Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en Mycobacteriën.

Transcriptie

1 Gegevens van het Referentielaboratorium Dr. Ap. M. DUFAUX WIV - Dpt Pasteur Mycobacterïen Engelandstraat, Brussel Tel. : 02/ Fax : 02/ Mfauville@pasteur.be Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en. Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : Op klinische monsters microscopisch onderzoek PCR, op uitdrukkelijk verzoek (opsporing van M. tuberculosis door een PCR die een fragment van het insertie-element IS6110 amplificeert of door Amplicor MTB; opsporing van een mycobacterie door een PCR die een fragment van het gen coderend voor het antigen 85 amplificeert) uitvoeren van een kweek op specifieke voedingsbodems (vloeibare Bactec MGIT of Bactec 12B en vaste Löwenstein- Jensen) identificatie van de positieve kweken (zie hieronder) gevoeligheidstests (zie onderstaande positieve kweken). Op positieve culturen identificatie, door moleculaire biologie (specifieke PCR van verschillende mycobacteriële species, amplificatie van een fragment van het gen coderend voor 16S rrna of voor hsp65, gevolgd door een sequentieanalyse, Inno-Lipa- Mycobacteriatest, PCR aan de hand waarvan het complex M. tuberculosis kan worden ontleed) gevoeligheidstest voor M. tuberculosis - in Bactec MGIT 960 of in Bactec 460TB (vloeibare voedingsbodems) voor de eerstelijnstuberculostatica, met name isoniazide (I), rifampicine (R), ethambutol (E). Pyrazinamide (PZA) werd niet getest omdat het resultaat van de invitrotest niet overeenstemt met de activiteit van de in-vivo-pza - door de proportiemethode van Canetti (vaste voedingsbodem) voor de tweedelijnstuberculostatica en in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica - door de methode Bactec 460TB voor bepaalde tweedelijnsantituberculostatica - door de test Inno-Lipa-Rif-TB of door een sequentieanalyse van een regio van 81 pb van het gen rpob om de resistentie tegen rifampicine na te gaan - door PCR om de mutatie S315T in het gen katg en de mutatie C-15T op te sporen in de regio die bevorderlijk is voor gen inha om de resistentie tegen isoniazide na te gaan gevoeligheidstests op atypische mycobacteriën, alleen wanneer het klinische geval dit rechtvaardigt (proportiemethode van Canetti in vaste voedingsbodem) genotypering van M. tuberculosis, in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica, in geval van een vermoeden van een epidemie of laboratoriumbesmetting of op uitdrukkelijk verzoek (technieken : spoligotyping, MIRU-VNTR op 12 of 22 loci en RFLP op IS6110). Stalen ontvangen voor analyse in 2006 Aantal : stalen (deze worden sinds maart 2006 niet meer voor analyse aanvaard) 1319 culturen Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van 109 verschillende laboratoria in het land, verspreid over Brussel, Wallonië en Vlaanderen. Tabel 1 : : stalen ontvangen voor analyse (N; ) klinische monsters * kweken Totaal * niet meer aangevaard voor analyse sinds maart 2006 myco_b_t1 1

2 Referentielaboratorium - Brussel Geïdentificeerde mycobacteriën van klinische oorsprong Aantal : 1010 [472 (46,7%) M. tuberculosis-complexen en 538 (53,3%) atypische mycobacteriën of NTM]. De verschillende mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en kweken worden in tabellen 3 en 4 vermeld. Het detail van de identificaties per type klinisch staal wordt in tabel 5 weergegeven (enerzijds voor de kweken en anderzijds voor de monsters). In tabel 6 staan de verschillende mycobacteriële species die sinds 1998 jaarlijks worden geïdentificeerd. Gevoeligheidstests 1. M. tuberculosis In 2006 werd M. tuberculosis (complex M. tuberculosis) geïdentificeerd op 472 klinische stalen van 412 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 338 patiënten (op een klinisch isolaat voor de meeste patiënten en op meerdere isolaten voor een twintigtal). Er is geen antibiogram uitgevoerd wanneer de stam is geïsoleerd in een laboratorium dat zelf de gevoeligheidstests uitvoert. Tabel 2 : : gevoeligheidstests (N, %; ) N % N % N % N % N % N % gevoelig voor I, R en E , , , , , ,8 alleen resistent tegen E 1 0,3 1 0,3 alleen resistent tegen I 9 3, ,7 22 8,7 26 8,0 21 6,1 32 9,5 alleen resistent tegen R 1 0,3 2 0,8 1 0,3 0 0,0 2 0,6 resistent tegen I + E 4 1,2 multiresistent (I+R) 1 0,3 3 0,9 2 0,8 7 2,1 multiresistent (I+R+E) 9 3,0 12 3,7 7 2,8 14 4,3 11 3,2 13 3,8 Totaal , , , , , ,0 I : isoniazide, R : rifampicine, E : ethambutol myco_b_t2 Een mutatie in rpob is aangetroffen in alle isolaten resistent tegen rifampicine; een mutatie in katg is aangetroffen bij 90% van de multiresistente isolaten. Onder de monoresistente isolaten resistent tegen isoniazide (of resistent tegen isoniazide en ethambutol), is de mutatie S315T in katg aangetroffen bij 55% van de isolaten, de mutatie C-15T in inha bij 14% van de isolaten en de 2 simultane mutaties bij 3% van de stammen. De 28% van de overblijvende isolaten hadden de gezochte mutatie niet in deze 2 genen. 2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 115 patiënten besmet met de volgende mycobacteriën : 45 M. aviumintracellulare, 25 M. kansasii, 21 M. xenopi, 8 M. marinum, 5 M. malmoense, 3 M. interjectum, 2 M. szulgai en 6 andere atypische mycobacteriën. Moleculaire diagnose van het klinische staal De opsporing van M. tuberculosis door PCR in het klinische staal werd uitgevoerd op 179 monsters waarvan er slechts 12 (7%) positief waren voor het complex M. tuberculosis, 16 (9%) bevatten DNA van atypische mycobacteriën, 4 (2%) bevatten amplificatieremmers en 147 (82%) waren er negatief. Het gelijktijdige kweken is slechts voor enkele stalen gebeurd, 167 werden er uitsluitend met PCR geanalyseerd (tabel 5). Gezien de hoge kostprijs van deze analyse (kit Amplicor TB van Roche), het steeds toenemende aantal aanvragen en het feit dat zij niet altijd gerechtvaardigd zijn evenals een acuut gebrek aan personeel in 2006, hebben wij beslist om geen klinische stalen meer te analyseren vanaf maart Dit gebeurt in de ziekenhuizen. Wij blijven niettemin op verzoek het DNA analyseren dat afkomstig is van stalen genomen in andere laboratoria. 2

3 Genotypering van de tuberculosebacillen In ons laboratorium worden drie genotyperingstechnieken gebruikt om de genetische afdruk van de tuberculosebacillen te bepalen : spoligotyping en MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable Number Tandem Repeat) in eerste instantie en zo nodig IS6110-RFLP om clusters van stammen met een identiek profiel na de twee andere technieken van elkaar te onderscheiden. Genotypering biedt de gelegenheid om de wijze van besmetting van tuberculose na te gaan (bevestiging van intrafamiliale of naburige besmettingen, micro-epidemies, opsporing van kruisbesmettingen in laboratoria tussen twee stalen waarop tezelfdertijd een techniek wordt toegepast). Dankzij deze techniek kan ook humane tuberculose ten gevolge van M. bovis worden onderscheiden van klassieke tuberculose ten gevolge van M. tuberculosis. Genotypering wordt uitgevoerd op alle klinische isolaten resistent tegen isoniazide, op alle multiresistente isolaten en op verzoek, in geval van een vermoeden van een epidemie of besmetting. In de loop van 2006 hebben wij de nieuwe set vergeleken van 15 loci voorgesteld (door Supply 2006) voor de techniek MIRU-VNTR met de oude set van 12 loci; zo hebben wij het veel grotere discriminerende vermogen van de nieuwe set kunnen aantonen. Opmerkingen De nationale gegevens over het aantal gevallen van tuberculose in België en het aantal multiresistente patiënten worden verzameld en verspreid door FARES-VRGT. In ons laboratorium is het aantal gevallen van tuberculose resistent tegen isoniazide en van multiresistente tuberculose sterk toegenomen in vergelijking met 2005 (I resistent 11% in plaats van 6%; MDR 6% in plaats van 3,2%). Van de 1319 kweken verstuurd voor analyse werden er 1314 geanalyseerd. Hiervan bevatten er 296 (22%) geen mycobacteriën, 14 bevatten een andere bacterie die kon worden geïdentificeerd en 5 waren er besmet. In totaal bevatte 24% van de kweken dus geen mycobacteriën, een bijzonder hoog en zorgwekkend percentage. Het probleem had deels te maken met de MB/BacT kweekautomaat gebruikt door bepaalde laboratoria. Het toestel heeft heel wat vals positieven geleverd. Deze situatie heeft veel nodeloos werk met zich gebracht omdat de identificatie van een negatieve cultuur meer werk vergt (om er zeker van te zijn dat zij echt geen mycobacteriën bevat) dan de identificatie van een zuiver mycobacteriële kweek. De meest geïsoleerde speciës van NTM waren net zoals voorgaande jaren M. gordonae (niet pathogeen) gevolgd door het complex M. avium-intracellulare en M. xenopi. Wat de NTM betreft weten wij niet hoeveel onder hen werkelijk aan de oorsprong liggen van een ziekte omdat wij niet over klinische gegevens van de patiënten beschikken. Terwijl M. kansasii, geïsoleerd uit stalen van respiratoire oorsprong in het algemeen als pathogeen kan worden beschouwd, is dit verre van het geval voor M. xenopi, M. chelonae-fortuitum en zelfs M. avium-intracellulare. 3

4 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 3 : : identificatie van culturen uit klinische monsters (N; 2006) Kweken Klin. monsters Totaal TUBCPX M. tuberculosis BK BK + atypische mycobacterië ,7% Pathogeen M. africanum 0 M. bovis patiënten M. BCG 6 6 M. BCG + M. gordonae 0 Totaal TUBCPX NTM M. avium ,3% 24,9% M. intracellulare M. scrofulaceum/paraff. 7 7 M. kansasii ,1% 5,8% M. szulgai 3 3 M. interjectum 7 7 M. lentiflavum 5 5 Potentieel M. malmoense pathogeen M. haemophilum 1 1 M. simiae 1 1 M. xenopi ,4% 21,4% M. marinum M. chelonae/abscessus cpx ,0% 7,4% ,3% M. fortuitum/peregrinum M. mucogenicum 3 3 M. anthracenicum 4 4 M. bohemicum 2 2 M. gordonae ,4% 27,0% M. nonchromogenicum 3 3 Niet pathogeen M. neoaurum 1 1 M. phlei 1 1 M. sphagni 5 5 Cpx terrae-muco.-ratisb. 3 3 M. triplex 1 1 M. species 4 4 Totaal NTM Totaal Andere bacteriën Negatieve Onmogelijk onderzoek of contaminatie Alleen PCR 167 Totaal myco_b_t3 4

5 Tabel 4 : : species geïdentificeerd vertrekkende van kweekbodems (N; 2006) Kweken Totaal Cpx Tuberculosis BK BK + atyp. mycobact. M. bovis BCG M. avium M. intracellulare M. scrofulaceum M. paraffinicum M. kansasii M. szulgai M. interjectum M. lentiflavum M. malmoense M. haemophilum M. simiae M. xenopi M. marinum Cpx M. chelonae-abscessus Cpx M. fortuitum-pegegrinum M. mucogenicum M. anthracenicum M. bohemicum M. gordonae M. nonchromogenicum M. neoaurum M. phlei M. sphagni Cpx M. terrae-mucogenicum-ratisbonense M. triplex M. species Andere bacteriën Geïnfecteerde kweken - onmogelijk onderzoek Afwezigheid van mycobacteriën Uitgezonderd - onmogelijk onderzoek Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht Biopsieën organen Huidbiopsieën Klierbiopsieën Etter Abces Urine Anderen Onbepaald Totaal myco_b_t4 Tabel 5 : : species geïdentificeerd vertrekkende van klinische stalen (N; 2006) Klinische monsters Totaal Cpx Tuberculosis M. kansasii M. marinum Andere mycobacteriën Negatieve monsters Aanwezigheid van ADN van mycobacteriën Afwezigheid van ADN van mycobacteriën Aanwezigheid van ADN van cpx M. tuberculosis Uitgezonderd Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht 3 3 Pleuraalvocht 1 1 Peric. periton. vocht 1 1 Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht 1 1 Biopsieën organen Huidbiopsieën Klieren Etter Abces 3 3 Urine 1 1 Anderen Onbepaald 1 1 Totaal Kweed alleen PCR myco_b_t5 5

6 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 6 : : mycobacteriële species van klinische oorsprong (N; ) Cpx Cpx M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis 12 1 Mengeling M. tub. M. avium 3 2 Mengeling M. tub. M. fort. 1 Mengeling M. tub. M. gordonae Mengeling M. tub. M. intracellulare 1 Mengeling M. tub. M. kansasii 2 Mengeling M. tub. M. lentiflavum 1 1 Mengeling M. tub. M. xenopi 1 Mengeling M. tub. + atypique M. africanum 1 2 M. bovis M. bovis BCG Mengeling M. bovis BCG + M. gordonae 1 Opportunistische M. avium atypische M. Intracellulare M. bohemicum M. celatum Cpx abscessus-chelonae-fortuitum Cpx M. chelonae-abscessus Cpx M. fortuitum-peregrinum M. genavense 1 M. haemophilum M. heckeshornense 2 M. immunogen M. interjectum M. intermedium M. kansasii Mengeling M. kans. M. avium 1 Mengeling M. kans. M. gord. 1 M. lentiflavum M. malmoense M. marinum M. mucogenicum M. novocastrense 2 2 M. paraffinicum M. peregrinum M. scrofulaceum Mengeling M. scrof. M. gord. 1 M. senegalense 1 1 M. shimoidei 1 M. simiae M. smegmatis M. szulgaï M. xenopi Mengeling M. xen. M. gord. 2 M. species Niet of M. agri 1 1 zeer zelden M. alvei pathogeen M. anthracenicum M. branderi 2 M. duvalli 1 1 M. elephantis 1 M. gadium 1 1 M. gilvum 1 M. gordonae M. hiberniae M. holsaticum 1 M. negraskense 1 M. neoaurum 1 1 M. nonchromogenicum M. phlei M. ratisbonense M. sphagni M. terrae Cpx terrae-mucogenicum-ratisbonense 3 M. triplex 1 1 M. triviale 1 Andere bacteriën Totaal myco_b_t6 6

7 7