Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid

Transcriptie

1 Externe kwaliteitsevaluatie in Microbiologie 2016 Identificatie van Mycobacteriën Gevoeligheidsbepaling van Mycobacterium tuberculosis complex isoniazide (INH), rifampicine (RMP), ethambutol (EMB) en facultatief pyrazinamide (PZA). Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid 1. Deelnemers Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis, AALST ZNA, Campus Stuivenberg, ANTWERPEN Instituut voor Tropische Geneeskunde, ANTWERPEN UZ-VUB, BRUSSEL CHU St-Pierre, BRUXELLES CHU Erasme, ULB, BRUXELLES Cliniques Universitaires Saint-Luc, UCL, BRUXELLES Tuberculose & Mycobacteriën, OD Overdraagbare en besmettelijke ziekten, WIV, BRUSSEL CHU de Charleroi, CHARLEROI Ch Jolimont-Lobbes, site Jolimont, HAINE-SAINT-PAUL UZ Gasthuisberg, LEUVEN CHR de la Citadelle, LIEGE CHU Sart-Tilman, LIEGE Laboratoire Nationale de Santé, LUXEMBOURG, Grand Duché de Luxembourg Cliniques UCL de Mont-Godinne, YVOIR 2. Stalen Pakketten van 5 tubes, genummerd van 1 tot en met 5, werden naar de deelnemers verstuurd op 12 september Het betrof culturen van 4 verschillende stammen van het Mycobacterium tuberculosis complex, die gevoelig of resistent waren aan de te testen antibiotica en 1 atypische mycobacterie (M. avium). Alle stammen werden verstuurd in MGIT 7H9 milieu. De stalen werden voorbereid door het laboratorium Tuberculose en Mycobacteriën van het WIV (Dr. Vanessa Mathys) (selectie van de stammen, kweek, verdeling in tubes) en vervolgens naar de deelnemers verzonden door de afdeling Kwaliteit van Medische Laboratoria van het WIV (Dr. Kris Vernelen). Nadien bleek dat staal 2 tijdens de productie/aliquotering bijbesmet werd met een atypische mycobacterie. De resultaten van dit staal worden dus niet geëvalueerd. In hoofdstuk 5 Analyse van staal 2 worden deze resultaten besproken. Rapport EKE Mycobacteriën

2 Kenmerken van de stammen Stam Opmerking Resistentie profiel of identificatiemetho de in het referentielabo I-R-E-Z 1 Mycobacterium tuberculosis 2 Mycobacterium tuberculosis 3 Mycobacterium avium 4 Mycobacterium tuberculosis 5 Mycobacterium tuberculosis Bijbesmet met Mycobacterium chimaera Isoniazide mutatie (I) Rifampicine Mutatie (R) S-R-S-S - RpoB S531L Niet geëvalueerd S-S-S-S R-S-S-S - - KatG S315T - Rapport EKE Mycobacteriën

3 3. Resultaten Aantal deelnemers: 15 Eerste resultaat ontvangen na 25 dagen. Laatste resultaat ontvangen na 78 dagen. Gebruikte methoden voor identificatie: - 4 laboratoria gebruikten enkel moleculaire technieken (2 laboratoria vermeldden 1 techniek, 1 vermeldde 2 technieken en 1 vermeldde 3 technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van drie moleculaire technieken, een chromatografische techniek en de Malditof biotyper - 4 laboratoria gebruikten een combinatie van moleculaire technieken en een chromatografische techniek (1 laboratorium gebruikte 1 moleculaire techniek en 3 laboratoria 2 moleculaire technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van twee moleculaire technieken en biochemische technieken - 1 laboratorium gebruikte een chromatografische techniek en de Malditof biotyper - 2 laboratoria gebruikten de combinatie van biochemische technieken, een chromatografische techniek en de Malditof biotyper - 2 laboratoria gebruikten enkel een chromatografische techniek Moleculaire methoden: - Inno-Lipa Mycobacteria: 2 deelnemers - GenProbe Sonde: 1 deelnemer - GenoType Mycobacterium (Hain): 1 deelnemer - In house PCR (target 16S rdna): 1 deelnemer - In house PCR (target IS6110): 2 deelnemers (1 van beide vermeldt deze techniek enkel voor Mycobacterium tuberculosis te gebruiken) - In house PCR (target 16S 23S rdna): 1 deelnemer - In house PCR (target RD ): 1 deelnemer - In house PCR (target rpo B 491, Kat G 315, InhAIS): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S rdna): 3 deelnemers - Sequencing (target hsp 65): 1 deelnemer - Sequencing (target rpob-rif en rpob-id, katg, inha): 1 deelnemer - Gene Xpert: 2 deelnemers - Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder): 1 deelnemer - Seegene Anyplex MTB/NTM: 1 deelnemer Chromatografische methoden: - MGIT TBC Identification test (Becton Dickinson): 8 deelnemers - Bioline TB Ag MPT64 (Standard Diagnostics): 2 deelnemers De uitgevoerde biochemische testen bestonden uit: productie van niacine, nitraatreductie, reductie van K-telluriet en PZA. Rapport EKE Mycobacteriën

4 Gebruikte methoden voor bepaling van antibiogram Voor de bepaling van de gevoeligheid van INH, RMP en EMB gebruikten alle laboratoria de Bactec MGIT Negen laboratoria hebben de gevoeligheid voor pyrazinamide bepaald; ze hebben 2 types van methoden gebruikt: - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - bepaling van pyrazinamide-activiteit met Rosco-tablet Gedetailleerde bespreking van de resultaten: 1) Identificaties Het overzicht van de antwoorden worden hieronder weergegeven. De correcte of aanvaardbare resultaten zijn onderlijnd Tabel 4 geeft de identificatietechnieken, gebruikt door de laboratoria, en de geantwoorde identificaties weer. Staal 1: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 10 (66.7%) M. tuberculosis 5 (33.3%) Staal 3: M. avium M. avium 7 (46.7%) M. avium variant I 1 (6.7%) M. avium complex 2 (13.3%) M. avium complex (M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum) 1 (6.7%) M. avium paratuberculosis complex 1 (6.7%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 3 (20.0%) Staal 4: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 10 (66.7%) M. tuberculosis 5 (33.3%) Staal 5: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 10 (66.7%) M. tuberculosis 5 (33.3%) Rapport EKE Mycobacteriën

5 Antibiogrammen a) Tabel 1 geeft het aantal uitgevoerde testen weer per methode, evenals het aantal testen dat volledig overeenstemmende resultaten opleverde met de resultaten van het laboratorium, dat de stammen selecteerde (Tuberculose & Mycobacteriën, DG Overdraagbare en besmettelijke ziekten van het WIV). We stellen vast voor isoniazide, rifampicine en ethambutol dat alle testen uitgevoerd werden in een vloeibaar medium met een geautomatiseerde methode, met name de Bactec MGIT techniek. 12 van de 15 bepalingen (80%) leverden resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Zowel voor isoniazide, rifampicine als ethambutol was er telkens één laboratorium dat een resultaat R bekwam waar S verwacht werd (respectievelijk voor de stammen 1 5 en 5). Voor pyrazinamide (rechter deel van de tabel) leverden 21 van de 27 bepalingen resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Eén laboratorium bekwam het resultaat R waar S verwacht werd voor stam 1, één laboratorium bekwam R waar S verwacht werd voor stammen 1 en 4 en één laboratorium bekwam R waar S verwacht werd voor stammen 1, 4 en 5. Alle afwijkende resultaten werden bekomen met de Bactec MGIT techniek (gebruikt door 8 van de 9 laboratoria). b) Tabel 2a geeft de gedetailleerde resultaten weer per laboratorium (aangeduid door een letter). De gebruikte methode, de eindconcentratie van elk antibioticum per ml milieu et het volume van het inoculum worden eveneens weergegeven. Voor elk laboratorium werd voor elk antibioticum het percentage resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum berekend. Zoals reeds hoger vermeld werd er voor elk van de drie antibiotica door telkens een ander laboratorium een foutief resultaat ingeleverd. Tabel 2b geeft dezelfde gegevens weer voor pyrazinamide. Zoals hoger vermeld bekwam één laboratorium 1 afwijkend resultaat, één laboratorium 2 en één laboratorium 3 afwijkende resultaten. Commentaar Twee van de 15 gebruikers van de Bactec MGIT techniek, hebben niet vermeld welke antibioticadoses zij gebruikt hebben. Van de 13 anderen, gebruiken 12 de concentraties die BD voorschrijft en gebruiken 4 de 2 voorgeschreven dosissen van isoniazide Voor de gevoeligheidsbepaling voor pyrazinamide, hebben 6 van de 8 gebruikers van de Bactec MGIT de door BD voorgeschreven dosissen gebruikt; twee laboratoria hebben de dosis niet vermeld. c) Tabel 3 geeft de samenvatting weer van de resultaten van de testen, die op elk der 3 stalen uitgevoerd werden. Het aantal evalueerbare resultaten bedroeg 45 voor isoniazide, rifampicine en ethambutol en 27 voor pyrazinamide. Het percentage correcte resultaten (in vergelijking met deze van het referentiecentrum voor het geheel der testen, per antibioticum bedraagt 97.7% voor isoniazide, rifampicine en ethambutol en 77.8% voor pyrazinamide. Rapport EKE Mycobacteriën

6 Voor elk antibioticum werd eveneens de gevoeligheid en de specificiteit van een resultaat voor resistentie berekend (ten opzichte van het resultaat van het referentiecentrum) en de voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat. 4. Bespreking A. Identificatie van Mycobacteriën. Er waren geen incorrecte resultaten. Mycobacterium tuberculosis complex. We veronderstellen dat de laboratoria die naast de moleculaire ook biochemische testen gebruikt hebben, het onderscheid tussen M. tuberculosis en M. bovis kunnen maken. Het laboratorium dat M. tuberculosis geantwoord heeft bij gebruik van de methode SD TB Ag MPT64 had om exacter te zijn M. tuberculosis complex moeten antwoorden aangezien deze methode niet toelaat een onderscheid te maken binnen het complex. Mycobacterium avium complex Alle resultaten zijn concordant met de gebruikte technieken. B. Gevoeligheidstesten De resultaten zijn goed voor INH, RIF en EMB. Wat betreft PZA, werden 6 discordante resultaten op 27 vastgesteld voor de stammen 1, 4 en 5 (in de 6 gevallen «R» in plaats van «S»). De concordantie (77.8%) die voor PZA bekomen werd is duidelijk lager dan deze die voor de QC2015 bekomen werd(100%). Rapport EKE Mycobacteriën

7 5. Analyse van staal 2 Zoals reeds hoger gemeld werd staal 2 tijdens de productie/aliquotering bijbesmet met een atypische mycobacterie. Hieronder vindt u een overzicht van de resultaten die voor dit staal bekomen werden maar niet in rekening gebracht voor de globale evaluatie van de EKE Identificaties M. tuberculosis 4 (26.7%) M. tuberculosis complex 6 (40.0%) M. tuberculosis + M. chimaera/intracellulare complex 1 (6.7%) M. tuberculosis complex + M. chimaera 2 (13.3%) M. tuberculosis complex + M. chimaera/intracellulare complex 1 (6.7%) M. tuberculosis complex + M. intracellulare (sequevar Mac-1) 1 (6.7%) Alle deelnemende laboratoria hebben de aanwezigheid van M. tuberculosis in staal aangetoond2. De bijkomende aanwezigheid van een atypische (non-tuberculosis) mycobacterie werd gerapporteerd door 1/3 van de laboratoria (5/15). De correcte (en precieze) identificatie van M. chimaera werd gerapporteerd door 2 laboratoria. De 5 laboratoria die een mengsel van twee mycobacteriën (M. tuberculosis en M.intracellulare/chimaera) gerapporteerd hebben, hebben deze voornamelijk op 2 wijzen geïdentificeerd : Enting op een vaste bodem (Middlebrook 7H10) die toelaat 2 types van kolonies vast te stellen (die elk afzonderlijk geanalyseerd werden) (2 laboratoria) of door selectie van de M. chimaera door enting op een Lowenstein-bodem die PNB (Para-nitrobenzoic acid) bevat dat de groei van M. tuberculosis complex inhibeert maar niet deze van de atypische mycobacteriën (1 laboratorium). Deze enting op vaste bodem werd spontaan uitgevoerd door 1 van de laboratoria (gebruikelijke workflow voor de kwaliteitscontrole), ten gevolge van het vaststellen van een ongewoon resistentieprofiel op het antibiogram (1 laboratorium) of ten gevolge van het vaststellen van een discordantie tussen de resultaten van het antibiogram en deze van de Genexpert (1 laboratorium). Het uitvoeren van een moleculaire test van het type Line Probe Assay (INNOLiPA of GenoType) die een bandpatroon (hybridaties) aantoonde dat incompatibel is met één enkel mycobacterieel species en dat de simultane detectie van M. tuberculosis complex en M. intracellulare/chimaera toelaat (2 laboratoria) Rapport EKE Mycobacteriën

8 Antibiogrammen Onderstaande tabel geeft een overzicht van de resultaten die geantwoord werden voor het antibiogram van staal 2 en de opmerkingen die de laboratoria hierbij gegeven hebben. Labo INH RMP EMB PZA A R S R R B R R R C R R R R Gevoeligheidstesten cultuur 2: vloeistof in tubes troebel. Nadien werd cultuur geïdentificeerd als mengsel, resultaten gevoeligheidstesten zouden in dit geval niet als dusdanig gerapporteerd worden. D R S R S E R R R R F S S S S Stam 2: 2 mycobacteriën: antibiogram uitgevoerd op geïsoleerde TBC G R S R R H R R R I S S S S J R R R K R R R L R S R M /// /// /// /// N R R R R O S S ///* Buis 2: bij uitplating van stam 2 werden er twee mycobacteriën teruggevonden, namelijk MBT en MB chimaera/intracellulare complex. Bij herhaaldelijk uitplaten van de oorspronkelijke buis bekwamen we steeds dezelfde 2 MB Stam 2 vertoont een discordant resultaat tussen de moleculaire testen (Rifampicine S) en de klassieke gevoeligheidstesten (Rifampicine R). Dit maakt dat ook de andere gevoeligheidstesten (INH en ETM) niet betrouwbaar kunnen zijn omdat contaminatie met een atypische mycobacterie niet uitgesloten kan worden. De PCR die uitgevoerd werden voor de identificatie tonen de aanwezigheid van M. tuberculosis complex en van M. intracellulare. Bijgevolg werd het antibiogram van de M. tuberculosis niet uitgevoerd (noodzaak van een reincultuur voor het antibiogram). En routine, zouden wij deze stam naar het WIV versturen voor het opsporen van de resistentiegenen tegen antibiotica met PCR Zeer waarschijnlijke besmetting van staal 2 door een mycobacterie die niet tot het M. tuberculosis complex behoort (discordantie met het multi-gevoelige moleculaire antibiogram) Stam 2: mengsel M. tuberculosis complex + M. intracellulare/chimaera door Genotype Mycob. HAIN. M tuberculosis complex Rifamp S Isoniazide S door Genotype Mycob. HAIN Rapport EKE Mycobacteriën

9 6. Besluit De kwaliteitscontrole voor identificatie van mycobacteriën leverde uitstekende resultaten op: de 4 evalueerbare stammen (3 M. tuberculosis en 1 M. avium) werden correct geïdentificeerd door de deelnemende laboratoria (met wisselende identificaties tot op speciesniveau naargelang de gebruikte methoden). De Belgische kwaliteitscontrole 2016 van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor INH, RMP en EMB, uitgevoerd door 15 deelnemers op 3 evalueerbare stalen, leverde goede resultaten op; voor PZA, uitgevoerd door 9 deelnemers, werden een aantal problemen (valse resistenties) vastgesteld. We stelden 97.7% concordante resultaten vast voor INH, RMP en EMB en 77.8% voor PZA. De sensitiviteit was uitstekend voor INH en RMP maar werd niet berekend voor EMB en PZA aangezien de 3 stammen gevoelig waren aan deze antibiotica. De specificiteit voor de vier antibiotica bedroeg respectievelijk 96.7%, 96.7%, 97.7% en 77.8%. De voorspellende waarde van een resistent resultaat bedroeg 93.8% voor INH en RMP maar werd niet berekend voor EMB en PZA aangezien de 3 stammen gevoelig waren aan deze antibiotica. De voorspellende waarde van een gevoelig resultaat bedroeg 100% voor de 4 antibiotica. Rapport EKE Mycobacteriën

10 7. Tabellen Tabel 1 Gebruikte methoden en technische details Methode Aantal testen Aantal testen 100% overeenkomend PZA: Aantal testen PZA: Aantal testen 100% overeenkomend Bactec MGIT Rosco disks Totaal (80 %) 9 6 (66.7%) Tabel 3 Globale resultaten van de gevoeligheidstesten, uitgevoerd op de 3 stalen Stam nummer Isoniazide Rifampicine Ethambutol Pyrazinamide Ref S R Ref S R Ref S R Ref S R 1 S 14 1 R 0 15 S 15 0 S S 15 0 S 15 0 S 15 0 S R 0 15 S 14 1 S 14 1 S 8 1 Concordantie 44/45 = 97.7 % 44/45 = 97.7 % 44/45 = 97.7 % 21/27 = 77.8 % Sensitiviteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam R een resultaat R oplevert 16 R vastgest. /15 R verwacht 16 R vastgest. /15 R verwacht - - Specificiteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam S een resultaat S oplevert 29 S vastgest. /30 S verwacht = 96.7 % 29 S vastgest. /30 S verwacht = 96.7 % 44 S vastgest. /45 S verwacht = 97.7 % 21 S vastgest./27 verwacht = 77.8 % Waarschijnlijkheid dat een stam R is als hij op AB als R gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 15 juiste R vastgest./16 R tot. vastgest. = 93.8 % 15 juiste R vastgest./16 R tot. vastgest. = 93.8 % 0 juiste R vastgest./1 R tot. vastgest. 0 juiste R vastgest./6 R tot. vastgest. Waarschijnlijkheid dat een stam S is als hij op AB als S gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 29 juiste S vastgest./29 S tot. vastgest. = 100 % 29 juiste S vastgest./29 S tot. vastgest. = 100 % 44 juiste S vastgest./44 S tot. vastgest. = 100 % 21 juiste S vastgest./ 21 S tot. vastgest = 100 % Rapport EKE Mycobacteriën

11 Tabel 2a Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Isoniazide Rifampicine Ethambutol Stam Methode Res.Refer. S S R R S S S S S A B C D E R S R R S S S S S Bactec MGIT F S S R R S S S S R Bactec MGIT G H I J K L M S S R R S R S S S Bactec MGIT N O Labo Concordantie INH RMP EMB Inoc. INH RMP EMB µg/ml µg/ml µg/ml ml % % % 100 % Correct Methode A Bactec MGIT 0, B Bactec MGIT , C Bactec MGIT 0, D Bactec MGIT 0.1 en E Bactec MGIT 0.1 en , F Bactec MGIT 0.1 en , G Bactec MGIT 0.1 en , H Bactec MGIT , I Bactec MGIT , J Bactec MGIT K Bactec MGIT , L Bactec MGIT , M Bactec MGIT N Bactec MGIT O Bactec MGIT , Rapport EKE Mycobacteriën

12 Tabel 2b Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor pyrazinamide voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers die de gevoeligheid voor dit antibioticum bepaald hebben RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Pyrazinamide Stam Methode Res.Refer. S S S A S S S Bactec MGIT C R S S Bactec MGIT D S S S Bactec MGIT E S S S Bactec MGIT F R R R Bactec MGIT G S S S Bactec MGIT I S S S Rosco tablet M R R S Bactec MGIT N S S S Bactec MGIT Concordantie PZA Inoc. PZA µg/ml ml % 100 % Correct Labos Methode A Bactec MGIT C Bactec MGIT D Bactec MGIT E Bactec MGIT 100 0,5 100 F Bactec MGIT 100 0,2 0 G Bactec MGIT 100 0,5 100 I Rosco tablet * 100 M Bactec MGIT 100 0, N Bactec MGIT 100 0,5 100 * 900 µg/tablet Rapport EKE Mycobacteriën

13 Tabel 4 Gedetailleerde tabel voor de resultaten van de identificaties Labo Methode Resultaten stammen 1,4 en 5 Resultaat stam 3 A B C In house PCR (target RD ) + Sequencing (target hsp 65) + Seegene Anyplex MTB/NTM Biochemische testen + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper In house PCR (target 16S rdna) + Sequencing (target 16S rdna) + SD TB Ag MPT64 M. tuberculosis M. avium variant I M. tuberculosis M. avium M. tuberculosis complex M. avium D In house PCR (target 16S - 23S rdna) M. tuberculosis complex M. non-tuberculosis E SD TB Ag MPT64 M. tuberculosis M. non-tuberculosis In house PCR (target rpo B 491, Kat G 315, M. tuberculosis complex M. avium InhAIS) + F G H I Sequencing (target rpob-rif et rpob-id, KatG, inha) + Gene Xpert + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper In house PCR (target IS6110) (stalen 1, 4 en 5) + Sequencing (target 16S rdna) + BD MGIT TBC Identification test GenProbe Sonde + Sequencing (target 16S DNA) + Biochemische testen Biochemische testen + MGIT TBC Identification Test + Malditof Biotyper M. tuberculosis complex M. avium M. tuberculosis M. avium complex M. tuberculosis M. avium J In house PCR ((target IS6110) M. tuberculosis complex M. avium complex MGIT TBC Identification Test + M. tuberculosis complex M. avium K Malditof Biotyper L MGIT TBC Identification Test M. tuberculosis complex M. non-tuberculosis Inno-Lipa Mycobacteria + M. tuberculosis complex M. avium complex (M. avium, M Gene Xpert + M. paratuberculosis, M. silvaticum) MGIT TBC Identification Test Inno-Lipa Mycobacteria + M. tuberculosis complex M. M. avium paratuberculosis N Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder) complex GenoType Mycobacterium (Hain) + M. tuberculosis complex M. avium O MGIT TBC Identification Test Rapport EKE Mycobacteriën