Dr. F. PORTAELS I.T.G. - Mycobacteriologie Nationalestraat, Antwerpen Tel. : 03/ Fax : 03/ portaels@itg.

Transcriptie

1 Referentielaboratorium - Antwerpen Coördinaten van het Referentielaboratorium Dr. F. PORTAELS I.T.G. - Mycobacteriologie ationalestraat, Antwerpen Tel. : 3/ Fax : 3/ portaels@itg.be Onderstaande gegevens tonen het activiteitenverslag van het referentielaboratorium in Antwerpen (I.T.G - Antwerpen). Inleiding De volgende analyses werden uitgevoerd : op klinische monsters : microscopisch onderzoek kweek op vaste voedingsbodems (Löwenstein-Jensen, Ogawa en Stonebrink) identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op species niveau met behulp van moleculaire identificatie (sequentiebepaling 16S rra gen) PCR-analyses : deze analyses laten toe de aanwezigheid van mycobacteriën vast te stellen, en het Mycobacterium tuberculosis complex te identificeren op basis van het 16S rra gen eventueel gevoeligheidsbepaling aan rifampicine van de gedetecteerde mycobacteriën met behulp van PCR en sequencing van het rpob gen. op positieve kweken : identificatie van de gedetecteerde mycobacteriën tot op species niveau met behulp van moleculaire identificatie (sequentiebepaling 16S rra gen) eventueel gevoeligheidsbepaling van de gedetecteerde mycobacteriën. Dit gebeurde via de MGIT-SIRE kit in het BACTEC-MGIT96 toestel voor de eerstelijns middelen (streptomycine, isoniazide, rifampicine en ethambutol). via de proportiemethode op 7H11 agar voor volgende tweedelijns middelen (enkel voor MDR-TB) : ofloxacine (4 µg/ml), kanamycine (6 µg/ml), ethionamide (1 µg/ml) en capreomycine (1 µg/ml). aantal monsters ontvangen voor analyse Tabel 1 : : totaal aantal monsters ontvangen voor analyse (; 22-25, 27) klinische monsters kweken myco_a_t1 Geografische oorsprong: Het merendeel van de klinisch monsters was afkomstig van consultaties binnen het Instituut voor Tropische Geneeskunde, terwijl de positieve culturen voornamelijk werden toegestuurd vanuit 21 verschillende laboratoria verspreid over Vlaanderen. Ongeveer de helft hiervan was afkomstig van 4 laboratoria (AZ Zottegem; Damiaan Oostende; H. Hart Eeklo; UZA). Een aantal monsters werden gestuurd voor DA typering, terwijl de meerderheid gestuurd werd voor een eerste analyse (diagnose of gevoeligheidsbepaling en identificatie). Voor sommige patiënten werd meer dan één monster ontvangen. In tabellen 2-6 wordt een verdeling weergegeven van het totaal aantal monsters volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat. Tabel 2 : : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 22 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat 22 Kweken Klinische monsters egatief Uitgezonderd Kwaliteitscontrole DA-fingerprinting myco_a_t2 1

2 Referentielaboratorium - Antwerpen Tabel 3 : : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 23 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat 23 Kweken Klinische monsters Eerste analyse egatief Uitgezonderd Subtotaal Confirmatie Kwaliteitscontrole DA-fingerprinting myco_a_t3 Tabel 4 : : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 24 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat 24 Kweken Klinische monsters Eerste analyse egatief Uitgezonderd Subtotaal Confirmatie Kwaliteitscontrole DA-fingerprinting myco_a_t4 Tabel 5 : : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 25 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat Kweken Klinische monsters 25 Verschillende Verschillende patiënten patiënten Eerste analyse egatief Uitgezonderd Subtotaal Confirmatie Kwaliteitscontrole DA-fingerprinting myco_a_t5 Tabel 6 : : totaal aantal stalen voor analyse verstuurd naar Instituut voor Tropische Geneeskunde, Antwerpen in 27 gerangschikt volgens de aard van de analyse en het bekomen resultaat Kweken Klinische monsters 27 Verschillende Verschillende patiënten patiënten Eerste analyse egatief Uitgezonderd Subtotaal Confirmatie Kwaliteitscontrole DA-fingerprinting myco_a_t6 De 326 klinische monsters waren afkomstig van 297 verschillende patiënten; 9 monsters (van 9 verschillende patiënten) werden positief in cultuur (3 M. tuberculsos-complex of MTBc en 3, 2 en 1 M. chelonae) Van de 12 toegestuurde isolaten waren er 93 bedoeld voor een eerste diagnose. Deze laatste waren afkomstig van 81 verschillende patiënten. Van deze laatste werden 57 isolaten geïdentificeerd als mycobacteriën (37 MTBc en 2 niet-tuberculeuze mycobacteriën of ). Het aandeel gecontamineerde kweken of kweken waarin geen 2

3 Referentielaboratorium - Antwerpen mycobacteriën werden teruggevonden, die werden toegestuurd nam toe tegenover de voorbije jaren: 5,8% (6/13) in 24, 14,9% (28/187) in 25, 15 % (14/93) in 26 en 2% in 27 (2/12). Identificatie van de positieve monsters in 27 In tabel 7 wordt een overzicht gegeven van de geïdentificeerde monsters. Het gaat hier enkel om Mycobacterium species isolaten voor een eerste identificatie die werden toegestuurd uit perifere laboratoria of geïsoleerd werden uit klinische monsters in het referentielaboratorium. Isolaten toegestuurd voor kwaliteitscontrole van de identificatie werden niet meegerekend. Per patiënt werd slechts 1 isolaat in meegeteld. Het merendeel (61%) van de gekarakteriseerde isolaten behoren tot het MTBc, gevolgd door M. avium (8/81 of 9,8%) en (4/81 of 4,9%). Tabel 7 : geïdentificeerd in klinische monsters en toegestuurde kweken in 27, gerangschikt per oorsprong en identificatie. Monsters voor kwaliteitscontrole en DA-fingerprinting werden niet ingesloten. Per patiënt werd slechts één monster meegerekend. aantal patiënten iet-mycobacterien egatief M marinum M. avium Klinische Bronchiale aspiratie monsters Expectoratie Etter Faeces 2 2 Huidbiopt Urine Andere 7 7 Subtotaal Kweken Bronchiale aspiratie Expectoratie Huidbiopt 1 1 Orgaanbiopt Pleuravocht 3 3 Urine Andere Onbepaalde oorsrong Subtotaal myco_a_t7 3

4 Referentielaboratorium - Antwerpen In figuren 1-8 wordt een evolutie weergegeven van het totaal aantal geïdentificeerde mycobacteriën van Belgische oorsprong in het referentielaboratorium over de laatste 8 jaar. Daarbij zien we dat de verhouding van tegenover complex vrij constant blijft. Figuur 1 : geïdentificeerd in % 41% 2 -complex Figuur 2 : geïdentificeerd in % 28% 21 -complex Figuur 3 : geïdentificeerd in % 57% complex

5 Referentielaboratorium - Antwerpen Figuur 4 : geïdentificeerd in % 27% 23 -complex Figuur 5 : geïdentificeerd in % 33% 24 -complex Figuur 6 : geïdentificeerd in % 57% complex

6 Referentielaboratorium - Antwerpen Figuur 7 : geïdentificeerd in % 44% 26 -complex Figuur 8 : geïdentificeerd in % 39% 27 -complex

7 Referentielaboratorium - Antwerpen Gevoeligheidstest 1. In 27 werd -complex geïdentificeerd bij 37 verschillende patiënten. Een volledige gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 36 isolaten, terwijl voor 1 cultuur enkel de snelle moleculaire test voor de detectie van resistentie aan rifampicine werd uitgevoerd. Aantal patiënten gevoelig voor H (isoniazide), R (rifampicine) en E (ethambutol) en S (streptomycine) : 24 mono-resistent tegen H : 1 mono-resistent tegen S: 6 resistant tegen H en S : 3 Multi-resistent (MDRTB, tegen minstens R en H) : 2 Eén MDRTB patiënt bleek gevoelig aan alle geteste tweedelijns middelen, terwijl de andere resistentie vertoonde aan kanamycine en capreomycine. Tabel 8 : : evolutie van de gevoeligheid (; 22-27) gevoelig voor H, R, E en S H, R en E mono-resistent tegen E 1 H S resistant tegen H en S 3 H, E en S 1 multi-resistent HR HS 1 HRE HRES 1 MDRTB, tegen minstens R en H 2 isolaten H (isoniazide), R (rifampicine), E (ethambutol), S (streptomycine) 2. Atypische of niet-tuberculeuze mycobacteriën () Er werden geen gevoeligheidsbepalingen voor uitgevoerd in 27. Diagnose per moleculaire biologie op klinische monsters myco_a_t8 In 27 zagen we een stabilisatie van de aanvragen voor opsporing van mycobacteriën of -complex door PCR in klinische monsters. Vijfendertig procent (6/17) van de onderzochte monsters was positief. Details staan weergegeven in tabel 9. Tabel 9 : : detectie van mycobacterieel DA in klinische monsters ontvangen (; 27) PCR (16S rda gen) 1 Rifampicine resistentie bepaling (rpob gen) met sequencing Monster Aantal egatief MTBc Sputum Biopsie Etter Pleuraocht 2 2 Andere iet-gecommercialiseerde testen vervaardigd in het Laboratorium van Mycobacteriologie van het ITG myco_a_t8 7

8 Referentielaboratorium - Brussel Gegevens van het referentielaboratorium Dr. Ap. M. DUFAUX WIV - Dpt Pasteur Engelandstraat Brussel Tel. : 2/ Fax : 2/ Mfauville@pasteur.be Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en. Inleiding De volgende analysen werden uitgevoerd : op DA-extract identificatie opsporing van genmutaties geassocieerd met antibioticaresistentie op positieve culturen identificatie, door moleculaire biologie (specifieke PCR van verschillende mycobacteriële species, amplificatie van een fragment van het gen coderend voor 16S rra of voor hsp65, gevolgd door een sequentieanalyse, Inno-Lipa- Mycobacteriatest, PCR aan de hand waarvan het complex kan worden ontleed) gevoeligheidstest voor - in Bactec MGIT 96 of in Bactec 46TB (vloeibare voedingsbodems) voor de eerstelijnstuberculostatica, met name isoniazide (I), rifampicine (R), ethambutol (E). Pyrazinamide (PZA) werd niet getest omdat het resultaat van de invitrotest niet overeenstemt met de activiteit van de in-vivo-pza - door de methode Bactec 46TB voor bepaalde tweedelijnsantituberculostatica - door de test Inno-Lipa-Rif-TB of door een sequentieanalyse van een regio van 81 pb van het gen rpob om de resistentie tegen rifampicine na te gaan - door PCR om de mutatie S315T in het gen katg en de mutatie C-15T op te sporen in de regio die bevorderlijk is voor gen inha om de resistentie tegen isoniazide na te gaan gevoeligheidstests op atypische mycobacteriën, alleen wanneer het klinische geval dit rechtvaardigt (proportiemethode van Canetti in vaste voedingsbodem) genotypering van, in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica, in geval van een vermoeden van een epidemie of laboratoriumbesmetting of op uitdrukkelijk verzoek (technieken : spoligotyping, MIRU-VTR op 12 of 22 loci en RFLP op IS611) Stalen ontvangen voor analyse in 27 Aantal : culturen voor identificatie 31 culturen voor kwaliteitscontrole 28 culturen voor genotypering 135 DA-extracten van klinische stalen 3 DA-extracten van runderen (CERVA) voor genotypering door MIRU-VTR 13 klinische stalen, per vergissing (worden niet meer voor analyse aanvaard sinds maart 26) Geografische oorsprong : zij waren afkomstig van 11 verschillende laboratoria, verspreid over Brussel, Wallonië en Vlaanderen Tabel 1 : : stalen ontvangen voor analyse (; 2-27) klinische monsters * 148 kweken * niet meer aangevaard voor analyse sinds maart 26 myco_b_t1 1

9 Referentielaboratorium - Brussel Geïdentificeerde mycobacteriën van klinische oorsprong Aantal : 125 [427 (41,7%) complexen en 598 (58,3%) atypische mycobacteriën of ]. De verschillende mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en kweken worden in tabel 3 vermeld. Het detail van de identificaties per type klinisch staal wordt in de tabellen 4 en 5 weergegeven. In tabel 6 staan de verschillende mycobacteriële species die sinds 1998 jaarlijks worden geïdentificeerd. Opmerkelijk is het feit dat 24 (19%) van de 1265 culturen opgestuurd ter identificatie geen mycobacteriën bevatten. Gevoeligheidstests 1. In 27 werd (complex) geïdentificeerd in 427 klinische stalen van 412 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest is uitgevoerd voor 376 patiënten (op 1 klinisch isolaat voor 332 patiënten en op 2 of 3 isolaten voor 44 van hen). Het antibiogram is niet uitgevoerd op de stammen verstuurd voor genotypering, noch op besmette culturen, noch wanneer de stam was geïsoleerd in een laboratorium dat zelf de gevoeligheidstests uitvoerde (tabel 2). Tabel 2 : : gevoeligheidstests (, %; 21-27) % % % % % % % gevoelig voor I, R en E , , , , , , ,9 alleen resistent tegen E 1,3 1,3 alleen resistent tegen I 9 3, 35 1,7 22 8,7 26 8, 21 6,1 32 9,5 23 6,1 alleen resistent tegen R 1,3 2,8 1,3, 2,6 1,3 resistent tegen I + E 4 1,2 7 1,9 multiresistent (I+R) 1,3 3,9 2,8 7 2,1 4 1,1 multiresistent (I+R+E) 9 3, 12 3,7 7 2,8 14 4,3 11 3,2 13 3,8 18 4,8 35 1, 326 1, 252 1, 326 1, 343 1, 338 1, 376 1, I : isoniazide, R : rifampicine, E : ethambutol myco_b_t2 Onder de multiresistente stammen stellen we 1 vast (patiënt in 26 al bekend als monoresistent tegen isoniazide) en 12 stammen (55%) behorend tot de familie Beijing. Een mutatie in rpob is aangetroffen in alle isolaten resistent tegen rifampicine (mutatie S531L in 73% van de gevallen). Een mutatie in katg of inha is aangetroffen in 91% van de MDRisolaten (katg in 73%; katg + inha in 18%; alleen inha in 4,5% = 1 stam). Onder de isolaten monoresistent tegen isoniazide (of resistent tegen isoniazide en ethambutol) is de mutatie S315T in katg aangetroffen in 67% van de isolaten, de mutatie -C15T in inha in 7% van de isolaten. De resterende 27% isolaten hadden de gezochte mutatie in deze 2 genen niet. 2. Atypische mycobacteriën of De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 165 patiënten (171 isolaten) besmet met de volgende mycobacteriën : 87 M. avium-intracellulare, 3, 24, 7 M. malmoense, 5, 3, 2 en 7 andere atypische mycobacteriën. Analyse van DA geëxtraheerd uit klinische stalen Wij hebben 135 DA (geëxtraheerd in het laboratorium dat het staal had gekregen) ontvangen ter identificatie en/of opsporing van mutatie in het gen rpob. De opsporing van een mutatie in het gen rpob van DA van het M. tuberculosiscomplex is een sneltest voor de opsporing van de resistentie van de stam tegen rifampicine, wat multiresistentie (resistentie tegen rifampicine + isoniazide) suggereert. Van de 135 DA zijn er 118 afkomstig van een laboratorium voor anatoompathologie, 123 waren geëxtraheerd uit een biopsie of klieren en 12 uit respiratoire stalen (tabel 5). Van de 12 extracten van respiratoire oorsprong bevatten er 3 DA van (met mutatie in rpob) en 6 bevatten DA van een atypische mycobacterie. Onder de extracten van extrarespiratoire stalen bevatte 94% geen mycobacterieel DA en slechts 1 is geïdentificeerd als complex (tabel 5). 2

10 Referentielaboratorium - Brussel Genotypering van de tuberculosebacillen In ons laboratorium worden drie genotyperingstechnieken op basis van verschillende merkers gebruikt om de genetische afdruk van de tuberculosebacillen te bepalen : spoligotyping, MIRU-VTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable umber Tandem Repeat) en zo nodig IS611-RFLP om clusters van stammen met een identiek profiel bij de twee andere technieken te kunnen onderscheiden. Genotypering biedt de gelegenheid om de overdrachtswegen van de tuberculose na te gaan (bevestiging van intrafamiliale besmetting of besmetting onder buren, micro-epidemies, opsporing van kruisbesmettingen in laboratoria tussen twee stalen die tezelfdertijd worden behandeld). Dankzij de techniek kan ook humane tuberculose ten gevolge van worden onderscheiden van klassieke tuberculose ten gevolge van M. tuberculosis. Genotypering wordt toegepast op alle klinische isolaten resistent tegen isoniazide, op alle multiresistente isolaten en op verzoek ook in geval van een vermoeden van een epidemie of besmetting. Genotypering heeft ons onder meer in de gelegenheid gesteld om personen die aanvankelijk werden beschouwd als patiënten lijdend aan multiresistente tuberculose uit te sluiten van de behandeling omdat het eigenlijk om een kruisbesmetting in een laboratorium ging. In 27 heeft Caroline Allix, die de techniek MIRU-VTR in ons laboratorium heeft ontwikkeld, haar doctoraalscriptie Génotypage et phylogénie du complexe verdedigd en verschillende wetenschappelijke artikelen gepubliceerd over de techniek en de moleculaire epidemiologie van tuberculose in Brussel. Opmerkingen De nationale gegevens over het aantal gevallen van tuberculose in België en het aantal multiresistente patiënten worden verzameld en verspreid door FARES-VRGT. Het aantal gevallen van tuberculose resistent tegen isoniazide en van multiresistente tuberculose geregistreerd in ons laboratorium is vergelijkbaar met de percentages vastgesteld in 26. Van de 1265 kweken verstuurd voor identificatie bevatten er 24 (19%) geen mycobacteriën (besmette culturen of vals positieven), 199 (83%) ervan waren afkomstig van de MB/BacT kweekautomaat gebruikt door bepaalde laboratoria. et zoals in 26 heeft het toestel heel wat vals positieven afgeleverd. Deze situatie heeft tot veel nodeloos werk geleid omdat de identificatie van een negatieve cultuur meer werk vergt (om er zeker van te zijn dat zij echt geen mycobacteriën bevat) dan de identificatie van een zuiver mycobacteriële kweek. De meest geïsoleerde species van waren net zoals voorgaande jaren en (niet pathogeen). Wij stellen een aanzienlijke toename vast van het aantal M.avium en (32% van de atypische mycobacteriën geïdentificeerd in 27, 22% in 26) (tabel 6). Wat de betreft weten wij niet hoeveel onder hen werkelijk aan de oorsprong liggen van een ziekte omdat wij niet over klinische gegevens van de patiënten beschikken. 3

11 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 3 : : identificatie van culturen uit klinische monsters (; 27) TUBCPX 416 BK 5 Pathogeen 3 M. BCG 3 TUBCPX 427 M. avium 117 M. bohemicum 2 3 Cpx -abscessus 21 Cpx - peregrinum 17 M. genavense M. haemophilum 2 M. heckeshornense 2 5 Potentieel pathogeen M. intermedium M. lentiflavum 11 M. malmoense 9 8 M. paraffinicum (scrofulacium) M. agri 1 M. holsaticum 1 iet pathogeen 6 Cpx terrae 7 Andere mycobacteriën egatieve 24 Culturen voor kwaliteitscontrole 31 Culturen voor genotypering 28 DA-extracten van klinische stalen 135 DA-extracten van runderen (CERVA) voor genotypering door RFLP 3 Klinische monsters myco_b_t

12 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 4 : : species geïdentificeerd vertrekkende van kweekbodems (; 27) Kweken Cpx Tuberculosis BK BCG M. avium M. bohemicum Cpx -abscessus Cpx -peregrinum M. genavense M. haemophilum M. heckeshornense M. intermedium M. lentiflavum M. malmoense M. paraffinicum (scrofulacium) M. agri M. holsaticum Cpx terrae Autres bactéries Cultures négatives (faux positifs) ou contaminées Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Pleuraalvocht Peric. periton. vocht 2 2 Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht Biopsieën organen Huidbiopsieën of pees Klierbiopsieën Etter Abces Urine Anderen Onbepaald myco_b_t4 Tabel 5 : : DA voor analyse verstuurd : 135 waarvan 118 afkomstig van een laboratorium voor anatoompathologie (, %; 27) Aanwezigheid Aanwezigheid egatief van DA van het van DA van complex mycobacteriën % % % % Respiratoire 3 * 25, 6 5, 3 25, 12 1, Biopsie/klier 1,8 6 4, , , * De 3 DA vertoonden een mutatie in het gen rpob, wat resistentie tegen rifampicine suggereert. myco_b_t5 Uit de cultuur van deze stalen bleek achteraf dat het multiresistente stalen waren. 5

13 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 6 : : mycobacteriële species van klinische oorsprong (; ) Cpx Cpx Mengeling M. tub. M. avium 3 2 Mengeling M. tub. M. fort. 1 Mengeling M. tub Mengeling M. tub. 1 Mengeling M. tub. 2 Mengeling M. tub. M. lentiflavum 1 1 Mengeling M. tub. 1 Mengeling M. tub. + atypique M. africanum BCG Mengeling BCG + 1 Opportunistische M. avium atypische M. Intracellulare M. bohemicum Cpx abscessus-chelonae-fortuitum Cpx -abscessus Cpx -peregrinum M. genavense 2 1 M. haemophilum M. heckeshornense 2 2 M. immunogen M. intermedium Mengeling M. kans. M. avium 1 Mengeling M. kans. M. gord. 1 M. lentiflavum M. malmoense M. novocastrense 2 2 M. paraffinicum Mengeling M. scrof. M. gord. 1 M. senegalense 1 1 M. shimoidei M. szulgaï Mengeling M. xen. M. gord iet of M. agri zeer zelden M. alvei pathogeen M. anthracenicum M. branderi 2 M. duvalli 1 1 M. elephantis 1 M. gadium 1 1 M. gilvum M. hiberniae M. holsaticum 1 1 M. negraskense 1 M. neoaurum M. phlei M. ratisbonense M. sphagni Cpx terrae-mucogenicum-ratisbonense 7 3 M. triplex 1 1 M. triviale 1 Andere bacteriën myco_b_t6 6