Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid

Transcriptie

1 Externe kwaliteitsevaluatie in Microbiologie 2014 Identificatie van Mycobacteriën Gevoeligheidsbepaling van Mycobacterium tuberculosis complex isoniazide (INH), rifampicine (RMP), ethambutol (EMB) en facultatief pyrazinamide (PZA). Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid 1. Deelnemers Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis, AALST ZNA, Campus Stuivenberg, ANTWERPEN Instituut voor Tropische Geneeskunde, ANTWERPEN UZ-VUB, BRUSSEL Laboratoire de la Porte de Hal, BRUXELLES CHU Erasme, ULB, BRUXELLES Cliniques Universitaires Saint-Luc, UCL, BRUXELLES Tuberculose & Mycobacteriën, OD Overdraagbare en besmettelijke ziekten, WIV, BRUSSEL Ch Jolimont-Lobbes, site Jolimont, HAINE-SAINT-PAUL UZ Gasthuisberg, LEUVEN CHR de la Citadelle, LIEGE CHU Sart-Tilman, LIEGE Laboratoire Nationale de Santé, LUXEMBOURG, Grand Duché de Luxembourg Cliniques UCL de Mont-Godinne, YVOIR 2. Stalen Pakketten van 5 tubes, genummerd van 1 tot en met 5, werden naar de deelnemers verstuurd op 15 september Het betrof culturen van 3 verschillende stammen van het Mycobacterium tuberculosis complex, die gevoelig of resistent waren aan de te testen antibiotica en 2 atypische mycobacteriën (M. fortuitum en M. intracellulare). Alle stammen werden verstuurd in MGIT 7H9 milieu. De stalen werden voorbereid door het laboratorium Tuberculose en Mycobacteriën van het WIV (Dr. Vanessa Mathys) (selectie van de stammen, kweek, verdeling in tubes) en vervolgens naar de deelnemers verzonden door de afdeling Kwaliteit van Medische Laboratoria van het WIV (Dr. Kris Vernelen). Rapport EKE Mycobacteriën

2 Kenmerken van de stammen Stam 1 Mycobacterium tuberculosis 2 Mycobacterium tuberculosis 3 Mycobacterium fortuitum 4 Mycobacterium intracellulare 5 Mycobacterium tuberculosis 16S r DNA= DNA dat codeert voor 16S rrna Resistentie profiel of identificatiemethode in het referentielabo I-R-E-Z S-S-S-S S-S-S-S S-R-S-S Isoniazide mutatie (I) Rifampicine Mutatie (R) S531L Rapport EKE Mycobacteriën

3 3. Resultaten Aantal deelnemers: 14 (één laboratorium voert tijdelijk geen testen uit wegens verhuizing) Eerste resultaat ontvangen na 30 dagen. Laatste resultaat ontvangen na 75 dagen. Gebruikte methoden voor identificatie: Een aantal laboratoria die meerdere technieken gebruikten, gebruikten één techniek voor M. tuberculosis en een andere voor de atypische mycobacteriën of gebruikten bepaalde technieken enkel voor sommige van de stammen. - 5 laboratoria gebruikten enkel moleculaire technieken (2 laboratoria vermeldden 1 techniek en 3 vermeldden 2 technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van twee moleculaire technieken, biochemische technieken en de Malditof biotyper - 2 laboratoria gebruikten een combinatie van moleculaire technieken en chromatografische technieken (1 laboratorium gebruikte 1 moleculaire techniek en 1 laboratorium 2 moleculaire technieken) - 2 laboratoria gebruikten een combinatie van moleculaire technieken, een chromatografische techniek en de Malditof biotyper (1 laboratorium gebruikte 2 moleculaire technieken en 1 laboratorium 3 moleculaire technieken) - 1 laboratorium gebruikte biochemische technieken en een chromatografische techniek - 1 laboratorium gebruikte biochemische technieken, een chromatografische techniek en de Malditof biotyper - 2 laboratoria gebruikten enkel een chromatografische techniek Moleculaire methoden: - Inno-Lipa Mycobacteria: 2 deelnemers - GenProbe Sonde: 1 deelnemer - GenoType Mycobacterium (Hain): 2 deelnemers - In house PCR (target 16S rdna): 1 deelnemer - In house PCR (target IS6110): 1 deelnemer - In house PCR (target 16S 23S rdna): 1 deelnemer - In house PCR (target IS6110 (M. tuberculosis) en 85 Ag (M. intracellulare): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S rdna): 5 deelnemers - Sequencing (target hsp 65): 1 deelnemer - Gene Xpert: 3 deelnemers - Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder): 1 deelnemer Chromatografische methoden: - MGIT TBC Identification test (Becton Dickinson): 6 deelnemers - Bioline TB Ag MPT64 (Standard Diagnostics): 2 deelnemers De uitgevoerde biochemische testen bestonden uit: productie van niacine, nitraatreductie, reductie van K-telluriet, arylsulfatase 3 dagen, Na-citraat, hydrolyse van Tween 80, ijzerreductase, urease, katalase, vergisting van inositol en mannitol, groei op 5% NaCl, pigmentvorming en analyse van mycolzuren via gaschromatografie (aantal en aard van de gebruikte technieken verschillen naargelang de laboratoria). Rapport EKE Mycobacteriën

4 Gebruikte methoden voor bepaling van antibiogram: 2 types van methoden - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - proportionele methode van Canetti op vaste bodem Negen laboratoria hebben de gevoeligheid voor pyrazinamide bepaald; ze hebben 2 types van methoden gebruikt: - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - bepaling van pyrazinamide-activiteit met Rosco-tablet Gedetailleerde bespreking van de resultaten: 1) Identificaties Het overzicht van de antwoorden worden hieronder weergegeven. De correcte of aanvaardbare resultaten zijn onderlijnd Tabel 4 geeft de identificatietechnieken, gebruikt door de laboratoria, en de geantwoorde identificaties weer. Staal 1: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 11 (78.6%) M. tuberculosis 3 (21.4%) Staal 2: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 11 (78.6%) M. tuberculosis 3 (21.4%) Staal 3: M. fortuitum M. fortuitum 9 (64.3%) M. fortuitum complex 1 (7.1%) M. fortuitum-peregrinum 1 (7.1%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 3 (21.4%) Staal 4: M. intracellulare M. intracellulare 9 (64.3%) M.avium- intracellulare complex 2 (14.3%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 3 (21.4%) Staal 5: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 11 (78.6%) M. tuberculosis 3 (21.4%) Rapport EKE Mycobacteriën

5 2) Antibiogrammen a) Tabel 1 geeft het aantal uitgevoerde testen weer per methode, evenals het aantal testen dat volledig overeenstemmende resultaten opleverde met de resultaten van het laboratorium, dat de stammen selecteerde (Tuberculose & Mycobacteriën, DG Overdraagbare en besmettelijke ziekten van het WIV). We stellen vast voor isoniazide, rifampicine en ethambutol dat 92.9% van de testen uitgevoerd werden in een vloeibaar medium met een geautomatiseerde methode. 11 van de 14 bepalingen (78.6%) leverden resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Eén laboratorium bekwam geen resultaten voor isoniazide en ethambutol voor stam 5; één laboratorium bekwam een resultaat R waar S verwacht werd voor isoniazide voor stam 2 en een ander laboratorium een resultaat R waar S verwacht werd voor ethambutol voor stam 1. We moeten overigens opmerken dat naast het laboratorium dat voor 2 antibiotica geen resultaten bekwam voor stam 5 ook meerdere andere laboratoria moeite hadden met het in cultuur brengen van deze stam De Bactec MGIT techniek wordt het meest gebruikt door de Belgische laboratoria (13 testen op 14). 76.9% (10/13) van de gebruikers van deze techniek bekwamen resultaten die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentielaboratorium. Voor pyrazinamide (rechter deel van de tabel) leverden 7 van de 9 bepalingen (77.8%) voor dit antibioticum resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Ook voor dit antibioticum is de Bactec MGIT techniek de meest gebruikte door de Belgische laboratoria (8 testen op 9); 75.0% (6/8) van de resultaten die met deze techniek bekomen werden waren in overeenstemming met deze van het referentiecentrum. b) Tabel 2a geeft de gedetailleerde resultaten weer per laboratorium (aangeduid door een letter). De gebruikte methode, de eindconcentratie van elk antibioticum per ml milieu et het volume van het inoculum worden eveneens weergegeven. Voor elk laboratorium werd voor elk antibioticum het percentage resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum berekend. Zoals reeds hoger vermeld werd er voor zowel isoniazide als ethambutol één afwijkend resultaat vastgesteld en bekwam één laboratorium geen resultaten voor stam 5 voor deze antibiotica. Voor rifampicine was de concordantie met het referentiecentrum 100%. Tabel 2b geeft dezelfde gegevens weer voor pyrazinamide. Zowel voor staal 2 als voor staal 5 was er telkens één laboratorium dat een afwijkend resultaat bekwam ( R waar S verwacht werd). Commentaar Drie van de 13 gebruikers van de Bactec MGIT techniek, hebben niet vermeld welke antibioticadoses zij gebruikt hebben. Van de 10 anderen, gebruiken allen de concentraties die BD voorschrijft en gebruiken 2 de 2 voorgeschreven dosissen van isoniazide Voor de gevoeligheidsbepaling aan pyrazinamide, hebben 5 van de 8 gebruikers van het Bactec MGIT de door BD voorgeschreven dosissen gebruikt; drie laboratoria hebben de dosis niet vermeld. c) Tabel 3 geeft de samenvatting weer van de resultaten van de testen, die op elk der 3 stalen uitgevoerd werden. Het aantal evalueerbare resultaten bedroeg 42 voor isoniazide, rifampicine Rapport EKE Mycobacteriën

6 en ethambutol en 27 voor pyrazinamide. Het percentage correcte resultaten (in vergelijking met deze van het referentiecentrum voor het geheel der testen, per antibioticum bedraagt 100 % voor rifampicine, 95.2% voor isoniazide en ethambutol en 92.6% voor pyrazinamide. Voor elk antibioticum werd eveneens de gevoeligheid en de specificiteit van een resultaat voor resistentie berekend (ten opzichte van het resultaat van het referentiecentrum) en de voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat. 4. Bespreking A. Identificatie van Mycobacteriën. Er waren geen incorrecte resultaten. Mycobacterium tuberculosis complex. We veronderstellen dat de laboratoria die naast de moleculaire ook biochemische testen gebruikt hebben, het onderscheid tussen M. tuberculosis en M. bovis kunnen maken. Mycobacterium fortuitum Alle resultaten zijn concordant met de gebruikte technieken. Mycobacterium intracellulare Alle resultaten zijn concordant met de gebruikte technieken. B. Gevoeligheidstesten De resultaten zijn uitstekend voor rifampicine. Voor isoniazide en ethambutol werd één afwijkend resultaat voor respectievelijk stam 2 en 1 (in beide gevallen: R waar S verwacht werd; MGIT techniek). Zoals reeds hoger vermeld waren er naast het laboratorium dat geen resultaten bekwam voor stam 5 voor deze beide antibiotica ook andere laboratoria die problemen ondervonden met deze stam. Voor pyrazinamide vonden twee laboratoria een afwijkend resultaat: stalen 2 en 5 (in beide gevallen R waar S verwacht werd; MGIT techniek). 5. Besluit De kwaliteitscontrole voor identificatie van mycobacteriën leverde goede resultaten op: de 5 stammen (3 M. tuberculosis, 1 M. fortuitum en 1 M. intracellulare) werden correct geïdentificeerd door de meerderheid van de laboratoria. De Belgische kwaliteitscontrole 2014 van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor INH, RMP en EMB, uitgevoerd door 14 deelnemers op 3 stalen, leverde voor RMP uitstekende resultaten op; voor INH en EMB stelden zich enkele problemen. We stelden 100 % concordante resultaten vast voor RMP en 95.2% voor INH en EMB. De sensitiviteit, specificiteit, de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat en van een resistent resultaat bedroegen 100% voor rifampicine; de specificiteit bedroeg 95.2% voor isoniazide en ethambutol en de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat 100% (de sensitiviteit en voorspellende waarde van een resistent resultaat werden niet berekend aangezien de 3 stammen gevoelig waren aan deze antibiotica). Rapport EKE Mycobacteriën

7 De gevoeligheidstesten voor PZA werden door 9 laboratoria uitgevoerd: de concordantie en de specificiteit bedroegen 92.6%; de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat bedroeg 100%. Rapport EKE Mycobacteriën

8 6. Tabellen Tabel 1 Gebruikte methoden en technische details Methode Aantal testen Aantal testen 100% overeenkomend PZA: Aantal testen PZA: Aantal testen 100% overeenkomend Bactec MGIT Canetti op vaste bodem Rosco disks Totaal (78.6 %) 9 7 (77.8%) Tabel 3 Globale resultaten van de testen, uitgevoerd op de 3 stalen Stam nummer Isoniazide Rifampicine Ethambutol Pyrazinamide Ref S R NA Ref S R Ref S R NA Ref S R 1 S S 14 0 S S S S 14 0 S S S R 0 14 S S 8 1 Concordantie 40/42 = 95.2 % 42/42 = 100 % 40/42 = 95.2 % 25/27 = 92.6 % Sensitiviteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam R een resultaat R oplevert - 14 R vastgest. /14 R verwacht = 100 % - - Specificiteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam S een resultaat S oplevert 40 S vastgest. /42 S verwacht = 95.2 % 28 S vastgest. /28 S verwacht = 100 % 40 S vastgest. /42 S verwacht = 95.2 % 25 S vastgest./ 27 verwacht = 92.6 % Waarschijnlijkheid dat een stam R is als hij op AB als R gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 0 juiste R vastgest./1 R tot. vastgest. 14 juiste R vastgest./14 R tot. vastgest. = 100 % 0 juiste R vastgest./1 R tot. vastgest. 0 juiste R vastgest./2 R tot. vastgest. Waarschijnlijkheid dat een stam S is als hij op AB als S gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 40 juiste S vastgest./40 S tot. vastgest. = 100 % 28 juiste S vastgest./28 S tot. vastgest. = 100 % 40 juiste S vastgest./40 S tot. vastgest. = 100 % 25 juiste S vastgest. / 25 S tot. vastgest. = 100 % Rapport EKE Mycobacteriën

9 Tabel 2a Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Isoniazide Rifampicine Ethambutol Stam Methode Res.Refer. S S S S S R S S S A B C D S S NA S S R S S NA Bactec MGIT E F G H I S S S S S R S S S Canetti 7H10 J K L M S S S S S R R S S Bactec MGIT N S R S S S R S S S Bactec MGIT Labo Concordantie INH RMP EMB Inoc. INH RMP EMB µg/ml µg/ml µg/ml ml % % % 100 % Correct Methode A Bactec MGIT 0, B Bactec MGIT 0, C Bactec MGIT 0, D Bactec MGIT 0.1 en E Bactec MGIT 0.1 en , F Bactec MGIT , G Bactec MGIT , H Bactec MGIT 0, , I Canetti 7H en * J Bactec MGIT 0, K Bactec MGIT 0, , L Bactec MGIT 0, M Bactec MGIT 0, N Bactec MGIT 0, , * 3 druppels van van 1 McF Rapport EKE Mycobacteriën

10 Tabel 2b Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor pyrazinamide voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers die de gevoeligheid voor dit antibioticum bepaald hebben RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Pyrazinamide Stam Methode Res.Refer. S S S A S S S Bactec MGIT C S S S Bactec MGIT D S S S Bactec MGIT E S R S Bactec MGIT F S S S Bactec MGIT G S S S Bactec MGIT I S S S Rosco tablet L S S R Bactec MGIT M S S S Bactec MGIT Concordantie PZA Inoc. PZA µg/ml ml % 100 % Correct Labos Methode A Bactec MGIT C Bactec MGIT D Bactec MGIT E Bactec MGIT 100 0, F Bactec MGIT 0,2 100 G Bactec MGIT 100 0,5 100 I Rosco tablet * ** 100 L Bactec MGIT 100 0, M Bactec MGIT 100 0,5 100 * 900 µg/tablet ** 3 druppels van van 1 McF Rapport EKE Mycobacteriën

11 Tabel 4 Gedetailleerde tabel voor de resultaten van de identificaties Labo Methode Resultaten stammen 1, 2 en 5 Resultaat stam 3 Resultaat stam 4 A Sequencing (target hsp 65) M. tuberculosis complex M. fortuitum M. intracellulare B C D Biochemische testen + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper In house PCR (target 16S rdna) + Sequencing (target 16S rdna) + Bioline TB Ag MPT64 In house PCR (target 16S - 23S rdna) + Gene expert (staal 5) M. tuberculosis M. fortuitum M. intracellulare M. tuberculosis complex M. fortuitum M. intracellulare M. tuberculosis complex M. non-tuberculosis M. non-tuberculosis E Bioline TB Ag MPT64 M. tuberculosis complex M. non-tuberculosis M. non-tuberculosis F G H I J GenoType Mycobacterium (Hain) (stalen 1 en 2) + Sequencing (target 16S rdna) + Gene expert (stalen 2 en 5) + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper (stalen 3 en 4) In house PCR ((target IS6110 (stalen 1, 2 en 5) en 8S Ag (staal 4)) + Sequencing (target 16S rdna (stalen 3 en 4) GenProbe Sonde + Sequencing (target 16S rdna) + Biochemische testen + Malditof Biotyper Biochemische testen (met analyse van mycolzuren via gaschromatografie) + MGIT TBC Identification Test In house PCR (target IS6110) + Sequencing (target 16S rdna) M. tuberculosis complex M. fortuitum M. intracellulare M. tuberculosis complex M. fortuitum M. intracellulare M. tuberculosis M. fortuitum M. intracellulare M. tuberculosis M. fortuitum M. aviumintracellulare complex M. tuberculosis complex M. fortuitum complex M. aviumintracellulare complex K MGIT TBC Identification Test M. tuberculosis complex M. non-tuberculosis M. non-tuberculosis Inno-Lipa Mycobacteria + M. tuberculosis complex M. fortuitum M. intracellulare Gene expert + L MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper Inno-Lipa Mycobacteria + M. tuberculosis complex M. fortuitumperegrinum M. intracellulare M Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder) GenoType Mycobacterium (Hain) + M. tuberculosis complex M. fortuitum M. intracellulare N MGIT TBC Identification Test Rapport EKE Mycobacteriën