Onderstaande gegevens tonen het activiteitenverslag van het referentielaboratorium in Antwerpen (I.T.G - Antwerpen). Inleiding

Transcriptie

1 Referentielaboratorium - Antwerpen Onderstaande gegevens tonen het activiteitenverslag van het referentielaboratorium in Antwerpen (I.T.G - Antwerpen). Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : op klinische monsters : microscopisch onderzoek kweek op vaste voedingsbodems (Löwenstein-Jensen, Ogawa en Stonebrink) identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op speciesniveau met behulp van klassieke fenotypische tests en/of moleculaire identificatie eventueel gevoeligheidsbepaling van de gedetecteerde mycobacteriën PCR-analyses : deze analyses laten toe de aanwezigheid van mycobacteriën vast te stellen, en het Mycobacterium tuberculosis-complex te identificeren op basis van het 16S rrna-gen. op positieve kweken : identificatie van de gedeceteerde mycobacteriën tot op speciesniveau met behulp van klassieke fenotypische tests en/of moleculaire identificatie. eventueel gevoeligheidsbepaling van de gedetecteerde mycobacteriën. Hiervoor werd de proportiemethode gebruikt en werden de volgende antiotica getest : eerstelijns op LJ-medium : isoniazide (0,2 en 1 µg/ml), ethambutol (2 µg/ml), rifampicin (40 µg/ml) en streptomycine (4 µg/ml) tweedelijns 7H11 agar (enkel voor MDR-TB) : ofloxacine (4 µg/ml), kanamycine (6 µg/ml), ethionamide (10 µg/ml) en capreomycine (10 µg/ml). aantal monsters ontvangen voor analyse in 2004 Aantal : toegestuurde klinische monsters 103 toegestuurde positieve kweken Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van een 20-tal verschillende laboratoria in het land, verspreid over Vlaanderen. Voor sommige patiënten werd meer dan één monster ontvangen. In tabel 1 wordt een verdeling weergegeven van de monsters volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat. Een aantal stalen werden gestuurd voor kwaliteitscontrole van gevoeligheidsbepalingen, terwijl de meerderheid gestuurd werd voor een eerste analyse (diagnose of gevoeligheidsbepaling en identificatie). Tabel 1 : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 2004 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat Kweken Klinische monsters Eerste analyse NTM Negatief Uitgezonderd Bevestiging Kwaliteitscontrole ADN-fingerprinting myco_a_tab1 1

2 Referentielaboratorium - Antwerpen Identificatie van de positieve monsters in 2004 Aantal : 15 klinische monsters van 373 verschillende patiënten werden positief in cultuur (9 MTB en 6 NTM) 48 van de 59 toegestuurde isolaten uit verschillende patiënten werden geïdentificeerd als mycobacteriën (33 MTB en 15 NTM). In tabel 2 wordt een overzicht gegeven van de geïdentificeerde monsters. Het gaat hier enkel om Mycobacterium species isolaten die werden toegestuurd uit perifere laboratoria of werden geïsoleerd uit klinische monsters in het referentielaboratorium voor een eerste identificatie. Isolaten toegestuurd voor kwaliteitscontrole van de identificatie werden niet meegerekend. Het merendeel van de gekarakteriseerde isolaten (42/63 of 67%) behoren tot het -complex, gevolgd door het -complex (6/63 of 9,5%) en (5/63 of 7,9%). In Figuur 1 wordt een evolutie weergegeven van het totale aantal geïdentificeerde mycobacteriën van Belgische oorsprong in het referentielabotorium over de laatste 5 jaar. Daarbij zien we dat de verhouding van atypische (NTM, of niet-tuberculeuze mycobacteriën) tegenover tuberculose vrij constant blijft. Tabel 2 : mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en toegestuurde kweken in 2004, gerangschikt per oorsprong en identificatie. Monsters voor kwaliteitscontrole en DNA-fingerprinting werden niet ingesloten. Per patiënt werd slechts één monster meegerekend. Niet-mycobacterien Negatief M. neo-aruum M. nebranski Klinische Monsters Expectoraties Urine Huidbiopsieën Etter / wisser Sperma 9 9 Faeces 4 4 Pleuraal vocht 1 1 Subtotaal Kweken Expectoraties Bronchiale aspiraties Etter Peritoneaal vocht 1 1 Urine Onbepaalde oorsprong Subtotaal myco_a_tab2 2

3 Referentielaboratorium - Antwerpen Figuur 1 : totaal aantal mycobacteriën geïdentificeerd in 2000, 2001, 2002, 2003 en 2004 N % 59% NTM -complex M. frederiksbergense M. nebraski M. necaurum M. smegmatis N % % M. frederiksbergense M. nebraski M. necaurum M. smegmatis N % 43% M. frederiksbergense M. nebraski M. necaurum M. smegmatis N % % M. frederiksbergense M. nebraski M. necaurum M. smegmatis N % % M. frederiksbergense M. nebraski M. necaurum M. smegmatis 3

4 Referentielaboratorium - Antwerpen Gevoeligheidstest 1. In 2004 werd -complex geïdentificeerd bij 42 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor alle isolaten. Aantal patiënten gevoelig voor H (isoniazide), R (rifampicine) en E (ethambutol) en S (streptomycine) : 39 mono-resistent tegen S : 1 resistent tegen H en S : 1 multi-resistent (HRES) : 1 2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest is uitgevoerd voor 8 patiënten met de volgende mycobacteriën : 4, 1, 2 M. intracellulare en 1. De resistentieprofielen waren wisselend, maar de meerderheid vertoonde resistentie aan de courante anti-tb middelen. Diagnose per moleculaire biologie op klinische monsters In 2004 zagen we een afname van de aanvragen voor opsporing van -complex of mycobacteriën in het algemeen door PCR in klinische monsters. Het ging om 17 aanvragen waarbij 3 monsters van respiratoire oorsprong waren. Details staan weergegeven in tabel 3. Tabel 3 : detectie van mycobacterieel DNA in klinische monsters ontvangen in 2004 PCR (16S rrna gen) 1 Monster Aantal Neg. Specifiek voor Specifiek voor - genus complex Mycobacterium Sputum Wisser 5 5 Huidbiopsie Etter 1 1 Lumbaal vocht 1 1 Andere Niet-gecommercialiseerde testen vervaardigd in het Laboratorium van mycobacteriologie van het ITG myco_a_tab3 4

5 Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en. Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : Op klinische monsters microscopisch onderzoek PCR, op uitdrukkelijk verzoek (opsporing van door een PCR die een fragment van het insertie-element IS6110 amplificeert of door Amplicor MTB; opsporing van een mycobacterie door een PCR die een fragment van het gen coderend voor het antigen 85 amplificeert) uitvoeren van een kweek op specifieke voedingsbodems (vloeibare Bactec MGIT of Bactec 12B en vaste Löwenstein- Jensen) identificatie van de positieve kweken (zie hieronder) gevoeligheidstests (zie onderstaande positieve kweken) Op positieve culturen identificatie, door moleculaire biologie (specifieke PCR van verschillende mycobacteriële species, amplificatie van een fragment van het gen coderend voor 16S rrna of voor hsp65, gevolgd door een sequentieanalyse, Inno-Lipa- Mycobacteriatest, PCR aan de hand waarvan het complex kan worden ontleed) gevoeligheidstest voor - in Bactec MGIT 960 of in Bactec 460TB (vloeibare voedingsbodems) voor de eerstelijnstuberculostatica, met name isoniazide (I), rifampicine (R), ethambutol (E). Pyrazinamide (PZA) werd niet getest omdat het resultaat van de invitrotest niet overeenstemt met de activiteit van de in-vivo-pza - door de proportiemethode van Canetti (vaste voedingsbodem) voor de tweedelijnstuberculostatica en in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica - door de methode Bactec 460TB voor bepaalde tweedelijnsantituberculostatica - door de test Inno-Lipa-Rif-TB of door een sequentieanalyse van een regio van 81 pb van het gen rpob om de resistentie tegen rifampicine na te gaan - door PCR om de mutatie S315T in het gen katg en de mutatie C-15T op te sporen in de regio die bevorderlijk is voor gen inha om de resistentie tegen isoniazide na te gaan gevoeligheidstests op atypische mycobacteriën, alleen wanneer het klinische geval dit rechtvaardigt (proportiemethode van Canetti in vaste voedingsbodem) genotypering van, in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica, in geval van een vermoeden van een epidemie of laboratoriumbesmetting of op uitdrukkelijk verzoek (technieken : spoligotyping, MIRU-VNTR op 12 of 22 loci en RFLP op IS6110). Stalen ontvangen voor analyse in 2004 Aantal: stalen 1002 culturen Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van 103 verschillende laboratoria in het land, verspreid over Brussel, Wallonië en Vlaanderen. Geïdentificeerde mycobacteriën van klinische oorsprong Aantal : 967 [443 (45,8%) -complexen en 524 (54,2%) atypische mycobacteriën of NTM] De verschillende mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en kweken worden in figuur 1 en tabel 1 vermeld. Het detail van de identificaties per type klinisch staal wordt in tabel 2 weergegeven (enerzijds voor de kweken en anderzijds voor de monsters). In tabel 3 staan de verschillende mycobacteriële species die sinds 1998 jaarlijks worden geïdentificeerd. 1

6 Figuur 1 : : stalen voor analyse verstuurd naar het Pasteur Instituut van Brussel, stalen 1002 culturen 682 klinische stalen M. Tuberculosis Complex * NTM 509 Negatieve stallen Alleen door PCR geanalyseerd Verwijderde stallen * M. tub. voor KC van de AB ** * NTM = Non Tuberculous Mycobacteria; KC = Kwaliteitscontrole; AB = Antibiogram ** 432 = andere Gevoeligheidstests 1. In 2004 werd (complex ) geïdentificeerd op 443 klinische stalen van 361 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 325 patiënten (op één klinisch isolaat voor 308 patiënten en op meerdere isolaten voor 17 patiënten). Er is geen antibiogram uitgevoerd wanneer de stam is geïsoleerd in een laboratorium dat zelf de gevoeligheidstests uitvoert. Aantal patiënten gevoelig voor I (isoniazide), R (rifampicine) en E (ethambutol) : 285 (87,7%) Alleen gevoelig voor I : 26 (7,7%) Multiresistent (I+R+E) : 14 (4,3%) Alleen resistent tegen R : 1 Een mutatie in rpob is aangetroffen in alle isolaten resistent tegen rifampicine; een mutatie in katg en in inha is aangetroffen bij respectievelijk 71,4% en 14,3% van de multiresistente isolaten. Onder de monoresistente isolaten, resistent tegen isoniazide, zijn de mutaties aangetroffen in katg en inha bij respectievelijk 46,1% en 7,7% van de isolaten, de overblijvende isolaten hadden geen mutaties in deze genen. 2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 94 patiënten besmet met de volgende mycobacteriën : 47 intracellulare, 19, 15, 2 M. malmoense, 4, 4 en 3 andere mycobacteriën. Moleculaire diagnose van het klinische staal De opsporing van door PCR in het klinische staal werd aangevraagd voor 482 monsters waarvan er slechts 63 (13%) positief waren. 351 monsters werden tezelfdertijd door PCR en kweek geanalyseerd. Onder hen bevatten er 48 (14%) amplificatie-inhibitoren, waardoor de PCR-resultaten slechts konden worden vergeleken met die van de cultuur van 303 stalen (259 [85,5%] die door het rechtstreekse onderzoek negatief waren bevonden, 17 [5,6%] positief en 27 [8,9%] onbepaald). De gevoeligheid van de specifieke PCR van het complex (Amplicor TB test de Roche) in vergelijking met de kweek (systeem Bactec MGIT van Becton-Dickinson), berekend voor de 303 stalen, bedroeg 64% (32/50) terwijl de specificiteit 96% (242/253) bereikte. De gevoeligheid van de PCR in vergelijking met de kweek, berekend voor de 17 positieve stalen op het rechtstreekse onderzoek, bedroeg 100,0% terwijl de gevoeligheid berekend voor de 259 stalen met een negatieve microscopie slechts 15,5% bedroeg (tabel 4). Opmerkingen De nationale gegevens over het aantal gevallen van tuberculose in België en het aantal multiresistente patiënten worden verzameld en verspreid door FARES-VRGT. In ons laboratorium is het aantal gevallen van tuberculose resistent tegen isoniazide vergelijkbaar met dat van Het aantal gevallen van multiresistente tuberculose neemt lichtjes toe. 2

7 Het aantal kweken verstuurd voor identificatie die geen mycobacteriën bevatten maar een contaminerend microörganisme, is heel hoog (10%), toegeschreven aan de toepassing van nieuwe veiligheidsnormen, waarbij het verboden is om buiten laboratorium L3 flesjes van positieve culturen te openen, ook niet voor een uitstrijkje. De toename van het aantal vloeibare kweken (76%) die voor identificatie werden ingediend in vergelijking met kweken op een vaste voedingsbodem werd bevestigd. Het percentage mycobacteriën dat als besmettelijk wordt beschouwd en is geïdentificeerd in vloeibare kweken ligt hoger dan dat van contaminanten geïdentificeerd in kweken op een vaste voedingsbodem. De meest geïsoleerde speciës van NTM waren net zoals voorgaande jaren (niet pathogeen) en, gevolgd door het complex -intracellulare. Wat de NTM betreft weten wij niet hoeveel onder hen werkelijk aan de oorsprong liggen van een ziekte omdat wij niet over klinische gegevens van de patiënten beschikken. Terwijl, geïsoleerd uit stalen van respiratoire oorsprong in het algemeen als pathogeen kan worden beschouwd, is dit verre van het geval voor, -fortuitum en zelfs -intracellulare. Het gebruik van vloeibare bodems (Bactec 460TB, Bactec 9000, Bactec MGIT, MB/Bact enz.), evenals de identificatie van de positieve kweken door heel specifieke technieken van moleculaire biologie (zoals de sequentieanalyse van de hypervariabele sequentieregio van het 16S rdna of het gen hsp 65) hebben de identificatie mogelijk gemaakt van atypische mycobacteriën die niet konden worden geïdentificeerd vóór 1999 (tabel 3). Wat betreft de diagnose van tuberculose door PCR op DNA dat rechtstreeks afkomstig is van de klinische staal, naast de aanwezigheid van amplificatieremmers in 14% van de geanalyseerde stalen, is de gevoeligheid van de PCR in vergelijking met de kweek op de negatieve stalen bijzonder zwak gebleken in het rechtstreekse onderzoek (gevoeligheid van 45,5%) terwijl de gevoeligheid op de positieve stalen in het microscopische onderzoek 100,0% bedroeg. De cultuur blijft dus de onmisbare gold standard voor de diagnose van tuberculose. Gezien de hoge kostprijs van de moleculaire diagnose en haar slechte gevoeligheid zouden clinici er slechts om moeten vragen in goed gedocumenteerde gevallen met een sterk vermoeden van tuberculose. 3

8 Tabel 1 : : identificatie van culturen uit klinische monsters in 2004 Kweken Klinische Monsters TUBCPX Mixt. M. Tub + M. lent Pathogeen patiënten M. BCG TUBCPX ,8% NTM ,8% 23,7% ,1% 3,8% M. interjectum M. malmoense Potentieel M. haemophilum pathogeen M. heckeshornense M. simiae ,7% 23,5% M. abscessus ,8% 7,1% /peregrinum M. agri M. alvei M. anthracenicum M. bohemicum M. elephantis ,6% 30,7% Niet M. holsaticum pathogeen M. lentiflavum M. neoaurum M. phlei NTM ,2% myco_b_tab1 4

9 Tabel 2 : : species geïdentificeerd op het Pasteur Instituut van Brussel, 2004 Tuberculosis complex Mix. M. tub. + M. lent. M. BCG M. interjectum M. malmoense M. haemophilum M. heckeshornense M. simiae M. abscessus M. fort./pegegrinum M. agri M. alvei M. anthracenicum M. bohemicum M. elephantis M. holsaticum M. lentiflavum M. neoaurum M. phlei Corynebacterium Nocardia Infectie Negatieve monsters Alleen PCR Uitgezonderd monsters kweken OMS "Quality Control" klinische monsters Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht Cerebrospinaal vocht 1 1 Gewrichtsvocht Biopsieën organen Huidbiopsieën 1 1 Klieren Etter Abces Urine Bloed 9 9 Anderen Onbepaald kweken Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht 6 6 Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht Biopsieën organen Huidbiopsieën Klieren Etter Abces Urine 6 6 Bloed 7 7 Anderen Onbepaald klinische monsters monsters myco_b_tab2 5

10 Tabel 3 : : species sinds 1998 geïdentificeerd op het Pasteur Instituut van Brussel Complex Complex Mengeling M. tub. 3 2 Mengeling M. tub. M. fort. 1 Mengeling M. tub. 6 1 Mengeling M. tub. 1 Mengeling M. tub. M. kans 2 Mengeling M. tub. M. lentiflavum 1 1 Mengeling M. tub. 1 Mengeling M. tub. + atypisch 4 1 M. africanum BCG Opportunistische atypische M. Intracellulare M. bohemicum M. celatum Complex abscessus-chelonae-fortuitum M. genavense 1 M. haemophilum 1 1 M. heckeshornense 2 M. immunogen M. interjectum M. intermedium Mengeling M. kans. 1 Mengeling M. kans. M. gord. 1 M. lentiflavum M. malmoense M. novocastrense 2 2 M. paraffinicum 5 8 M. peregrinum Mengeling M. scrof. M. gord. 1 M. senegalense 1 1 M. shimoidei 1 M. simiae M. smegmatis 1 2 M. szulgaï Mengeling M. xen. M. gord Niet of zeer zelden M. agri 1 1 pathogeen M. alvei M. anthracenicum 3 M. duvalli 1 1 M. elephantis 1 M. gadium 1 1 M. gilvum M. hiberniae M. holsaticum 1 2 M. neoaurum M. phlei 1 2 M. ratisbonense M. sphagni M. triplex 1 M. triviale 1 Andere bacterie myco_b_tab3 6

11 Tabel 4 : : gevoeligheid en specificiteit van PCR in vergelijking met kweek, op 303 monsters geanalyseerd door 2 methoden Gevoeligheid Specificiteit 17 positief rechtstreeks onderzoek 100,0% 16 / negatief rechtstreeks onderzoek 44,8% 13 / 29 95,7% 220 / niet bepaalde rechtstreeks onderzoek 60,0% 3 / 5 100,0% 22 / geanalyseerde monsters 64,0% 32 / 50 95,7% 242 / 253 myco_b_tab4 7