete remissie (8, 51, 65). Remissie is niet hetzelfde als genezing aangezien een klein aandeel lymfoblasten dit deel van de therapie overleven. Zonder bijkomende chemotherapie zullen vele patiënten in remissie toch hervallen (7). De remissieinductie fase omvat 4 componenten: glucocorticoïden (prednisolone of dexamethasone), vincristine, asparaginase en al dan niet anthracycline. Standaard risico patiënten krijgen de combinatie van de eerste drie stoffen. Bij hoog risico en zeer hoog risico patiënten is de toediening van anthracycline noodzakelijk (7, 12, 20, 51). Deze fase gaat steeds gepaard met hospitalisatie en duurt 4 à 6 weken (12, 20, 65) Glucocorticoïden Door een betere infiltratie in het CZS en een langere halfwaardetijd heeft dexamethasone een beter effect op de controle van leukemie met aantasting in het CZS. Bovendien is de overleving bij kinderen met T-ALL en jonge kinderen met B-ALL beter als men bij prednisolone dexamethasone toevoegt en dit in een verhouding van 7/1. Wanneer prednisolone echter in hogere dosis (>7/1) wordt toegediend, is er geen verschil meer in werkzaamheid van de beide stoffen. De keerzijde van het gebruik van dexamethasone zijn de systemische bijwerkingen (infectie, osteonecrose, fracturen, psychose, myopathie) die frequenter voorkomen dan bij prednisolone (12, 20, 51, 65). 14

20 Asparaginase Voor asparaginase zijn er verschillende types beschikbaar: Erwinia Chrysanthemi asparaginase, Escheria coli asparaginase en PEG-asparaginase (monoethoxypolyethylene glycol succinimidyl conjugate of E coli L-asparaginase). Het Erwinia asparaginase wordt echter in praktijk, in het geval van een nieuwe diagnose ALL, enkel gebruikt wanneer er nevenreactie (allergie) optreedt tegen het E. Coli asparaginase of wanneer de therapeutische werking van het E. Coli asparaginase teniet wordt gedaan door neutraliserende antilichamen zonder dat zich een zichtbare allergische reactie instelt (69). Er kunnen ook complicaties onstaan in de remissiefase omwille van een farmacokinetische interactie tussen asparaginase en glucocorticoïden Imatinib en dasatinib Imatinib is een tyrosine kinase inhibitor en wordt specifiek gebruikt bij patiënten met BCR- ABL1 positieve leukemie (70, 71). Deze toevoeging leidt tot remissie in meer dan 90% van de gevallen. Dasatinib, ook een tyrosine kinase inhibitor, werkt zowel in op ABL kinase als Src kinase en kent een grotere activiteit tegen (imatinib-resistente) BCR-ABL1 positieve leukemie. Bovendien dringt dasatinib beter door in het CZS (20, 51, 71) Intensificatie fase (consolidatie fase) Na herstel van de hematopoëse tracht men de residuele leukemische cellen die overleven na remissie, te vernietigen. Zo wordt het risico op herval gereduceerd. De cytostatica die men hierbij gebruikt, zijn methotrexaat in hoge dosis en mercaptopurine. Daarbij kunnen vincristine en glucocorticoiden in pulsen worden toegediend en asparaginase in hoge dosis en zonder onderbrekingen. De fase duurt 6 à 9 maanden (20, 51, 65) Onderhoudsfase De onderhoudsbehandeling is van belang om herval te voorkomen eenmaal complete remissie is bereikt. Deze fase van chemotherapie is veel minder intensief dan de voorgaande fasen. Patiënten krijgen dagelijks mercatopurine en wekelijks methotrexaat en dit voor een periode van minstens 2 tot 2,5 jaar. Deze cytostatica kunnen eventueel aangevuld worden met pulsen van vincristine en dexamethasone (20, 51, 65, 72) Behandeling van het centraal zenuwstelsel Patiënten met hoog risico op herval van leukemie in het centraal zenuwstelsel, worden vanaf de remissie-inductiefase behandeld met intrathecale chemotherapie of systematische chemotherapie. Patiënten met hoog risico zijn diegene met het T-cel immunofenotype, met een 15

21 hoog aantal leukemische cellen en/of met aanwezigheid van leukemische cellen in het cerebrospinaal vocht (CSV). Omwille van de acute en chronische complicaties (endocrinopathieën, neurocognitieve effecten, secundaire tumoren) wordt craniale radiotherapie enkel nog heel zelden gebruikt bij patiënten met zeer hoog risico op herval, zoals bij leukemie van het CZS of T-ALL (7, 20, 51, 65, 73) Allogene hematopoëtische stamceltransplantatie (Allo-HSCT) Allogene hematopoëtische stamceltranslplantatie is de meest intensieve therapie voor ALL en wordt enkel toegepast bij zeer hoog risico patiënten zoals patiënten met het Philadelphia chromosoom of bij het falen van de conservatieve therapie. Ideale donoren zijn geschikte verwante donoren. Studies hebben echter aangetoond dat allogene transplantatie met een geschikte niet-verwante donor dezelfde resultaten oplevert (12, 20, 51, 65). 2.9 Risicostratificatie Door middel van risicostratificatie kunnen patiënten ingedeeld worden in risicogroepen. Deze indeling zorgt voor een aangepast therapeutisch schema waarbij de lagere risicogroepen een minder agressieve dosis van chemotherapie nodig hebben, terwijl agressieve dosissen bij hogere risicogroepen noodzakelijk zijn (45, 65, 74, 75). De volgende risicofactoren zijn reeds gekend. (Figuur 4) (65). Figuur 4. Hoog-Risicofactoren bij ALL (65) Aantal witte bloedcellen (WBC) Het aantal witte bloedcellen op het moment van de diagnose heeft een belangrijke prognostische waarde. Hoe hoger dit aantal, hoe hoger het risico. Tot WBC/µL spreekt men van een standaard risico, boven die grens spreekt men van een hoog risico (4, 65). 16

22 2.9.2 Leeftijd Patiënten tussen 1 en 10 jaar hebben een standaard risico. Dit heeft onder andere te maken met het feit dat de cytogenetische afwijkingen die op deze leeftijd voorkomen gunstigere prognosen hebben. Zuigelingen (<1 jaar) hebben een zeer agressieve vorm van ALL (Zie ook MLL herschikkingen) (59, 60). Samen met de WBC wordt leeftijd gebundeld tot de National Cancer Institute (NCI) criteria. Bij toepassing van de NCI criteria krijgen we een standaard risico bij leeftijd tussen 1 en 10 jaar en aantal WBC onder /µL (4, 65) Cytogenetische afwijking De cytogenetische afwijkingen met de meest gunstige prognosen zijn hyperdiploïdie en ETV6- RUNX1 translocatie (1, 42, 44). Hypodiploïdie daarentegen is sterk geassocieerd met een slechte prognose. Ook de genherschikkingen BCR-ABL1 (Philadelphia chromosoom) en MLL zijn geassocieerd met een hoger risicoprofiel (57, 62, 65) Minimal residual disease (MRD) Op het einde van de inductiefase (dag 29) van de therapie wordt met flowcytometrie of PCR het aantal residuele leukemische cellen gemeten. De vijfjaarsziektevrije overleving bij het bereiken van een MRD van minder dan 0,01% ligt op 90%. Bij een groter MRD percentage wordt de prognose slechter. Het antwoord op therapie is dus een belangrijke factor geworden in het voorspellen van het verdere verloop van de ziekte. Bij het falen van de inductiefase hebben patiënten een zeer slechte prognose (65). MRD is de belangrijkste prognostische factor (76-78) CZS infiltratie De betrokkenheid van het centraal zenuwstelsel bij leukemie wijst op een hoger risico. Men spreekt van infiltratie in het centraal zenuwstelsel bij een leukocytenaantal in het CSV van 5/µL of bij klinische detectie van uitval van de craniale zenuwen (65) Farmacogenetica Polymorfismen van transporteiwitten, receptoren en enzymen kunnen de effecten van cytostatica verhinderen en de therapie doen falen. Dit leidt tot een groter risico op herval (20). 17

23 3. Methodologie en doelstelling Vooraleer er gezocht werd naar literatuur voor het schrijven van de inleiding en resultaten, werd eerst getracht om een algemeen inzicht te creëren in de thematiek van deze literatuurstudie. Hiervoor werd in Pubmed gebruik gemaakt van alomvattende zoektermen als acute lymphoblastic leukemia en relapse. Vervolgens werden artikels verzameld voor de inleiding die de verschillende aspecten van acute lymfatische leukemie omvatten. Hiervoor werden in databanken Pubmed en Web of Science verscheidene combinaties van de volgende zoektermen aangewend: acute lymphoblastic leukemia, lymfoid leukemia, pediatric, diagnosis, therapy, classification, genetics, epidemiology. De filters werden ingesteld op Engels en review. Verder werd (indien mogelijk) ook rekening gehouden met de impact factor van tijdschriften en met artikels van bepaalde auteurs die een aanzienlijke rol spelen in de thematiek van deze masterscriptie. Wanneer verdere detaillering nodig was, werd deze gedaan op basis van de referenties vermeld in de review-artikels voor het desbetreffende onderdeel. De datacollectie van artikels voor de resultatensectie gebeurde tevens in databanken PubMed (Tabel 4) en Web of Science (Tabel 5). Combinaties van de volgende zoektermen werden toegepast: precursor cell lymphoblastic leukemia-lymphoma, acute lymphoblastic leukemia, recurrent, relapsed, recurrence, pediatrics, childhood, molecular. In tegenstelling tot de inleiding was het voor het resultatengedeelte van belang dat de artikels zich zouden beperken tot de laatste 5 à 6 jaar aangezien er zich recent heel wat nieuwe bevindingen en ontwikkelingen voordoen omtrent het onderwerp van deze literatuurstudie. Ook hier werden artikels in het Engels geselecteerd. Verdere selectie gebeurde op basis van titel en nadien op basis van het lezen van de abstract. In samenspraak met de promotor werd gekozen om deze studie te starten vanuit de focus op het onderzoek naar moleculaire afwijkingen vertrekkend vanuit de relapse setting zelf en niet op het vinden van diagnostische merkers waarbij men start vanuit de diagnose. Op die manier werden de abstracten gescreend. Bijkomende dataselectie gebeurde tijdens het lezen van de vooraf geselecteerde artikels wanneer gerefereerd werd naar andere artikels omtrent hetzelfde onderwerp. Er werd zoveel mogelijk gebruik gemaakt van gegevens uit klinische studies in de pediatrische setting zelf, daar waar deze data echter ontbraken, werden gegevens uit volwassenen studies of dierenexperimenten gebruikt. De referentielijst werd vastgelegd met behulp van het referentieprogramma EndNote X7. 18

24 3.1 Pubmed Zoektermen Filters Resultaten Bijkomende filters Resultaten Precursor cell Lymphoblastic Leukemie-Lymphoma [Mesh] AND Recurrence [Mesh] English Published in last 5 years 351 Clinical trial Phase I Clinical trial Phase II 33 Acute lymphoblastic leukemia recurrent English Published in last 5 years 194 Child: birth-18 years 83 Relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia English Published in last 5 years 373 Clinical trial Phase I Clinical trial Phase II 46 Relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia molecular English Published in last 5 years 72 Tabel 4. Zoektermen voor resultatensectie in Pubmed. 3.2 Web of Science Zoektermen Filters Resultaten Bijkomende filters Resultaten English Relapsed acute lymphoblastic Publication years: leukemia AND childhood Tabel 5. Zoektermen voor resultatensectie in Web of Science. 664 Op basis van titels en/of abstract 19

25 4. Resultaten 4.1 Herval: prevalentie, prognose, outcome en therapeutische mogelijkheden De novo ALL is de meest voorkomende vorm van kanker bij kinderen en maakt voor 25% deel uit van alle kinderkankers (79). Ondanks een goede vijfjaarsoverleving hervalt ongeveer 15 tot 20% van de kinderen met ALL en deze groep (die we ook `relapse ALL` zullen noemen) heeft een slechte prognose onder andere omwille van hoge chemotherapeutische resistentie. Relapse ALL is één van de belangrijkste redenen van kankersterfte bij kinderen (79-82). De prognose van relapse patiënten wordt bepaald door een aantal factoren (Tabel 6): duur van de 1 e remissie, immunofenotype, anatomische locatie van herval (80% van de patiënten kent een herval van de ziekte in het beenmerg) en de moleculaire respons op therapie (MRD) (83, 84). Op basis van deze prognostische factoren worden patiënten onderverdeeld in risicogroepen. De risicogroepen zijn standaard risico en hoog risico (85). Riscostratificatie van relapse ALL Prognostische factoren Ongunstige prognose 1. Duur CR1 >30 maanden 2. Immunofenotype T-ALL 3. Locatie herval Beenmerg 4. MRD 0,01% Tabel 6: Risicostratificatie van relapse ALL (84). Met behulp van de risicostratificatie kan per groep een behandeling op maat worden ingesteld (risk oriented therapy). Chemo intensificatie (inclusief locale bestraling of stamceltransplantatie) wordt toegepast bij patiënten uit de standaard risicogroep die voordien geen stamceltransplantatie ondergingen. Patiënten uit de hoog risicogroep ondergaan chemo reïnductie. Indien zij in 2 e remissie gaan, wordt dit geassocieerd met een gunstige prognose. In deze risicogroep is er tevens nood aan een geïndividualiseerde behandeling op basis van de moleculaire afwijkingen die een doelgerichte moleculaire behandeling al of niet toelaten (85, 86). 20

26 De meeste patiënten hervallen tijdens of binnen de twee jaar na de behandeling van de primaire ALL. Laattijdig herval wijst eerder op een de novo ontwikkeling van een secundaire leukemie dan op herval (84). In tegenstelling tot de vooruitgang van de prognose bij primaire ALL is de prognose van relapsed ALL amper verbeterd (85). Voor een aangepaste therapeutische aanpak van hervallen patiënten zijn nieuwe behandelingen in ontwikkeling of reeds in gebruik. Enkele belangrijke behandelingsmogelijkheden bij herval zijn nucleoside analogen, monoclonale antilichamen, doelgerichte moleculaire therapieën, anti-metabolieten en nieuwe chemotherapeutische formules. Ondanks deze recente ontwikkelingen dient de behandeling van relapse ALL nog verder geoptimaliseerd te worden (84). 4.2 Herval en klonaliteit Relapse ALL resulteert veelal uit klonale selectie en evolutie van een mineure subkloon bij de diagnose tot een predominante kloon bij herval (87, 88). De relapse kloon is meer therapieresistent door de ontwikkeling van chemoresistente subklonen en/of het verwerven van bijkomende genetische afwijkingen tijdens de behandeling met chemo (82, 89). Die bijkomende mutaties werken chemoresistentie in de hand (87). Doordat deze relapse kloon vaak reeds aanwezig is bij de diagnose, wordt dit een belangrijk aangrijpingspunt voor mutatiedoelgerichte therapie (88). Indien de relapse kloon niet aanwezig bleek bij de diagnose als een mineure of majeure (sub)kloon, spreekt men van een secundaire leukemie (85). Vier types van klonale oorsprong worden beschreven (Figuur 5) (88). In een studie van Mullighan wordt beschreven dat de relapse kloon in meer dan de helft van de patiënten (52%) ontstaat vanuit een ancestrale (i.e. voorouderlijke) kloon met enerzijds het verlies en anderzijds het verwerven van een aantal genetische kenmerken of copy number aberrations (CNA) ten opzichte van de diagnostische kloon. Zowel de diagnostische als de relapse kloon komen voort uit een gemeenschappelijke ancestrale kloon en delen enkele gemeenschappelijke CNA s. Bij 34% evolueert de relapse kloon vanuit de diagnostische kloon met een behoud van de CNA s van bij de diagnose en een aantal nieuw verworven CNA s bij herval. In 8% van de gevallen is de relapse kloon dezelfde als de diagnostische kloon en delen zij dezelfde CNA s. Tot slot spreekt men in 6% van de patiënten van een secundaire leukemie waarbij de diagnostische en de relapse kloon volledig van mekaar verschillen (88, 90). 21

27 Figuur 5: Klonale evolutie van de ancestrale kloon tot de relapse kloon: 4 types. Type 1 (6%): de diagnostische en relapse kloon zijn volledig verschillend. Type 2 (8%): de diagnostische en relapse kloon zijn identiek. Type 3 (34%): diagnostische kloon evolueert tot relapse kloon met het verwerven van enkele nieuwe CNA s. Type 4 (52%): De relapse kloon evolueert vanuit de ancestrale (i.e. voorouderlijke) kloon met enerzijds het verlies van oude CNA s en anderzijds het verwerven van nieuwe CNA s (88). 4.3 Vaak voorkomende mutaties in signaaltransductiewegen en de implicaties voor innovatieve behandelingsopties bij herval van ALL Bij herval van ALL kunnen mutaties tot stand komen in verschillende signaaltransductiewegen of pathways. Signaaltransductiewegen die een belangrijk aangrijpingspunt zijn voor innovatieve behandelingsopties voor herval van ALL zijn: epigenetische regulatie; JAK-STAT signalisatie; nucleoside metabolisme en de glucocorticoïden pathway (91). Tot slot kan er ook worden ingewerkt op het immuunsysteem van de patiënt door middel van immunotherapieën Epigenetica Epigenetische veranderingen kunnen net als genetische veranderingen aanleiding geven tot herval van ALL en zijn een belangrijke potentieel doelwit voor therapeutische ontwikkelingen (85). Epigenetische regulatoire mechanismen mediëren immers de leukemogenese en chemoresistentie zonder de DNA sequentie te wijzigen. DNA methylatie zorgt normaal gezien dat de nucleosomen dicht bij mekaar gebracht worden waardoor transcriptie verhinderd wordt. Histon acetylatie resulteert in een grotere afstand tussen de nucleosomen waardoor transcriptiefactoren wel kunnen binden op DNA en zorgen voor transcriptie en expressie van genen (Figuur 6) (92, 93). 22

28 Wijzigingen in de methylatie van DNA promotors en modificatie van histonen verstoren bijgevolg de transcriptie regulatie en wijzigen genexpressie. Deze mutaties kunnen benaderd worden door demethylerende agentia en histon deacetylase (HDAC) inhibitoren (94). In matched diagnose-remissie-herval stalen van patïenten met ALL werd een significante toename van mutaties gevonden bij herval in epigenetische regulatoren SETD2, CREBBP, MSH6, KDM6A en MLL2 (95). Deze toename van mutaties bij herval wijst op de klonale overleving en evolutie en is op die manier geassocieerd met hun mediërende rol bij chemoresistentie (96). Figuur 6. DNA methylatie (links) verpakt de nucleosomen dicht bij mekaar waardoor transcritptiefactoren niet kunnen binden op DNA. Er ontstaat geen expressie van het gen (inactief gen). Histon acetylatie (rechts) zorgt voor meer afstand tussen de nucleosomen waardoor transcriptiefactoren nu wel kunnen binden. Genen komen tot expressie (actief gen) (92) CREBBP CREBBP is een epigenetische regulator van de glucocorticoïd respons. Deactiverende mutaties van CREBBP komen frequenter voor bij hoge hyperdiploidie (>50 chromosomen) (40%) dan bij andere subtypes van recurrente ALL (80). CREBBP is een transcriptionele co-activator die interageert met verschillende transcriptiefactoren, en reguleert transcriptie door acetylatie van doelwitten zoals glucocorticoïd responsieve genen. CREBBP mutaties resulteren in aminozuur substitutie in het histon acetyltransferase domein (HAT domein). Dit leidt tot destructie van de structuur van het domein of verhindert de interactie met zijn substraten en zorgt bijgevolg voor een verminderde (maar niet geblokkeerde) acetylatie van histon H3 lysine 18 (H3K18) (97). Deze HAT mutaties leiden tot een verminderde expressie van glucocorticoïd-receptor responsieve genen en resulteren in glucocorticoïden resistentie (97). CREBBP mutaties bij diagnose blijven bewaard bij herval of verdubbelen. Mullighan et al. vonden mutaties in CREBBP bij 13 kinderen (18,3%) in een cohorte van 71 patiënten met herval van ALL (97). Belangrijk op te merken is dat deze afwijkingen zelden gezien worden bij patiënten zonder herval. Het feit dat verschillende mutaties bij relapse vaak teruggevonden 23

29 worden als kleine subklonen bij diagnose suggereert dat deze mutaties bijdragen tot de chemoresistentie. Met die kennis zouden HDAC inhibitoren mogelijks apoptose kunnen induceren in de glucocorticoïd-resistente leukemische cellen (Bijlage 2) (97, 98) SETD2 SETD2 is eveneens een mediator van chemo-resistentie. SETD2 codeert voor een histon methyltransferase dat verantwoordelijk is voor de trimethylatie van H3K36 en is essentieel voor mismatch repair (99, 100). MSH6 is een component van DNA mismatch repair en bindt op chromatine ter hoogte van het H3K36 histon merkteken dat door de epigenetische regulator SETD2 gemethyleerd is (96). In een cohorte van 185 kinderen met de novo ALL werden 24 SETD2 mutaties gevonden bij 19 patiënten. Deze mutaties waren het meest frequent bij het MLL translocatie subtype (22%) en het ETV6-RUNX1 subtype (13%) (Zie MLL genherschikkingen en ETV6- RUNX1). In een groep van 30 matched relapse stalen detecteerde men SETD2 mutaties bij 17 patiënten (57%) (96). Figuur 7. De rol van SETD2 bij mismatch repair en de weerslag van SETD2 mutaties op chemoresistentie (101). De mutaties in SETD2 betreffen loss of function of inactiverende mutaties en twee mechanismen zouden een mogelijke verklaring kunnen zijn voor hun klonale overleving en evolutie. Als gevolg van SETD2 inactivatie ontstaat er een grotere diversiteit aan mutaties zodat 24

30 de leukemie zich mogelijks kan aanpassen en overleven tijdens de behandeling met chemotherapie. Een tweede mechanisme beschrijft dat een verminderde SETD2 functie aanleiding geeft tot chemoresistentie aangezien normale mismatch repair belangrijk is voor apoptose van de cellen die DNA schade oplopen tijdens chemotherapie (Figuur 7) (96, 101). Indien dit niet gebeurt door een defecte mismatch repair door SETD2 mutaties worden deze cellen tolerant voor chemotherapie en geven zij aanleiding tot herval (96). Verder onderzoek is noodzakelijk voor een optimale definiëring van de prognostische waarde van epigenetische mutaties en in hoeverre hun effecten op chemoresistentie kunnen voorkomen en/of behandeld worden (96) JAK-STAT pathway In een case report van een 15-jarige patiënt met vroegtijdig herval van T-ALL werd een nieuwe mutatie (die recent ontdekt werd) in de JAK-STAT pathway geassocieerd met herval. In het verleden werden reeds mutaties in JAK1 geassocieerd met herval van ALL, echter in deze recente publicatie betrof het de mutatie JAK3 V674A die verworven werd door uniparentale disomie: dit impliceert dat het kind twee chromosomen van één van beide ouders verkreeg. Deze afwijking werd teruggevonden in leukemische cellen bij diagnose maar dubbel zoveel keer bij herval en biedt bijgevolg opties voor nieuwe doelgerichte therapeutische strategieën. JAK3 is een tyrosine kinase en speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling en functie van T- cellen (102). Volgens Bergmann et al. zou V674A mutatie de tyrosine kinase activiteit van JAK3 versterken (103). Een mogelijke gerichte moleculaire behandeling in dit geval is een JAK3 inhibitor (102, 103). In een studie van Gianfelici et al. werd RNA sequencing toegepast bij 19 volwassen diagnostische T-ALL samples van chemorefractaire patiënten of patiënten met vroegtijdig herval. Men tracht op deze wijze de oncogene signaaltransductiewegen te onthullen die prognostisch kunnen zijn voor therapiefalen zodat men deze patiënten doelgericht kan behandelen met moleculaire therapieën (104). Mutaties in de JAK/STAT signaalweg werden gedetecteerd bij 9 van de 19 patiënten (47%). Het meest frequent gemuteerde gen was JAK3, gevolgd door JAK1, IL7R, STAT5A, STAT6A en TYK2. Overigens beschikten de patiënten met JAK1 en JAK3 mutaties over een andere mutatie in dezelfde pathway. De algemene, ziektevrije en event-vrije overlevingskansen waren 0% op 20 maanden bij patiënten met JAK/STAT mutaties met mediane algemene overleving van 15,7 maanden (Figuur 8) (104). 25

31 Figuur 8. Invloed van JAK/STAT mutaties bij T-ALL patiënten op de overleving. Kaplan-Meier curve toont een significant kortere overall survival (OS), disease-free survival (DFS) en event-free survival (EFS) bij JAK/STATpositieve dan bij JAK/STAT-negatieve patiënten (104). 26

32 In voorgaande studies werden mutaties in JAK1, JAK3 of IL7 gevonden in 25% van de gevallen bij zowel B-ALL als T-ALL ( ). Het werd eerder aangetoond dat JAK3 en IL7R mutaties zorgen voor cel- en tumortransformatie en dat het gebruik van selectieve JAK inhibitoren de cel overleving en de tumor burden kan reduceren bij muismodellen (109, 112, 113). In deze studie werden doelgericht inhibitoren, zijnde anti-jak1-2 inhibitor ruxolitinib, geëvalueerd in in vitro experimenten met primaire cellen van T-ALL patiënten met specifieke mutaties. Hierbij werd de celproliferatie remmende werking van ruxolitinib geregistreerd bij 3 patiënten met JAK1 mutaties. Dit effect was minder prominent aanwezig bij patiënten met naast JAK1 mutatie een tweede mutatie in dezelfde pathway (104). Cellen met een geïsoleerde JAK1 mutatie zijn immers gevoeliger voor de inhibitor (114). Deze studie toont het belang aan van genetische karakterisatie bij de diagnose van T-ALL vermits een groot aantal mutaties in de JAK/STAT pathway over een belangrijke prognostische waarde beschikken en een intensieve therapie of (combinatie van) mutatie-doelgerichte inhibitoren vereist (104) Nucleoside metabolisme Bij de behandeling van ALL worden nucleoside analogen toegediend (Zie Intensificatie fase en Onderhoudsfase). Een nucleoside is een bouwsteen van DNA en RNA en bestaat uit de combinatie van een suiker en een base. Ze worden verder onderverdeeld in purines en pyrimidines (115). Wijzigingen in het metabolisme van nucleoside analogen werken chemoresistentie in de hand en spelen zo een belangrijke rol bij herval van ALL. Recent werden een aantal genen achterhaald die aandeel hebben in de ontwikkeling van resistentie tegen purine analogen (79) PRPS1 Mercaptopurine en thioguanine beiden thiopurines zijn prodrugs die via de purine pathway worden omgezet in actieve cytotoxische metabolieten (Figuur 9) (116). Deze thiopurines maken deel uit van de combinatieschema s van chemotherapie in de behandeling van ALL (Zie Intensificatie fase en Onderhoudsfase). Thioguanines worden ingebouwd in DNA waarna er replicatie optreedt gevolgd door mismatch repair omwille van foutief gepaarde basen. Dit induceert DNA schade en resulteert finaal in apoptose (117). 27

33 Figuur 9. Werking van thiopurines in de behandeling van leukemie. Azathioprine (AZA) is de voorloper van mercaptopurine (MP). Thioguanine (TG) en MP worden omgezet door het hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) tot thioguanine metabolieten (TGN s). MP kan worden omgezet door het thiopurine methyltransferase (Tpmt) tot methylthioinosine monofosfaat (metimp) wat zorgt voor de inhibitie van purine synthese. Thiopurines kunnen omgezet worden tot inactieve metabolieten (i.e. methyl-mercaptopurine (memp); methylthioguanine (metg); en methyl-thioguanine nucleotiden (metgn s) door Tpmt. TGN metabolieten worden uiteindelijk ingebouwd in DNA (en RNA) hetgeen aanleiding geeft tot celdood (116). Het PRPS1 gen (i.e. phosphoribosyl pyrophosphate synthetase) codeert voor een enzym dat bijdraagt in de de novo biosynthese van purines (91). In normale cellen wordt de activiteit van PRPS laag gehouden door de feedback inhibitie van PRPS1 en door lage expressie van PRPS2, dewelke ongevoelig is voor feedback. Tijdens de behandeling met chemo kunnen gain of function mutaties ontstaan in het PRPS1 gen die niet alleen zorgen voor een toename van de de novo synthese van purines maar tevens een verminderde negatieve feedback induceren. De verhoogde hoeveelheid van het intracellulair hypoxanthine inhibeert de omzetting van thiopurine prodrugs naar hun actieve metabolieten. Normaliter zou de stijgende hoeveelheid purines moeten instaan voor negatieve feedback, maar dit wordt verhinderd door de PRPS mutanten. Zo onstaat resistentie voor nucleoside analogen die gebruikt worden als antitumorale geneesmiddelen (Figuur 10) (91). 28

34 Figuur 10. De rol van PRPS1 mutaties in de pathogenese van herval. Bij de behandeling van ALL met combinatieschema s van chemo (waaronder thiopurines) kunnen PRPS1 mutaties verworven worden. Dit resulteert in een verstoorde negatieve feedback van PRPS en een toegenomen synthese van purines zoals hypoxanthine. Deze toename inhibeert de omzetting van thiopurine prodrugs naar cytotoxische metabolieten en induceert op die wijze chemo resistentie (91). In een studiepopulatie van Benshang Li et al. met 358 kinderen met relapse B-ALL werden deze gain of function mutaties gevonden in 24 patiënten (6,7%). De mutaties zouden verworven worden in de latente fase van de ziekte tijdens de remissie. Deze patiënten hervielen allen in een vroeg stadium, dit wil zeggen binnen 36 maanden na de initiële diagnose en gaat gepaard met een minder gunstige prognose (117). Een mogelijkeid tot doelgerichte therapie zijn de small molecule inhibitoren. Zij richten zich op de inhibitie van de de novo purine synthese. GART (glycinamide ribonucleotide transformylase) inhibitoren zoals lometrexol kunnen tumorcellen opnieuw gevoelig maken voor thiopurines en heffen de resistentie op. Dit betekent dat de GART pathway een belangrijk aangrijpingspunt kan zijn voor de inhibitie van de chemoresistentie bij patiënten met herval door PRPS1 mutaties. Deze potentiële behandelingsstrategie is volop in ontwikkeling (117) NT5C2 NT5C2 gen codeert voor een 5 nucleotidase en hydrolyseert nucleotiden (5 inosine monofosfaat en 5 guanosine monofosfaat) tot nucleosiden (inosine en guanosine). NT5C2 mutanten zijn door hun toegenomen enzymatische activiteit resistent tegen nucleoside analogen (purine analogen) die gebruikt worden bij chemotherapie (Figuur 11) (118). In bijlage 3 wordt de chemoresistentie duidelijk na vergelijking van overleving van NT5C2 mutante cellen met 29

35 wilde type (i.e. niet-gemuteerde) NT5C2 cellen na toevoeging van 6-mercaptopurine (6-MP) en 6-thioguanine (6-TG) (119). Er is een direct verband tussen de vroege expansie van resistente subklonen en de onderhoudsfase waarin de nucleoside analogen gebruikt worden als hoofdcomponent. Vroegtijdig herval impliceert een ongunstige prognose. Daarom wordt deze groep een belangrijk doelwit voor doelgerichte therapieën (79, 119). Figuur 11. Sommige subklonen beschikken bij de diagnose over NT5C2 mutaties. Door toegenomen nucleotidase activiteit zijn de leukemische cellen beschermd tegen de toxische effecten van nucleoside analogen (zoals 6- mercaptopurine) die gebruikt worden bij chemotherapie, wat aanleiding geeft tot herval (118). In de studie van Meyer et al. werden bij 7 van de 71 patiënten (10%) relapse specifieke mutaties gevonden in NT5C2. Bij twee onder hen werden de mutaties terug gevonden bij de diagnose wat waarschijnlijk wijst op het feit dat de subkloon zich kon uitbreiden door middel van chemoresistentie. Bij de overige vijf patiënten kon geen mutatie worden gedetecteerd bij de diagnose (79). Hieruit blijkt dat NT5C2 mutaties worden verworven bij herval en in de pediatrische setting bleek NT5C2 meer frequent bij T-ALL dan bij B-ALL (119, 120). Door inzicht in deze nieuwe biologische pathway die chemoresisentie medieert, worden nieuwe therapeutische strategieën aangewend en ontwikkeld. Voorbeelden hiervan zijn inhibitoren van 5 nucleotidasen. De ontwikkeling van deze nieuwe doelgericht therapie is van belang in de preventie van de uitbreiding van resistente subklonen tijdens de onderhoudsfase en/of in de behandeling van herval van ALL. Bovendien kan men dankzij de onthulling van dit mechanisme recurrente mutaties in deze pathway opsporen bij patiënten die hervallen na toediening van cytotoxische chemotherapie (79). 30

36 4.3.4 Glucocorticoïden pathway TBL1XR1 deleties Bij herval van B-ALL leiden TBL1XR1 deleties tot een gewijzigde glucocorticoid signalisatie. Deze deletie komt voor in 10,7% van de ALL patiënten met herval en is vaak geassocieerd met het ETV6-RUNX1 subtype (Zie ETV6-RUNX1). Een verminderde expressie van TBL1XR1 resulteert in een toegenomen glucocorticoïd resistentie, hetgeen een belangrijk aangrijpingspunt is voor nieuwe therapeutische strategieën bij herval van ALL. TBL1RX1 maakt deel uit van het nucleaire receptor corepressor complex (NcoR) en zorgt voor de degradatie van NcoR, wat nodig is voor genactivatie van nucleaire receptoren en andere transcriptiefactoren (Figuur 12) (121). Figuur 12. Nucleaire receptoren worden mede opgebouwd door een nucleaire receptor corepressor (NCoR) hetgeen instaat voor de onderdrukking van normale transcriptie van de nucleaire receptoren. Naast deze corepressor zijn ook nucleaire corepressor exchange factoren (NCoEx) betrokken, zoals TBL1 en TBLR1, die bijdragen tot het verwerven van het ubiquitinisatie mechanisme dat enerzijds zorgt voor de degradatie van het corepressor complex en anderzijds voor de rekrutering van coactivator complexen. Op die manier wordt transcriptie van nucleaire receptoren mogelijk gemaakt (121). Deleties van TBL1RX1 resulteren in een toegenomen expressie van NcoR en van geassocieerde enzymen zoals histon deacetylasen (HDAC). Hierdoor is er een verhoogde rekrutering van NcoR1 en HDAC3 naar gen-regulerende gebieden waar ze de chromatine toegankelijkheid 31

37 wijzigen en de bezetting van glucocorticoïden receptoren (GR) op zijn doelgenen verminderen. Normaal zorgt het TBL1XR1 ervoor dat glucocorticoïd receptoren (GR) binden op glucocorticoid response elements (GRE) zodat transcriptie van die genen aanleiding geeft tot een normale glucocorticoid signalisatie. Indien dit niet gebeurt ontstaan er wijzigingen in de glucocorticoïd signalisatie met een glucocorticoïden resistentie als gevolg (Figuur 13) (81). De glucocorticoïden signalisatie kan hersteld worden door middel van een HDAC inhibitor SAHA zodoende dat men opnieuw een goede respons krijgt op prednisolone in cellen met TBL1XR1 deleties (81). Figuur 13. Weergave van glucocorticoïden resistentie na behandeling met toenemende concentraties prednisolone bij TBL1XR1 mutante patiënten: na 72 uur is er een duidelijk verschil tussen de overleving van TBL1XR1 mutante cellen en controle cellen (NT = non-targeting shrna). Deze resultaten tonen aan dat verminderde TBL1XR1 expressie leidt tot resistentie tegen prednisolone-geïnduceerde apoptose (81) Immunotherapie Patiënten met primaire of relapse B-ALL die geen complete remissie bereiken ondanks de behandeling met chemotherapie en stamceltransplantaties, zijn geassocieerd met een zeer slechte prognose (overleving <10%). Deze vaak uitbehandelde patiënten zouden mogelijks kunnen gered worden door recent ontwikkelde immunotherapieën ( ). immunotherapie wordt gebruik gemaakt van het immuunsysteem van de patiënt om de kanker te bestrijden (125) CAR T-cellen Bij B-ALL (en andere B-cel maligniteiten) komen verschillende antigen merkers zoals CD19 tot expressie op het oppervlak (Zie Immunofenotypische en cytogenetische classificatie). CAR T-cellen zijn een vorm van immunotherapie bestaande uit cytotoxische CD8+ T-cellen van de patiënt. De T-cellen worden op genetische wijze bewerkt met expressie van chimere Bij 32

38 antigen receptoren (CAR s) gericht tegen tumor-geassocieerde antigenen, in dit geval tegen CD19 (125, 126). CAR s zijn opgebouwd uit een antigen herkennende sequentie, zijnde een single-chain variable fragment (scfv) van een monoclonaal antilichaam, en een intracellulair signaaldomein dat de T-cel activeert (Figuur 14) (127, 128). Het DNA dat codeert voor deze synthetische receptoren of CAR s kan worden ingebouwd in dat van humane T-cellen via retrovirale of lentivirale transductie (126). Deze receptoren komen vervolgens tot expressie aan het celoppervlak waar zij kunnen binden met antigenen van tumorcellen en op die manier celdood induceren (Figuur 15) (129). Figuur 14. Opbouw van een CD19-gerichte CAR T-cel. CAR s bestaan uit een single-chain variable fragment (scfv) van een monoclonaal antilichaam dat het antigen herkent en een intracellulair signaaldomein dat de T-cel activeert (128). Aangezien CD19 ook tot expressie komt bij niet-maligne B-cellen, leidt dit tevens tot celdood en geeft aanleiding tot toxische bijwerkingen (126). Voorlopig worden in clinical trials enkel CAR T-cellen van de patiënt zelf gebruikt (i.e. autologe CAR T-cellen) vermits T-cellen niet alleen tumorcellen maar ook andere cellen zullen aanvallen wanneer zij in een vreemd lichaam terecht komen (125). Allogene donor CAR T-cellen werden intussen ontwikkeld, maar worden nog niet in de kliniek getest bij humane patiënten met B-ALL (125). 33

39 Figuur 15. Proces van de ontwikkeling van CAR T-cellen. 1) T-cellen worden verzameld uit het bloed van de patiënt. 2) Het gen dat codeert voor de CAR s wordt via een virale vector in de T-cellen gebracht en wordt bijgevolg ingebouwd in het DNA. 3) De gemodificeerde T-cellen dragen CAR s die zich deels extern bevinden voor de herkenning van antigenen op het oppervlak van tumorcellen en deels intern voor de productie van het signaal dat T-cellen moet activeren tot het doden van tumorcellen. 5) Via intraveneuze infusie keren de CAR T- cellen terug naar de patiënt en trachten zij de tumorcellen te herkennen en te doden (129). Eerder werden klinisch gunstige resultaten gerapporteerd van CAR T-celtherapie bij patiënten met laaggradige B-cel tumoren (o.a. laaggradige CLL). Recent werd deze therapie ook in de kliniek getest bij patiënten met herval van B-ALL, een agressievere B-cel maligniteit met een opmerkelijk slechte prognose ( ). Verschillende clinical trials werden ondertussen opgezet in de setting van B-ALL. In fase I studies werd reeds de anti-leukemische werking van CD19 gerichte CAR T-cellen aangetoond. Complete remissie werd vastgesteld bij 67% tot 90 % van kinderen en volwassenen met herval of refractaire (i.e. therapieresistente) ALL. In een studie met hervallen B-ALL volwassenen werd MRD negatieve remissie bereikt bij elk van de vijf patiënten (135). Vier van de vijf patiënten die daarvoor in aanmerking kwamen, ondergingen een allogene HSCT één tot vier maanden na de infusie van CAR T-cellen wat een langdurige opvolging verhindert. De langste MRD negatieve status die kon worden waargenomen na de infusie met CAR T-cellen bedroeg 122 dagen. Eén patiënt (die niet in aanmerking kwam voor allo-hsct) herviel na 3 maanden na behandeling met hoge doses corticosteroïden in het kader van cytokine release syndroom (Zie Cytokine Release 34

40 Syndroom). Deze hoge doses zouden mogelijks de CAR T-cellen persistentie verminderen zodat de CD19+ tumor cellen aan het immuun effect van de CAR T-cellen kunnen ontsnappen (i.e. immune escape). Desondanks blijkt er in deze studie van Brentjens et al. een duidelijk klinisch gunstig effect van de CAR T-cel therapie bij volwassenen patiënten met herval van B- ALL (135). Recent worden de CAR T-cellen ook toegepast in de kliniek bij kinderen. Het UZ Gent kon als eerste ziekenhuis in Europa patiëntjes met CAR T-cellen behandelen (125). In een fase I trial van Lee et al. in een cohorte van 21 kinderen en adolescenten met primaire of recurrente refractaire ALL bereikte 70% een complete respons, waarvan er twaalf (60%) een MRD negatieve complete remissie bereikten (127). Het algemene overlevingscijfer bedroeg 51,6% vanaf 9,7 maanden na de infusie van CAR T-cellen. Bij de 12 patiënten met een MRDnegatieve complete respons behaalden 10 patiënten (78,8%) een leukemie-vrije overleving vanaf 4,8 maanden (Figuur 16) (127). Deze 10 patiënten ondergingen vervolgens een HSCT en bleken nadien kankervrij (in een follow-up van 10 maanden). Hieruit kan men stellen dat het bereiken van moleculaire remissie door CD19-CAR T-cellen eventueel een goede tussenstap is naar een potentiële genezing door allogene HSCT bij chemorefractaire kinderen met B-ALL (127). Overigens werd deze zelfde vaststelling gedaan bij volwassenen in een studie van Brentjens et al. (135). Figuur 16. Kaplan-Meier plot van studie van Lee et al. toont een algemene overleving van 51,6% vanaf 9,7 maanden voor alle geregistreerde patiënten (onderaan, n = 21, mediane follow-up = 10 maand) en een 78,8% leukemie-vrije overleving vanaf 4,8 maanden bij B-ALL patiënten in MRD-negatieve remissie gingen (bovenaan, n = 12). Tien van de 12 patiënten ondergingen vervolgens een HSCT en bleven ziektevrij (127). 35

41 Lange termijn persistentie van CAR T-cellen is niet per se noodzakelijk om een belangrijk antitumoraal effect te creëren. Bovendien is er minder langdurige B-cel aplasie bij een kortere persistentie. CD19 CAR T-cellen zijn in deze trial geassocieerd met een gunstige langetermijn overleving (127). In fase I trials met CAR T-cellen wordt uitvoerig de veiligheid van de behandeling geëvalueerd. Toxische effecten zoals tumor lyse syndroom, cytokine release syndrome (CRS), macrofaag activatie syndroom, neurologische toxiciteit en aplasie van normale B-lymfocyten werden daarbij reeds beschreven (Figuur 17) (126). In een fase I studie van Lee et al. in 2014 werden de toxische effecten van CAR T-celtherapie geëvalueerd bij 21 kinderen en adolescenten. Graad 4 CRS behoorde tot de ernstigste nevenwerkingen maar de meest voorkomende waren koorts, hypokaliëmie, febriele neutropenie 1 en CRS graad 3. Alle toxiciteiten bleken volledig reversibel (127). Omdat de bijwerkingen soms levensbedreigend zijn, betekent dit dat het ideale CAR design in evenwicht moet zijn tussen maximale antitumorale en minimale toxische effecten (138). Figuur 17. Toxische effecten van CD19 CAR T-cellen bij normale én leukemische cellen (126). 1 Febriele neutropenie wordt internationaal gedefinieerd als koorts of klinische signalen van sepsis bij een neutrofielen concentratie van 0.5 x *10E9/l of lager, of van < 1.0 *10E9/l waarbij wordt verwacht dat dit binnen 48 uur zal dalen onder 0.5 x *10E9/l. Koorts wordt volgens de European Society for Medical Oncology (ESMO) gedefinieerd als een toename van de axillaire temperatuur: minimum 38.5 C gedurende minstens één uur Aapro MS, Bohlius J, Cameron DA, Dal Lago L, Donnelly JP, Kearney N, et al update of EORTC guidelines for the use of granulocyte-colony stimulating factor to reduce the incidence of chemotherapy-induced febrile neutropenia in adult patients with lymphoproliferative disorders and solid tumours. Eur J Cancer. 2011;47(1):8-32, 137. Van Der Biessen D, Folsche M. Een ernstige bijwerking van chemotherapie: Febriele neutropenie. Oncologica. 2012(2):9. 36

42 Cytokine release syndroom (CRS) De meest frequente en ernstige nevenwerking van de behandeling met CAR T-cellen is het cytokine release syndroom met hyperactivatie van het immuunsysteem en hoge concentraties cytokines geassocieerd met T-cel activatie en proliferatie (139). In het bloed vindt men hoge spiegels van cytokines IL10, IL6, IFN-y en CRP en ferritine (127, ). Data vanuit een studie van Brentjens et al. in 2013 wijzen op een positieve correlatie tussen enerzijds het tumorale kaliber op het moment van de CAR T-cel infusie en anderzijds de cytokine concentraties met hun overeenkomstige klinische nevenwerkingen of eenvoudiger gezegd: de ernst van CRS is afhankelijk van de ziektetoestand vóór de behandeling (Figuur 18) (135). Figuur 18. Positieve correlatie tussen de maximale IFN- concentratie (pg/ml) en de tumor burden 2 (links) en de correlatie tussen de maximale CAR T-cellen en de tumor burden (rechts) werd berekend met behulp van de Spearman correlatiecoëfficiënt (r) (135). In de kliniek gaat dit syndroom gepaard met koorts en myalgie; coagulopathie en ernstige hypotensie; longoedeem en multipel orgaan falen (MOF) (127, ). Voor deze toxische nevenwerking zijn er enkele behandelingsmogelijkheden. Systemische corticoïden onderdrukken het immuunsysteem maar leiden tevens tot het opheffen van het anti-leukemisch effect van CAR T-cellen en dragen zo bij in de verdere progressie of herval van ALL. Anderzijds is er tocilizumab, een monoclonaal antilichaam specifiek gericht tegen de IL6 receptor en zorgt voor een daling en klinische verbetering van de IL6 spiegels (141). Tocilizumab is de voorkeursbehandeling van de ernstigere vormen van CRS omwille van zijn snelle werking en het potentieel onderdrukkend effect van hoge doses corticosteroïden op de CAR T-cellen (127). Tocilizumab heeft schijnbaar geen negatieve impact op de effectiviteit van CD19 gerichte CAR T-cellen. Wel zou het eventueel de maximale T-cel proliferatie kunnen 2 Met tumor burden drukt men het aantal kankercellen uit, het tumorvolume of de hoeveelheid kanker in het lichaam. In dit geval is de tumor burden het aantal maligne IgH klonen in het voorbehandeld beenmerg. 37

43 verhinderen door een negatief cytokine feedback systeem. Mede om die reden wordt tocilizumab enkel aangewend bij patiënten met graad 4 CRS of bij levensbedreigende toxische effecten (139) Tumor lysis syndroom (TLS) Het tumor lysis syndroom is een verstoring van het metabool evenwicht (o.a. hyperkaliëmie, hyperfosfatemie en hyperuricemie) dat kan ontstaan door het vrijkomen van afbraakproducten van snel groeiende tumoren of door initiatie van anti-tumorale therapieën (143). Het TLS wordt frequent gezien bij patiënten met een grote tumor massa of bij sterk prolifererende maligniteiten (zoals acute leukemie) (126). TLS trad op bij slechts een klein aantal patiënten in fase I trials na de behandeling met CAR T-cellen en blijkt niet de meest voorkomende of belangrijkste bijwerking te zijn (127, 138, 139, 144) Macrofaag activatie syndroom, neurotoxiciteit en aplasie Het macrofaag activatie syndroom komt tot uiting in de kliniek als massieve hyperferritinemie; ernstige coagulopathie; hypofibrinogenemie; hepatosplenomegalie; langdurige koorts; stijging van inflammatoire cytokines en abnormaal gedrag (126). Neurotoxiciteit kan zich voordoen onder de vorm van hallucinaties, transiënte dysfagie en milde encephalopathie. In een fase 1 clinical trial van Daniel W Lee et al. werden bij 6 van de 21 patiënten die behandeld werden met CAR-T cellen neurologische toxische effecten gedetecteerd. Bij alle 6 patiënten werden in het cerebrospinaal vocht aantoonbare en hogere concentraties van CD19 CAR T-cellen aangetroffen dan in patiënten zonder tekenen van neurotoxiciteit (145). Langdurige B-cel aplasie ontstaat door CAR T-cel persistentie. In verschillende fase I trials werd B-lymfocyten depletie gevonden bij bijna alle patiënten. Deze cel depletie wordt gemonitord door middel van IgG en kan worden behandeld met intraveneuze IgG opdat opportunistische infecties kunnen vermeden worden bij patiënten met hypogammaglobulinemie (126). 38

44 Blinatomumab Een andere vorm van immunotherapie is Blinatomumab. Dit is een bi-specific T-cel engaging of BiTE antilichaam dat zorgt voor de het aanwerven van T-cellen om het anti-tumorale effect te verhogen. Door de rekrutering en activering van T-cellen zorgen deze antilichamen voor cellyse van doelwitcellen (146). Blinatumomab is een eiwit dat bestaat uit twee afzonderlijke antilichamen (elk bestaande uit een enkelvoudige keten) (Figuur 19) (147). Deze antilichamen zijn respectievelijk gericht tegen de CD3 merker van T-cellen en tegen het CD19 antigen dat tot expressie komt bij B-cellen waardoor het een belangrijk doelwit wordt in de behandeling van B-ALL (Zie Immunofenotypische en Cytogenetische Classificatie) ( ). CD19 draagt bij tot proliferatie, overleving en zelfvernieuwingsactiviteit van (maligne) B-cellen ( ). Figuur 19: Blinatomumab is een zeer kleine bispecifieke molecule bestaande uit een enkelvoudige keten van een antilichaam tegen CD3 en een enkelvoudige keten van een antilichaam tegen CD19 (beide enkelvoudige ketens bestaan uit een lichte en zware keten). Cel lyse van een maligne B-cel wordt beoogd door de activering van een T-cel door het antilichaam (147). Het mechanisme van blinatumomab zorgt ervoor dat maligne B-cellen dicht bij CD3 positieve T-cellen worden gebracht zonder rekening te moeten houden met de T-cel receptor specificiteit of met de MHC (i.e. major histocmpatibiliteits complex) klasse I moleculen op het oppervlak van antigen-presenterende cellen. De antilichamen zorgen in feite voor de synaps tussen een T- cel en een maligne B-cel. Cellyse wordt gemedieerd door secretie van perforine en verschillende granzymen die vrijkomen uit de vesikels of granules van cytotoxische T-cellen en die via de synaps terecht komen in de maligne B-cel (Figuur 20) (147, 155). 39

45 Figuur 20. Het BiTE antilichaam creëert een verbinding (synaps) tussen de cytotoxische T-cel en de tumorale B-cel. Granules bestaande uit granzymes en perforine versmelten met de T-cel membraan en laten hun toxische producten vrij met als gevolg apoptose van de maligne doelwitcel (147). Blinatumomab wordt intraveneus (IV) toegediend en heeft een korte halfwaardetijd van 2 uur. Dit werd aangetoond door drie verschillende fase I studies op volwassenen (156). Omwille van de korte halfwaardetijd is een continue toediening van het antilichaam vereist. In een studie bij volwassen patiënten met een non-hodgkin lymfoom (NHL) werd een duidelijke lineaire dosiscurve aangetoond wat maakt dat het antilichaam bij voorkeur 24 op 24 uur moet worden toegediend. Ondanks het gebrek aan gegevens bij kinderen, blijken dankzij farmacokinetische data bij een eerste fase I studie van blinatumomab bij kinderen de serum concentraties gelijk aan die van volwassenen (157, 158). Bij de huidige clinical trials wordt blinatumomab continu toegediend gedurende 28 dagen gevolgd door een onderbreking van 14 dagen (159). De meest frequente bijwerkingen zijn koorts, rillingen, vermoeidheid en anemie, doch deze zijn vrij mild en reversibel (156). De minder frequente, maar meer persisterende bijwerkingen zijn toxische effecten van het CZS (zoals hoofdpijn, afasie, ataxie, slaapzucht of lethargie, tremor, desoriëntatie, syncope en epilepsie aanvallen), CRS (zie Cytokine release syndroom) en infecties gerelateerd aan leukopene of neutropene toestand (159, 160). De pro-inflammatoire response gerelateerd aan de toediening van blinatumomab kan geremd worden door het gebruik van dexamethasone (i.e. corticosteroïd) bij het begin van de therapie wat de cytokine concentratie zou verminderen zonder daarbij de T-cel activatie te verstoren (161). Bij ernstigere symptomen van CRS kan worden gebruik gemaakt van tocilizumab, een IL6-receptor antilichaam waarvan recent werd ontdekt dat dit een gunstig effect had bij een kind met een levensbedreigende vorm van CRS (162). Tocilizumab kan worden aangewend indien er nog steeds onvoldoende controle is van de CRS na het gebruik van corticosteroïden. Bij patiënten 40

46 met herval van ALL lag de incidentie van CZS toxiciteit en CRS hoger dan bij MRD positieve ALL patiënten (163, 164). Bij kinderen met herval van ALL werd een fase I studie opgezet waarbij de gelijkenissen van de farmacologische responsen en toxische effecten bij volwassenen even groot zijn. Uit deze studie werd de maximaal getolereerde dosis (MTD) bij kinderen gelegd op 15µg/m 2 /dag en de aanbevolen dosis op 5µg/m 2 /dag in de eerste week gevolgd door een dagdosis van 15µg/m 2 /dag vanaf de tweede week (157, 158). De werkzaamheid van blinatumomab werd voor het eerst aangetoond bij volwassen patiënten met herval van NHL (non-hodgkin lymfoom). In een studie van Bargou et al. in 2008 stelde men een belangrijke respons vast bij 11 van de 38 patiënten, waarvan 4 patiënten in complete en 7 in partiële remissie gingen (165). Recent werd in een fase II studie bij volwassen patiënten met refractaire B-ALL moleculaire remissie geïnduceerd door blinatumomab bij 80% (163). In een studie bij patiënten met herval van B-ALL werd complete respons bereikt in 25 van de 36 patiënten (69%), waarvan 22 een MRD negatieve status bereikten. Hierbij was de respons groter bij patiënten met een eerste herval dan bij patiënten met herhaaldelijk herval (164). In 2010 werd door Handgretinger et al. de respons op blinatumomab voor het eerst beschreven in de pediatrische setting bij 3 kinderen met refractaire B-ALL na meervoudig herval en na allogene HSCT. Deze patiënten waren gerelateerd met een zeer slechte prognose (166). Een continue toediening van bilinatumomab in een dosis van 15µg/m2/dag voor 4 tot 6 weken resulteerde bij de drie kinderen in een complete remissie met een negatieve MRD status (166). Verdere fase I studies met blinatumomab bij kinderen met B-ALL worden uitgevoerd met het oog op zeer hoog risico patiënten. In een studie van Schlegel et al. in 2014 werden louter kinderen geselecteerd die reeds één of meerdere malen hervielen na transplantatie en zonder behoorlijke respons op chemotherapie. In deze setting werd blinatumomab toegediend met de intentie tot remissie en het vereenvoudigen van een volgende HSCT met een haplo-identieke donor. Gelijkaardig aan de resultaten bij volwassenen stelde men een indrukwekkende antileukemische activiteit van blinatumomab vast bij kinderen met zeer hoog risico en chemorefractaire B-ALL. In de cohorte van 9 patiënten bereikten er zes complete remissie na toediening van blinatomumab (160). Verschillende clinical trials (zoals hierboven vermeld) trachten aan te tonen dat er naast de klassieke therapieën ook plaats zou zijn voor de toevoeging van immunotherapieën zoals blinatumomab, hetgeen een lange termijn kankervrije overleving zou kunnen verlengen (160). Vaak zijn patiënten refractair na herval na allogene HSCT en zijn zij bijzonder gevoelig voor toxische bijwerkingen van chemotherapie (166). Er moet echter nog verder worden uitgewerkt 41

47 waar en wanneer in de therapie van herval van ALL blinatumomab een plaats kan innemen om de beste klinische en moleculaire respons te verkrijgen en minimale toxische nevenwerkingen te veroorzaken (159). 42

48 5. Discussie Ondanks de vooruitgang de laatste jaren in de overleving van kinderen met primaire ALL, bleef de prognose van relapse ALL tot op heden zeer ongunstig. Herval van ALL gaat omwille van de evolutie van gemuteerde klonen gepaard met therapeutische resistentie. Door uitgebreide genetische karakterisatie van diagnostische stalen en stalen bij herval kwamen recent moleculaire afwijkingen in verschillende pathways aan het licht die vragen om een innovatieve doelgerichte behandeling met de intentie om therapieresistentie op te heffen. Deze afwijkingen en hun potentiële therapeutische mogelijkheden werden in deze masterscriptie beschreven. In de eerste plaats is er een significante toename van mutaties bij herval in epigenetische regulatoren. Verstoorde epigenetische regulatoire mechanismen resulteren in verstoorde methylatie van DNA promotors en verstoorde acetylatie van histonen waardoor de transcriptie en genexpressie gewijzigd worden. Dit soort mutaties, meer specifiek CREBBP mutaties, kunnen getarget worden door histon deacetylase (HDAC) inhibitoren. In de JAK-STAT pathway worden voornamelijk mutaties gevonden in JAK3 en JAK1. Zij kunnen specifiek geïnhibeerd worden door selectieve JAK-inhibitoren als ruxolitinib (= JAK1 en 2 selectief). Deze inhibitoren zijn echter nog in ontwikkeling en werden nog niet getest in de kliniek. Als derde belangrijke pathway is er het nucleoside metabolisme. Nucleoside analogen (o.a. mercaptopurine) worden standaard toegediend in de behandelingsschema s met chemo. Een ontregeld metabolisme van nucleoside analogen resulteert in chemoresistentie. Gain of function mutaties in het PRPS1 en NT5C2 gen geven een toegenomen activiteit van deze genen waardoor de activatie van nucleoside analogen onderdrukt wordt of ze versneld worden afgebroken. Doelgerichte behandelingen als GART inhibitor lometrexol en nucleotidase inhibitoren kunnen het verstoord nucleoside metabolisme weer omkeren. Tot slot werd de glucocorticoïden signaaltransductie beschreven. Verminderde expressie van TBL1XR1 door deleties veroorzaakt een toegenomen glucocorticoïd resistentie en wordt daarom een belangrijk aangrijpingspunt voor nieuwe therapeutische strategieën (zoals HDAC inhibitoren) bij herval van ALL opdat mutante cellen opnieuw gevoelig worden voor prednisolone (glucocorticoïd). Met de klonale evolutie van mutante subklonen in het achterhoofd zouden sommigen van deze hierboven geschetste therapieën mogelijks ook een plaats kunnen innemen bij de behandeling van primaire ALL, d.i. in de fronline protocols. Aangezien mutaties bij relapse ALL vaak reeds in kleine subklonen voorkomen bij de diagnose, zou op die manier chemoresistentie en herval kunnen voorkomen worden door mutatie-specifieke behandelingen. Anderzijds zijn daar enkele 43

49 ethische kwesties aan verbonden. Het is niet noodzakelijk zo dat elke mineure subkloon uitgroeit tot een predominante relapse kloon. Bovendien gaan mutatie-doelgerichte therapieën toch nog dikwijls gepaard met nevenwerkingen zodat de levenskwaliteit en mogelijks ook de overleving opnieuw teruggeschroefd worden bij patiënten met primaire ALL, net nu deze overleving de laatste jaren een heel pak toegenomen is. Verdere klinische studies zijn vereist om de ideale setting en tijdstip te definiëren van mutatie-specfieke behandelingen. Verder kan bij ernstige chemorefractaire patiënten of patiënten met herhaaldelijk herval gebruik worden gemaakt van immunotherapieën, zoals CAR T-cellen en blinatumomab. Deze werden reeds in de kliniek getest en zouden geassocieerd zijn met een gunstige langetermijnsoverleving. Nochtans zijn er ondanks deze goede resultaten enkele kritische bedenkingen die bij immunotherapie moeten gemaakt worden. Vooreerst worden na de infusie met CAR T-cellen patiënten die daarvoor geschikt zijn behandeld met een allo-hsct (omwille van het protocol) wat een langdurige follow up van het effect van CAR T-cellen onmogelijk maakt. Tevens kunnen CAR-T cellen en blinatumomab levensbedreigende bijwerkingen veroorzaken (zoals hooggradig CRS) die gepaard gaan met een ernstige morbiditeit en mortaliteit. Bovendien werden de immunotherapieën nog onvoldoende getest bij grotere studiepopulaties om algemene richtlijnen omtrent het gebruik ervan te kunnen opstellen. Tot slot moeten we ons afvragen, als deze therapie inderdaad een gunstige overleving met zich meebrengt, of we deze immunotherapie enkel gebruiken bij zeer chemorefractaire patiënten of deze in de toekomst ook kunnen toepassen bij andere patiënten (met herval) wat natuurlijk een enorme financiële en logistieke organisatie behoeft. Tevens moet de afweging gemaakt worden of men elke patiënt met herval individueel moet gaan behandelen (mits gedetailleerde genetische karakterisatie vooraf) met doelgerichte mutatie-specifieke therapieën of men standaard bij herval het principe van immunotherapie zou doorvoeren. Een eerste stap in de verbetering van de behandeling van kinderen met relapse ALL is gezet: verschillende moleculaire afwijkingen werden achterhaald en gelinkt aan een specifieke mutatie-gerichte behandeling. Er is echter een verdere continuïteit nodig in het vervolledigen van deze genetische kaart om beter inzicht te krijgen in de ontwikkeling en vorming van relapse ALL. Daarnaast werden immunotherapieën ontwikkeld. Verdere klinische studies met uitgebreide cohortes dienen te worden uitgevoerd en geëvalueerd om de plaats en het tijdstip van deze innovatieve behandelingen nauwkeurig te kunnen definiëren. 44

50 6. Referenties 1. Harrison CJ. Acute lymphoblastic leukaemia. Best Practice & Research Clinical Haematology. 2001;14(3): Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 2004;350(15): Dreamstime. Medical illustration of the symptoms of leukemia in the blood. Online Opgehaald op 29 september Available from: 4. Alperstein W, Boren M, McNeer JL. Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia: From Diagnosis to Prognosis. Pediatr Ann. 2015;44(7):e Kebriaei P, Anastasi J, Larson RA. Acute lymphoblastic leukaemia: diagnosis and classification. Best Pract Res Clin Haematol. 2002;15(4): Kumar P, M. C. Malignant disease. Kumar and Clark s clinical medicine. 8th ed: Elsevier Saunders; p Hunger SP, Mullighan CG. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 2015;373(16): Rose-Inman H, Kuehl D. Acute leukemia. Emerg Med Clin North Am. 2014;32(3): Silverman LB, Gelber RD, Dalton VK, Asselin BL, Barr RD, Clavell LA, et al. Improved outcome for children with acute lymphoblastic leukemia: results of Dana-Farber Consortium Protocol Blood. 2001;97(5): Pui CH, Sandlund JT, Pei D, Rivera GK, Howard SC, Ribeiro RC, et al. Results of therapy for acute lymphoblastic leukemia in black and white children. JAMA. 2003;290(15): Conter V, Arico M, Valsecchi MG, Basso G, Biondi A, Madon E, et al. Long-term results of the Italian Association of Pediatric Hematology and Oncology (AIEOP) acute lymphoblastic leukemia studies, Leukemia. 2000;14(12): Inaba H, Greaves M, Mullighan CG. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet. 2013;381(9881): Hunger SP, Lu X, Devidas M, Camitta BM, Gaynon PS, Winick NJ, et al. Improved survival for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia between 1990 and 2005: a report from the children's oncology group. J Clin Oncol. 2012;30(14): Schultz KR, Bowman WP, Aledo A, Slayton WB, Sather H, Devidas M, et al. Improved early event-free survival with imatinib in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia: a children's oncology group study. J Clin Oncol. 2009;27(31): Ravandi F, O'Brien S, Thomas D, Faderl S, Jones D, Garris R, et al. First report of phase 2 study of dasatinib with hyper-cvad for the frontline treatment of patients with Philadelphia chromosome-positive (Ph+) acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2010;116(12): Greaves M. Childhood leukaemia. BMJ. 2002;324(7332): Alpar D, Wren D, Ermini L, Mansur MB, van Delft FW, Bateman CM, et al. Clonal origins of ETV6- RUNX1(+) acute lymphoblastic leukemia: studies in monozygotic twins. Leukemia. 2015;29(4): Ma Y, Dobbins SE, Sherborne AL, Chubb D, Galbiati M, Cazzaniga G, et al. Developmental timing of mutations revealed by whole-genome sequencing of twins with acute lymphoblastic leukemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(18): Eden T. Aetiology of childhood leukaemia. Cancer Treat Rev. 2010;36(4): Pui C-H. Acute lymphoblastic leukaemia. Lancet. 2008;371: Arico M, Ziino O, Valsecchi MG, Cazzaniga G, Baronci C, Messina C, et al. Acute lymphoblastic leukemia and Down syndrome: presenting features and treatment outcome in the experience of the Italian Association of Pediatric Hematology and Oncology (AIEOP). Cancer. 2008;113(3): Buitenkamp TD, Izraeli S, Zimmermann M, Forestier E, Heerema NA, van den Heuvel-Eibrink MM, et al. Acute lymphoblastic leukemia in children with Down syndrome: a retrospective analysis from the Ponte di Legno study group. Blood. 2014;123(1): Papaemmanuil E, Hosking FJ, Vijayakrishnan J, Price A, Olver B, Sheridan E, et al. Loci on 7p12.2, 10q21.2 and 14q11.2 are associated with risk of childhood acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet. 2009;41(9): Prasad RB, Hosking FJ, Vijayakrishnan J, Papaemmanuil E, Koehler R, Greaves M, et al. Verification of the susceptibility loci on 7p12.2, 10q21.2, and 14q11.2 in precursor B-cell acute lymphoblastic leukemia of childhood. Blood. 2010;115(9): Sherborne AL, Hosking FJ, Prasad RB, Kumar R, Koehler R, Vijayakrishnan J, et al. Variation in CDKN2A at 9p21.3 influences childhood acute lymphoblastic leukemia risk. Nat Genet. 2010;42(6): Trevino LR, Yang W, French D, Hunger SP, Carroll WL, Devidas M, et al. Germline genomic variants associated with childhood acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet. 2009;41(9):

51 27. Hsu WL, Preston DL, Soda M, Sugiyama H, Funamoto S, Kodama K, et al. The incidence of leukemia, lymphoma and multiple myeloma among atomic bomb survivors: Radiat Res. 2013;179(3): Greaves MF. Aetiology of acute leukaemia. Lancet. 1997;349(9048): Bailey HD, Armstrong BK, de Klerk NH, Fritschi L, Attia J, Lockwood L, et al. Exposure to diagnostic radiological procedures and the risk of childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2010;19(11): Valera ET, Brassesco MS, Tone LG. Electromagnetic fields at extremely low frequencies and the risk for childhood leukemia: do we have enough information to warrant this association? Leuk Res. 2014;38(3): Crosignani P, Tittarelli A, Borgini A, Codazzi T, Rovelli A, Porro E, et al. Childhood leukemia and road traffic: A population-based case-control study. Int J Cancer. 2004;108(4): Feychting M, Svensson D, Ahlbom A. Exposure to motor vehicle exhaust and childhood cancer. Scand J Work Environ Health. 1998;24(1): Meinert R, Schuz J, Kaletsch U, Kaatsch P, Michaelis J. Leukemia and non-hodgkin's lymphoma in childhood and exposure to pesticides: results of a register-based case-control study in Germany. Am J Epidemiol. 2000;151(7):639-46; discussion Ross JA, Potter JD, Robison LL. Infant leukemia, topoisomerase II inhibitors, and the MLL gene. J Natl Cancer Inst. 1994;86(22): Savitz DA, Andrews KW. Review of epidemiologic evidence on benzene and lymphatic and hematopoietic cancers. Am J Ind Med. 1997;31(3): Kinlen L. Population mixing and childhood leukaemia. Eur J Epidemiol. 2015;30(12): Kinlen LJ. Epidemiological evidence for an infective basis in childhood leukaemia. Br J Cancer. 1995;71(1): Greaves MF. Speculations on the cause of childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 1988;2(2): Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. French-American-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol. 1976;33(4): Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, Brunning RD, Borowitz MJ, Porwit A, et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes. Blood. 2009;114(5): Denys B, van der Sluijs-Gelling AJ, Homburg C, van der Schoot CE, de Haas V, Philippe J, et al. Improved flow cytometric detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2013;27(3): Ghazavi F, Lammens T, Van Roy N, Poppe B, Speleman F, Benoit Y, et al. Molecular basis and clinical significance of genetic aberrations in B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Exp Hematol. 2015;43(8): Harrison CJ. The genetics of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Baillieres Best Pract Res Clin Haematol. 2000;13(3): Dastugue N, Suciu S, Plat G, Speleman F, Cave H, Girard S, et al. Hyperdiploidy with chromosomes in childhood B-acute lymphoblastic leukemia is highly curable: CLG-EORTC results. Blood. 2013;121(13): Moorman AV, Enshaei A, Schwab C, Wade R, Chilton L, Elliott A, et al. A novel integrated cytogenetic and genomic classification refines risk stratification in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2014;124(9): Nachman JB, Heerema NA, Sather H, Camitta B, Forestier E, Harrison CJ, et al. Outcome of treatment in children with hypodiploid acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2007;110(4): Harrison CJ, Moorman AV, Broadfield ZJ, Cheung KL, Harris RL, Reza Jalali G, et al. Three distinct subgroups of hypodiploidy in acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 2004;125(5): Chen C, Bartenhagen C, Gombert M, Okpanyi V, Binder V, Rottgers S, et al. Next-generationsequencing-based risk stratification and identification of new genes involved in structural and sequence variations in near haploid lymphoblastic leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 2013;52(6): Raynaud S, Cave H, Baens M, Bastard C, Cacheux V, Grosgeorge J, et al. The 12;21 translocation involving TEL and deletion of the other TEL allele: two frequently associated alterations found in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 1996;87(7): Romana SP, Poirel H, Leconiat M, Flexor MA, Mauchauffe M, Jonveaux P, et al. High frequency of t(12;21) in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood. 1995;86(11): Pui C-H, Evans WE. Treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia. New England Journal of Medicine. 2006;354(2): Fischer M, Schwieger M, Horn S, Niebuhr B, Ford A, Roscher S, et al. Defining the oncogenic function of the TEL/AML1 (ETV6/RUNX1) fusion protein in a mouse model. Oncogene. 2005;24(51):

52 53. Pui CH, Raimondi SC, Hancock ML, Rivera GK, Ribeiro RC, Mahmoud HH, et al. Immunologic, cytogenetic, and clinical characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia with the t(1;19) (q23; p13) or its derivative. J Clin Oncol. 1994;12(12): Raimondi SC, Behm FG, Roberson PK, Williams DL, Pui CH, Crist WM, et al. Cytogenetics of pre-bcell acute lymphoblastic leukemia with emphasis on prognostic implications of the t(1;19). J Clin Oncol. 1990;8(8): Schmiegelow K, Forestier E, Hellebostad M, Heyman M, Kristinsson J, Soderhall S, et al. Long-term results of NOPHO ALL-92 and ALL-2000 studies of childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2010;24(2): Uckun FM, Sensel MG, Sather HN, Gaynon PS, Arthur DC, Lange BJ, et al. Clinical significance of translocation t(1;19) in childhood acute lymphoblastic leukemia in the context of contemporary therapies: a report from the Children's Cancer Group. J Clin Oncol. 1998;16(2): Ribeiro RC, Abromowitch M, Raimondi SC, Murphy SB, Behm F, Williams DL. Clinical and biologic hallmarks of the Philadelphia chromosome in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 1987;70(4): Platanias LC. Mechanisms of BCR-ABL leukemogenesis and novel targets for the treatment of chronic myeloid leukemia and Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Leuk Lymphoma. 2011;52 Suppl 1: Sam TN, Kersey JH, Linabery AM, Johnson KJ, Heerema NA, Hilden JM, et al. MLL gene rearrangements in infant leukemia vary with age at diagnosis and selected demographic factors: a Children's Oncology Group (COG) study. Pediatr Blood Cancer. 2012;58(6): Thirman MJ, Gill HJ, Burnett RC, Mbangkollo D, McCabe NR, Kobayashi H, et al. Rearrangement of the MLL gene in acute lymphoblastic and acute myeloid leukemias with 11q23 chromosomal translocations. N Engl J Med. 1993;329(13): Slany RK. The molecular biology of mixed lineage leukemia. Haematologica. 2009;94(7): Mann G, Attarbaschi A, Schrappe M, De Lorenzo P, Peters C, Hann I, et al. Improved outcome with hematopoietic stem cell transplantation in a poor prognostic subgroup of infants with mixed-lineage-leukemia (MLL)-rearranged acute lymphoblastic leukemia: results from the Interfant-99 Study. Blood. 2010;116(15): Yeoh EJ, Ross ME, Shurtleff SA, Williams WK, Patel D, Mahfouz R, et al. Classification, subtype discovery, and prediction of outcome in pediatric acute lymphoblastic leukemia by gene expression profiling. Cancer Cell. 2002;1(2): Campana D. Minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2010;2010: Cooper SL, Brown PA. Treatment of Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia. Pediatric Clinics of North America. 2015;62(1): Pui C-H, Relling MV, Campana D, Evans WE. Childhood acute lymphoblastic leukemia. Reviews in Clinical and Experimental Hematology. 2002;6(2): Harrison CJ, Foroni L. Cytogenetics and molecular genetics of acute lymphoblastic leukemia. Reviews in Clinical and Experimental Hematology. 2002;6(2): Sun T. Molecular genetics Flow cytometry and immunohistochemistry for hematologic neoplasms. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; p van der Sluis IM, Vrooman LM, Pieters R, Baruchel A, Escherich G, Goulden N, et al. Consensus expert recommendations for identification and management of asparaginase hypersensitivity and silent inactivation. Haematologica. 2016;101(3): Druker BJ, Sawyers CL, Kantarjian H, Resta DJ, Reese SF, Ford JM, et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 2001;344(14): Malagola M, Papayannidis C, Baccarani M. Tyrosine kinase inhibitors in Ph+ acute lymphoblastic leukaemia: facts and perspectives. Ann Hematol. 2016;95(5): De Moerloose B, Suciu S, Bertrand Y, Mazingue F, Robert A, Uyttebroeck A, et al. Improved outcome with pulses of vincristine and corticosteroids in continuation therapy of children with average risk acute lymphoblastic leukemia (ALL) and lymphoblastic non-hodgkin lymphoma (NHL): report of the EORTC randomized phase 3 trial Blood. 2010;116(1): Vora A, Andreano A, Pui CH, Hunger SP, Schrappe M, Moericke A, et al. Influence of Cranial Radiotherapy on Outcome in Children With Acute Lymphoblastic Leukemia Treated With Contemporary Therapy. J Clin Oncol. 2016;34(9): Hu YX, Lu J, He HL, Wang Y, Li JQ, Xiao PF, et al. A prospective evaluation of minimal residual disease as risk stratification for CCLG-ALL-2008 treatment protocol in pediatric B precursor acute lymphoblastic leukemia. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2016;20(9):

53 75. Moricke A, Reiter A, Zimmermann M, Gadner H, Stanulla M, Dordelmann M, et al. Risk-adjusted therapy of acute lymphoblastic leukemia can decrease treatment burden and improve survival: treatment results of 2169 unselected pediatric and adolescent patients enrolled in the trial ALL-BFM 95. Blood. 2008;111(9): Cave H, van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J, et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. European Organization for Research and Treatment of Cancer--Childhood Leukemia Cooperative Group. N Engl J Med. 1998;339(9): Karsa M, Dalla Pozza L, Venn NC, Law T, Shi R, Giles JE, et al. Improving the identification of high risk precursor B acute lymphoblastic leukemia patients with earlier quantification of minimal residual disease. PLoS One. 2013;8(10):e Schrappe M, Valsecchi MG, Bartram CR, Schrauder A, Panzer-Grumayer R, Moricke A, et al. Late MRD response determines relapse risk overall and in subsets of childhood T-cell ALL: results of the AIEOP-BFM-ALL 2000 study. Blood. 2011;118(8): Meyer JA, Wang J, Hogan LE, Yang JJ, Dandekar S, Patel JP, et al. Relapse-specific mutations in NT5C2 in childhood acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet. 2013;45(3): Chen C, Bartenhagen C, Gombert M, Okpanyi V, Binder V, Rottgers S, et al. Next-generation-sequencing of recurrent childhood high hyperdiploid acute lymphoblastic leukemia reveals mutations typically associated with high risk patients. Leuk Res. 2015;39(9): Jones CL, Bhatla T, Blum R, Wang J, Paugh SW, Wen X, et al. Loss of TBL1XR1 disrupts glucocorticoid receptor recruitment to chromatin and results in glucocorticoid resistance in a B-lymphoblastic leukemia model. J Biol Chem. 2014;289(30): Tasian SK, Loh ML, Hunger SP. Childhood acute lymphoblastic leukemia: Integrating genomics into therapy. Cancer. 2015;121(20): Shalapour S, Hof J, Kirschner-Schwabe R, Bastian L, Eckert C, Prada J, et al. High VLA-4 expression is associated with adverse outcome and distinct gene expression changes in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia at first relapse. Haematologica. 2011;96(11): Locatelli F, Schrappe M, Bernardo ME, Rutella S. How I treat relapsed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2012;120(14): Goto H. Childhood relapsed acute lymphoblastic leukemia: Biology and recent treatment progress. Pediatr Int. 2015;57(6): Hof J, Krentz S, van Schewick C, Korner G, Shalapour S, Rhein P, et al. Mutations and deletions of the TP53 gene predict nonresponse to treatment and poor outcome in first relapse of childhood acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 2011;29(23): Mullighan CG. The genomic landscape of acute lymphoblastic leukemia in children and young adults. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2014;2014(1): Mullighan CG, Phillips LA, Su X, Ma J, Miller CB, Shurtleff SA, et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 2008;322(5906): Bhojwani D, Pui CH. Relapsed childhood acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 2013;14(6):e van Delft FW, Horsley S, Colman S, Anderson K, Bateman C, Kempski H, et al. Clonal origins of relapse in ETV6-RUNX1 acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2011;117(23): Mullighan CG. Mutant PRPS1: a new therapeutic target in relapsed acute lymphoblastic leukemia. Nat Med. 2015;21(6): Boundless. Boundless Biology. Online 2016 [2016/10/31]. Available from: Craig J, Wong N. Epigenetics: a reference manual. Norkfolk, UK: Caister Academic Press; p. 94. Bhojwani D, Yang JJ, Pui CH. Biology of childhood acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Clin North Am. 2015;62(1): Huether R, Dong L, Chen X, Wu G, Parker M, Wei L, et al. The landscape of somatic mutations in epigenetic regulators across 1,000 paediatric cancer genomes. Nat Commun. 2014;5: Mar BG, Bullinger LB, McLean KM, Grauman PV, Harris MH, Stevenson K, et al. Mutations in epigenetic regulators including SETD2 are gained during relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Nat Commun. 2014;5: Mullighan CG, Zhang J, Kasper LH, Lerach S, Payne-Turner D, Phillips LA, et al. CREBBP mutations in relapsed acute lymphoblastic leukaemia. Nature. 2011;471(7337): Malinowska-Ozdowy K, Frech C, Schonegger A, Eckert C, Cazzaniga G, Stanulla M, et al. KRAS and CREBBP mutations: a relapse-linked malicious liaison in childhood high hyperdiploid acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2015;29(8):

54 99. Edmunds JW, Mahadevan LC, Clayton AL. Dynamic histone H3 methylation during gene induction: HYPB/Setd2 mediates all H3K36 trimethylation. EMBO J. 2008;27(2): Li F, Mao G, Tong D, Huang J, Gu L, Yang W, et al. The histone mark H3K36me3 regulates human DNA mismatch repair through its interaction with MutSalpha. Cell. 2013;153(3): Park IY, Powell RT, Tripathi DN, Dere R, Ho TH, Blasius TL, et al. Dual Chromatin and Cytoskeletal Remodeling by SETD2. Cell. 2016;166(4): Kawashima-Goto S, Imamura T, Seki M, Kato M, Yoshida K, Sugimoto A, et al. Identification of a homozygous JAK3 V674A mutation caused by acquired uniparental disomy in a relapsed early T-cell precursor ALL patient. Int J Hematol. 2015;101(4): Bergmann AK, Schneppenheim S, Seifert M, Betts MJ, Haake A, Lopez C, et al. Recurrent mutation of JAK3 in T-cell prolymphocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 2014;53(4): Gianfelici V, Chiaretti S, Demeyer S, Di Giacomo F, Messina M, La Starza R, et al. RNA sequencing unravels the genetics of refractory/relapsed T-cell acute lymphoblastic leukemia. Prognostic and therapeutic implications. Haematologica. 2016;101(8): Bains T, Heinrich MC, Loriaux MM, Beadling C, Nelson D, Warrick A, et al. Newly described activating JAK3 mutations in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2012;26(9): Flex E, Petrangeli V, Stella L, Chiaretti S, Hornakova T, Knoops L, et al. Somatically acquired JAK1 mutations in adult acute lymphoblastic leukemia. J Exp Med. 2008;205(4): Kalender Atak Z, De Keersmaecker K, Gianfelici V, Geerdens E, Vandepoel R, Pauwels D, et al. High accuracy mutation detection in leukemia on a selected panel of cancer genes. PLoS One. 2012;7(6):e Shochat C, Tal N, Bandapalli OR, Palmi C, Ganmore I, te Kronnie G, et al. Gain-of-function mutations in interleukin-7 receptor-alpha (IL7R) in childhood acute lymphoblastic leukemias. J Exp Med. 2011;208(5): Zenatti PP, Ribeiro D, Li W, Zuurbier L, Silva MC, Paganin M, et al. Oncogenic IL7R gain-of-function mutations in childhood T-cell acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet. 2011;43(10): Vicente C, Schwab C, Broux M, Geerdens E, Degryse S, Demeyer S, et al. Targeted sequencing identifies associations between IL7R-JAK mutations and epigenetic modulators in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 2015;100(10): Zhang J, Ding L, Holmfeldt L, Wu G, Heatley SL, Payne-Turner D, et al. The genetic basis of early T- cell precursor acute lymphoblastic leukaemia. Nature. 2012;481(7380): Degryse S, de Bock CE, Cox L, Demeyer S, Gielen O, Mentens N, et al. JAK3 mutants transform hematopoietic cells through JAK1 activation, causing T-cell acute lymphoblastic leukemia in a mouse model. Blood. 2014;124(20): Maude SL, Dolai S, Delgado-Martin C, Vincent T, Robbins A, Selvanathan A, et al. Efficacy of JAK/STAT pathway inhibition in murine xenograft models of early T-cell precursor (ETP) acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2015;125(11): Springuel L, Hornakova T, Losdyck E, Lambert F, Leroy E, Constantinescu SN, et al. Cooperating JAK1 and JAK3 mutants increase resistance to JAK inhibitors. Blood. 2014;124(26): Lodish H, Berk A, Kaiser CA, Krieger M, Bretscher A, Ploegh H, et al. Basic Molecular Genetic Mechanisms. Molecular Cell Biology 7ed. New York W.H. Freeman & Company; p Hosni-Ahmed A, Barnes JD, Wan J, Jones TS. Thiopurine methyltransferase predicts the extent of cytotoxicty and DNA damage in astroglial cells after thioguanine exposure. PLoS One. 2011;6(12):e Li B, Li H, Bai Y, Kirschner-Schwabe R, Yang JJ, Chen Y, et al. Negative feedback-defective PRPS1 mutants drive thiopurine resistance in relapsed childhood ALL. Nat Med. 2015;21(6): Aster JC, DeAngelo DJ. Resistance revealed in acute lymphoblastic leukemia. Nat Med. 2013;19(3): Tzoneva G, Perez-Garcia A, Carpenter Z, Khiabanian H, Tosello V, Allegretta M, et al. Activating mutations in the NT5C2 nucleotidase gene drive chemotherapy resistance in relapsed ALL. Nat Med. 2013;19(3): Kunz JB, Rausch T, Bandapalli OR, Eilers J, Pechanska P, Schuessele S, et al. Pediatric T-cell lymphoblastic leukemia evolves into relapse by clonal selection, acquisition of mutations and promoter hypomethylation. Haematologica. 2015;100(11): Perissi V, Rosenfeld MG. Controlling nuclear receptors: the circular logic of cofactor cycles. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005;6(7): Burke MJ, Gossai N, Wagner JE, Smith AR, Bachanova V, Cao Q, et al. Survival differences between adolescents/young adults and children with B precursor acute lymphoblastic leukemia after allogeneic hematopoietic cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 2013;19(1): Forman SJ, Rowe JM. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 2013;121(7):

55 124. Leung W, Campana D, Yang J, Pei D, Coustan-Smith E, Gan K, et al. High success rate of hematopoietic cell transplantation regardless of donor source in children with very high-risk leukemia. Blood. 2011;118(2): De Moerloose B, Vandekerckhove B. Een spectaculaire doorbraak. Durf Denken. 2016;22: Tasian SK, Gardner RA. CD19-redirected chimeric antigen receptor-modified T cells: a promising immunotherapy for children and adults with B-cell acute lymphoblastic leukemia (ALL). Ther Adv Hematol. 2015;6(5): Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, Cui YK, Delbrook C, Feldman SA, et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2015;385(9967): Gulfo JV. Gene-edited donor T-cells save baby with incurable leukemia. Online Opgehaald op 17 oktober Available from: Children's D-FB. Phase I Trial of Immunotherapy Opens for Children with Relapsed or Treatmentresistant Leukemia. Online Opgehaald op 30 september Available from: Brentjens RJ, Riviere I, Park JH, Davila ML, Wang X, Stefanski J, et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B- cell leukemias. Blood. 2011;118(18): Kalos M, Levine BL, Porter DL, Katz S, Grupp SA, Bagg A, et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 2011;3(95):95ra Kochenderfer JN, Dudley ME, Feldman SA, Wilson WH, Spaner DE, Maric I, et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-cd19 chimeric-antigenreceptor-transduced T cells. Blood. 2012;119(12): Kochenderfer JN, Wilson WH, Janik JE, Dudley ME, Stetler-Stevenson M, Feldman SA, et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 2010;116(20): Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 2011;365(8): Brentjens RJ, Davila ML, Riviere I, Park J, Wang X, Cowell LG, et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra Aapro MS, Bohlius J, Cameron DA, Dal Lago L, Donnelly JP, Kearney N, et al update of EORTC guidelines for the use of granulocyte-colony stimulating factor to reduce the incidence of chemotherapy-induced febrile neutropenia in adult patients with lymphoproliferative disorders and solid tumours. Eur J Cancer. 2011;47(1): Van Der Biessen D, Folsche M. Een ernstige bijwerking van chemotherapie: Febriele neutropenie. Oncologica. 2012(2): Gardner RA, Jensen MC. CD19CAR T cells: From humble beginnings to cancer immunotherapy's poster child. Cancer J. 2014;20(2): Maude SL, Frey N, Shaw PA, Aplenc R, Barrett DM, Bunin NJ, et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N Engl J Med. 2014;371(16): Maus MV, Grupp SA, Porter DL, June CH. Antibody-modified T cells: CARs take the front seat for hematologic malignancies. Blood. 2014;123(17): Maude SL, Barrett D, Teachey DT, Grupp SA. Managing cytokine release syndrome associated with novel T cell-engaging therapies. Cancer J. 2014;20(2): Barrett DM, Teachey DT, Grupp SA. Toxicity management for patients receiving novel T-cell engaging therapies. Curr Opin Pediatr. 2014;26(1): Howard SC, Jones DP, Pui CH. The tumor lysis syndrome. N Engl J Med. 2011;364(19): Davila ML, Riviere I, Wang X, Bartido S, Park J, Curran K, et al. Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia. Sci Transl Med. 2014;6(224):224ra Lee DW, Kochenderfer JN, Stetler-Stevenson M, Cui YK, Delbrook C, Feldman SA, et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet.385(9967): Mack M, Riethmuller G, Kufer P. A small bispecific antibody construct expressed as a functional singlechain molecule with high tumor cell cytotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995;92(15): Hamblin T. How BiTE antibodies work. Online Opgehaald op 16 oktober Available from: 50

56 148. Baeuerle PA, Reinhardt C. Bispecific T-cell engaging antibodies for cancer therapy. Cancer Res. 2009;69(12): Hoffmann P, Hofmeister R, Brischwein K, Brandl C, Crommer S, Bargou R, et al. Serial killing of tumor cells by cytotoxic T cells redirected with a CD19-/CD3-bispecific single-chain antibody construct. Int J Cancer. 2005;115(1): Nagorsen D, Baeuerle PA. Immunomodulatory therapy of cancer with T cell-engaging BiTE antibody blinatumomab. Exp Cell Res. 2011;317(9): Raponi S, De Propris MS, Intoppa S, Milani ML, Vitale A, Elia L, et al. Flow cytometric study of potential target antigens (CD19, CD20, CD22, CD33) for antibody-based immunotherapy in acute lymphoblastic leukemia: analysis of 552 cases. Leuk Lymphoma. 2011;52(6): Kong Y, Yoshida S, Saito Y, Doi T, Nagatoshi Y, Fukata M, et al. CD34+CD38+CD19+ as well as CD34+CD38-CD19+ cells are leukemia-initiating cells with self-renewal capacity in human B-precursor ALL. Leukemia. 2008;22(6): Rickert RC, Rajewsky K, Roes J. Impairment of T-cell-dependent B-cell responses and B-1 cell development in CD19-deficient mice. Nature. 1995;376(6538): Fujimoto M, Poe JC, Inaoki M, Tedder TF. CD19 regulates B lymphocyte responses to transmembrane signals. Semin Immunol. 1998;10(4): Haas C, Krinner E, Brischwein K, Hoffmann P, Lutterbuse R, Schlereth B, et al. Mode of cytotoxic action of T cell-engaging BiTE antibody MT110. Immunobiology. 2009;214(6): Nagorsen D, Kufer P, Baeuerle PA, Bargou R. Blinatumomab: a historical perspective. Pharmacol Ther. 2012;136(3): Zugmaier G, Handgretinger R, Locatelli F, Rizzari C, Trippett TM, Borkhardt A, et al. A phase 1/2 study of blinatumomab in pediatric patients with relapsed/refractory B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.. Blood. 2013; 122(70):/ Gore L, Zugmaier G, Handgretinger R, Locatelli F, Trippett TM, Rheingold SR, et al. Cytological and molecular remissions with blinatumomab treatment in second or later bone marrow relapse in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL). J Clin Oncol 2013;31(Suppl 15): Hoffman LM, Gore L. Blinatumomab, a Bi-Specific Anti-CD19/CD3 BiTE((R)) Antibody for the Treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia: Perspectives and Current Pediatric Applications. Front Oncol. 2014;4: Schlegel P, Lang P, Zugmaier G, Ebinger M, Kreyenberg H, Witte KE, et al. Pediatric posttransplant relapsed/refractory B-precursor acute lymphoblastic leukemia shows durable remission by therapy with the T-cell engaging bispecific antibody blinatumomab. Haematologica. 2014;99(7): Brandl C, Haas C, d'argouges S, Fisch T, Kufer P, Brischwein K, et al. The effect of dexamethasone on polyclonal T cell activation and redirected target cell lysis as induced by a CD19/CD3-bispecific single-chain antibody construct. Cancer Immunol Immunother. 2007;56(10): Teachey DT, Rheingold SR, Maude SL, Zugmaier G, Barrett DM, Seif AE, et al. Cytokine release syndrome after blinatumomab treatment related to abnormal macrophage activation and ameliorated with cytokine-directed therapy. Blood. 2013;121(26): Topp MS, Kufer P, Gokbuget N, Goebeler M, Klinger M, Neumann S, et al. Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolonged leukemia-free survival. J Clin Oncol. 2011;29(18): Topp MS, Goekbuget N, Zugmaier G, Viardot A, Stelljes M, Neumann S, et al. Anti-CD19 BiTE Blinatumomab Induces High Complete Remission Rate and Prolongs Overall Survival in Adult Patients with Relapsed/Refractory B-Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL). Blood. 2012;120(21): Bargou R, Leo E, Zugmaier G, Klinger M, Goebeler M, Knop S, et al. Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engaging antibody. Science. 2008;321(5891): Handgretinger R, Zugmaier G, Henze G, Kreyenberg H, Lang P, von Stackelberg A. Complete remission after blinatumomab-induced donor T-cell activation in three pediatric patients with post-transplant relapsed acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 2011;25(1):

57 Bijlagen Bijlage 1: Kaplan-meier plots met ziektevrije en totale overleving van 2852 behandelde kinderen met primaire ALL tussen 1962 en Kaplan-Meier curves met event-free survival (A) en overall survival (B) bij 2852 kinderen met primaire ALL die behandeld werden in 15 opeenvolgende studies aan het St. Jude Children s Research Hospital, van 1962 tot De vijfjaarsziektevrije overleving en de totale overleving zijn afgebeeld op de onderstaande curves (12). I

58 Bijlage 2: Respons van CREBBP mutante cellen op dexamethasone en vorinostat De respons op dexamethasone en HDAC inhibitor vorinostat wordt hier geïllustreerd bij 2 soorten T-ALL subtypes met CREBBP mutante cellen. De cellen werden gedurende 72 uur behandeld met toenemende concentraties aan dexamethasone (a-b) en vorinostat (c-d). Deze gegevens toonden een glucocorticoïden resistentie aan en een gevoeligheid voor vorinostat bij een bepaalde klinische concentratie (IC50 <1µM) (97). II

59 Bijlage 3: Chemo-resistentie tegen 6-MP en 6-TG bij NT5C2 mutante cellen. Expressie van NT5C2 mutaties bij ALL induceert chemo-resistentie tegen 6-mercaptopurine (6-MP) en 6-thioguanine (6-TG). De overleving en respons van verschillende NT5C2 mutante cellen (zwart) wordt vergeleken met de overleving van wild type NT5C2 cellen (rood) na inductie van stijgende concentraties van 6-MP (a) en 6-TG (b). Deze assay s werden toegepast op CCRF-CEM en CUTLL1 T-ALL cellen (119). III