1. Deelnemers. 2. Stalen

Transcriptie

1 Externe kwaliteitsevaluatie in Microbiologie 2011 Gevoeligheidsbepaling van Mycobacterium tuberculosis complex isoniazide (INH), rifampicine (RMP), ethambutol (EMB) en facultatief pyrazinamide (PZA). Identificatie van atypische Mycobacteriën Rapport opgesteld door Maryse FAUVILLE-DUFAUX, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid 1. Deelnemers Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis, AALST ZNA, Campus Stuivenberg, ANTWERPEN Instituut voor Tropische Geneeskunde, ANTWERPEN UZ-VUB, BRUSSEL Laboratoire de la Porte de Hal, BRUXELLES CHU Erasme, ULB, BRUXELLES Cliniques Universitaires Saint-Luc, UCL, BRUXELLES Tuberculose & Mycobacteriën, OD Overdraagbare en besmettelijke ziekten vroeger Pasteur Instituut, BRUSSEL CHU de Charleroi, CHARLEROI Ch Jolimont-Lobbes, site Jolimont, HAINE-SAINT-PAUL UZ Gasthuisberg, LEUVEN CHR de la Citadelle, LIEGE CHU Sart-Tilman, LIEGE Laboratoire Nationale de Santé, LUXEMBOURG, Grand Duché de Luxembourg Cliniques UCL de Mont-Godinne, YVOIR 2. Stalen Pakketten van 5 tubes, genummerd van 1 tot en met 5, werden naar de deelnemers verstuurd op 22 augustus Het betrof culturen van 3 verschillende stammen van het Mycobacterium tuberculosis complex, die gevoelig of resistent waren aan de te testen antibiotica en 2 atypische Mycobacteriën (M. interjectum en M. kansasii). Alle stammen werden verstuurd in MGIT 7H9 milieu. De stalen werden voorbereid door het laboratorium Tuberculose en Mycobacteriën (Mevr. Maryse Fauville-Dufaux) (selectie van de stammen, kweek, verdeling in tubes) en vervolgens naar de deelnemers verzonden door de afdeling Klinische Biologie van het WIV (Dr. Vernelen). Rapport EKE Mycobacteriën

2 Kenmerken van de stammen Stam 1 Mycobacterium tuberculosis 2 Mycobacterium interjectum 3 Mycobacterium tuberculosis 4 Mycobacterium tuberculosis 5 Mycobacterium kansasii Resistentie profiel of identificatiemethode in het referentielabo I-R-E-Z Isoniazide mutatie (I) Rifampicine Mutatie (R) 11MY0630 R-R-S-R S315T S531L = S5/R5 (LiPA) 11MY S rdna sequencing 11MY0096 R-R-R-S S315T S531L = S5/R5 (LiPA) 11MY MY S rdna= DNA dat codeert voor 16S rrna S-S-S-S 16S rdna sequencing + specifieke in house PCR Rapport EKE Mycobacteriën

3 3. Resultaten Aantal deelnemers: 15 (identificatie en AB) Eerste resultaat ontvangen na 28 dagen. Laatste resultaat ontvangen na 91 dagen. Gebruikte methoden voor identificatie: - 9 laboratoria gebruikten enkel moleculaire technieken (5 laboratoria vermeldden 1 techniek en 4 vermeldden 2 technieken) - 5 laboratoria gebruikten een combinatie van moleculaire en biochemische technieken (2 gebruikten 1 moleculaire techniek, 2 gebruikten 2 moleculaire technieken en 1 gebruikte 4 moleculaire technieken) - 1 laboratorium gebruikte 3 moleculaire technieken en de Chromatogram Immunoassay: MGIT TBC Identification Test (BD) Moleculaire methoden: - GenProbe Sonde: 5 deelnemers - BD MGIT TBC Identification Test: 1 deelnemer - Pathofinder RT-PCR (Taqman) voor M.tub.complex: 1 deelnemer - SD TB Ag MPT64 Rapid: 1 deelnemer - In house PCR (target 16S rdna): 3 deelnemers - In house PCR (target niet vermeld): 1 deelnemer - In house PCR (target IS6110: M. tbc; CSB: M bovis): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S rdna): 6 deelnemers - Sequencing (target hsp 65): 1 deelnemer - Inno-Lipa Mycobacteria: 4 deelnemers - Inno-Lipa-Rif-TB: 1 deelnemer - GenoType Mycobacterium (Hain): 1 deelnemer De uitgevoerde biochemische testen bestonden uit: productie van niacine, nitraatreductie, hydrolyse van Tween 80, productie van urease op ureum-indol milieu, semi-kwantitatieve katalase, arylsufatase, pyrazinamidase, fotoinductie, groei op 30 C en 42 C, groei op Polyvitex, pigmentvorming (aantal en aard van de gebruikte technieken verschillen naargelang de laboratoria). Gebruikte methoden voor bepaling van antibiogram: 3 types van methoden - 2 methoden die gebruik maken van een vloeibaar medium: Bactec MGIT en BBL MGIT met manuele aflezing - proportionele methode van Canetti op vaste bodem (7H10 aangerijkt met OADC) Negen laboratoria hebben de gevoeligheid voor pyrazinamide bepaald; ze hebben 2 types van methoden gebruikt: - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - proportionele methode van Canetti op vaste bodem (met name 7H10 aangerijkt met OADC) Rapport EKE Mycobacteriën

4 Gedetailleerde bespreking van de resultaten: 1) Identificaties (N = 15) Het overzicht van de antwoorden worden hieronder weergegeven. De correcte of aanvaardbare resultaten zijn onderlijnd Tabel 4 geeft de identificatietechnieken, gebruikt door de laboratoria, en de geantwoorde identificaties weer. Staal 1: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 8 (53.3%) M. tuberculosis 7 (46.7%) Staal 2: M. interjectum M. interjectum 9 (60.0%) Mycobacterium species 1 2 (13.3%) M. gordonae 2 1 (6.7%) Geen groei 3 (20.0%) 1 Eén laboratorium vermeldt dat deze stam naar het referentiecentrum zou doorgestuurd worden voor identificatie via moleculaire sequencing. 2 Dit laboratorium vermeldt wel dat de identificatie niet overeenkomt met het microscopisch uitzicht en de groeisnelheid. Staal 3: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 8 (53.3%) M. tuberculosis 7 (46.7%) Staal 4: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 8 (53.3%) M. tuberculosis 7 (46.7%) Staal 5: M. kansasii M. kansasii 7 (46.7%) M. kansasii groep 1 4 (26.7%) M. kansasii/gastrii 1 (6.7%) Atypische mycobacterie 1 2 (13.3%) M. marinum 1 (6.7%) 1 Dit laboratorium vermeldt dat deze stam in routine naar het WIV zou doorgestuurd worden voor identificatie. Rapport EKE Mycobacteriën

5 2) Antibiogrammen a) Tabel 1 geeft het aantal uitgevoerde testen weer per methode, evenals het aantal testen dat volledig overeenstemmende resultaten opleverde met de resultaten van het laboratorium, dat de stammen selecteerde (Tuberculose & Mycobacteriën, DG Overdraagbare en besmettelijke ziekten van het WIV). We stellen vast dat 93.3% van de testen uitgevoerd werden in een vloeibaar medium en 86.7% met een geautomatiseerde methode. 8 van de 15 bepalingen (53.3%) leverden resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Alle afwijkende resultaten worden vastgesteld met ethambutol voor stam 1: 6 laboratoria vonden deze gevoelige stam resistent en 1 laboratorium bekwam een intermediaire gevoeligheid. De Bactec MGIT techniek wordt het meest gebruikt door de Belgische laboratoria (13 testen op 15) en gaf 53.8 % (7/13) resultaten die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Voor pyrazinamide (rechter deel van de tabel): werden 88.9 % van de testen uitgevoerd in een vloeibaar medium met een geautomatiseerde methode. Voor dit antibioticum leverden 6 van de 9 bepalingen (66.6%) resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Ook voor dit antibioticum is de Bactec MGIT techniek de meest gebruikte door de Belgische laboratoria (8 testen op 9); deze gaf 75.0 % (6/8) resultaten die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum b) Tabel 2a geeft de gedetailleerde resultaten weer per laboratorium (aangeduid door een letter). De gebruikte methode, de eindconcentratie van elk antibioticum per ml milieu et het volume van het inoculum worden eveneens weergegeven. Voor elk laboratorium werd voor elk antibioticum het percentage resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum berekend. Zoals reeds hoger vermeld werden alle afwijkende resultaten vastgesteld voor de bepaling van de gevoeligheid van ethambutol op stam 1: 6 laboratoria antwoordden R en 1 laboratorium I in plaats van S. Voor rifampicine en isoniazide waren de concordanties met het referentiecentrum 100%. Tabel 2b geeft dezelfde gegevens weer voor pyrazinamide. Zoals hoger vermeld waren er 3 afwijkende resultaten voor dit antibioticum (stam 1: 1 resultaat S in plaats van R en stam 4: 2 resultaten R in plaats van S). Commentaar Drie van de 13 gebruikers van de Bactec MGIT techniek, hebben niet vermeld welke antibioticadoses zij gebruikt hebben. Van de 10 anderen, gebruiken allen de concentraties die BD voorschrijft, 1 labo gebruikt de 2 voorgeschreven dosissen van ethambutol en 4 gebruiken de 2 voorgeschreven dosissen van isoniazide Voor de gevoeligheidsbepaling aan pyrazinamide, hebben 5 van de 8 gebruikers van het Bactec MGIT de door BD voorgeschreven dosissen gebruikt; drie laboratoria hebben de dosis niet vermeld. c) Tabel 3 geeft de samenvatting weer van de resultaten van de testen, die op elk der 3 stalen uitgevoerd werden. Het aantal evalueerbare resultaten bedroeg 45 voor isoniazide, rifampicine en ethambutol en 27 voor pyrazinamide. Het percentage correcte resultaten (in vergelijking met Rapport EKE Mycobacteriën

6 deze van het referentiecentrum voor het geheel der testen, per antibioticum bedraagt 100 % voor isoniazide en rifampicine, 84.4 % voor ethambutol en 88.8% voor pyrazinamide. Voor elk antibioticum werd eveneens de gevoeligheid en de specificiteit van een resultaat voor resistentie berekend (ten opzichte van het resultaat van het referentiecentrum), en de positief en negatief predictieve waarde van een resistent resultaat bekomen door een Belgisch laboratorium. 4. Bespreking A. Identificatie van Mycobacteriën. Sommige identificaties zijn incorrect (in het oranje aangeduid in tabel 4) Sommige identificaties die als correct of aanvaardbaar beschouwd werden, misten nauwkeurigheid. Ze zijn in het geel gehighlighted in tabel 4. Het is jammer dat M. interjectum bij 3 laboratoria (in het blauw aangeduid) niet tot groei gebracht kon worden. Mycobacterium tuberculosis complex. We veronderstellen dat de laboratoria die naast de moleculaire ook biochemische testen gebruikt hebben, het onderscheid tussen M. tuberculosis en M. bovis kunnen maken. De PCR CSB gebruikt door labo H laat eveneens toe dit onderscheid te maken. De vraag stelt zich daarentegen of de moleculaire testen uitgevoerd door labo B toelaten het onderscheid te maken tussen de leden van het complex? Zoniet zou de identificatie «M. tuberculosis complex» moeten zijn in plaats van M. tuberculosis. Zo stelt zich eveneens de vraag of de in house PCR gebruikt door laboratorium D toelaat om de leden van het complex van elkaar te onderscheiden? Mycobacterium interjectum M. gordonae is niet correct. Mycobacterium kansasii M. marinum is niet correct. De INNO-LiPA MYCOBACTERIA test laat toe het onderscheid te maken tussen de verschillende groepen van M. kansasii. B. Gevoeligheidstesten De resultaten zijn uitstekend voor isoniazide en rifampicine. Voor éthambutol, leverde stam 1 discordante resultaten onder de deelnemers op : 8 resultaten «gevoelig», 1 resultaat «intermediair», 6 resultaten «resistent». Deze stam vertoonde duidelijk een limiet resistentie of gevoeligheid voor ethambutol, dermate dat de resultaten van de deelnemers in dit geval niet als fout beschouwd kunnen worden. Voor pyrazinamide, bekwam 1 laboratorium een foutieve gevoeligheid voor stam 1 (Canetti techniek) en 2 deelnemers een foutieve resistentie voor stam 4 (MGIT techniek).. Rapport EKE Mycobacteriën

7 5. Besluit De kwaliteitscontrole voor identificatie van Mycobacteriën leverde goede resultaten op: de 5 stammen (3 M. tuberculosis, 1 M. interjectum en 1 M. kansasii) werden correct geïdentificeerd door de meerderheid van de laboratoria. De Belgische kwaliteitscontrole 2011 van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor INH, RMP en EMB, uitgevoerd door 15 deelnemers op 3 stalen, leverde voor INH en RMP uitstekende resultaten op; voor EMB stelden zich enkele problemen. We stelden 100 % concordante resultaten vast voor INH en RMP en 84.4% voor EMB. De sensitiviteit, specificiteit, positief predictieve waarde en negatief predictieve waarde van een resultaat voor resistentie van een stam (aan een antibioticum) bedroegen 100% voor isoniazide en rifampicine; voor ethambutol bedroegen deze respectievelijk 100%, 76.7%, 71.4% en 100%. De gevoeligheidstesten voor PZA werden door 9 laboratoria uitgevoerd: de concordantie bedroeg 88.8%; de sensitiviteit en specificiteit bedroegen 88.9%, de positieve predictieve waarde 80.0% en de negatieve 94.1%. Rapport EKE Mycobacteriën

8 6. Tabellen Tabel 1 Gebruikte methoden en technische details Methode Aantal testen Aantal testen 100% overeenkomend PZA: Aantal testen PZA: Aantal testen 100% overeenkomend Bactec MGIT BBL MGIT man. aflezing Canetti op vaste bodem Totaal 15 8 (53.3 %) 9 6 (66.6%) Tabel 3 Globale resultaten van de testen, uitgevoerd op de 3 stalen Stam nummer Isoniazide Rifampicine Ethambutol Pyrazinamide Ref S R Ref S R Ref S I R Ref S R 1 R 0 15 R 0 15 S R R 0 15 R 0 15 R S S 15 0 S 15 0 S S 7 2 Concordantie 45/45 45/45 38/45 = 84.4 % 24/27 = 88.8 % Sensitiviteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een resultaat R overeenkomt met een stam R 30 R vastgest. /30 R 30 R vastgest. /30 R 15 R vastgest. /15 R 8 R vastgest. / 9 R = 88.9 % Specificiteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een resultaat S overeenkomt met een stam S 15 S vastgest. /15 S 15 S vastgest. /15 S 23 S vastgest. /30 = 76.7 % 16 S vastgest./18 S = 88.9 % PPW van R Waarschijnlijkheid dat een stam R is als hij op AB als R gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 30 juiste R vastgest./30 R tot. vastgest. 30 juiste R vastgest./30 R tot. vastgest. 15 juiste R vastgest./21 R tot. vastgest. = 71.4 % 8 juiste R vastgest./ 10 R tot. vastgest. = 80 % NPW van R Waarschijnlijkheid dat een stam S is als hij op AB als S gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 15 juiste S vastgest./15 S tot. vastgest. 15 juiste S vastgest./15 S tot. vastgest. 23 juiste S vastgest. / 23 S tot. vastgest. 16 juiste S vastgest. / 17 S tot. vastgest. = 94.1 % Rapport EKE Mycobacteriën

9 Tabel 2a Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Isoniazide Rifampicine Ethambutol Stam Methode Res.Refer. R R S R R S S R S A B C D E F G H I J K L M N O R R S R R S S R S BBL MGIT Man R R S R R S R R S Bactec MGIT R R S R R S R R S Bactec MGIT R R S R R S R R S Canetti 7H10 R R S R R S I R S Bactec MGIT R R S R R S R R S Bactec MGIT R R S R R S R R S Bactec MGIT R R S R R S R R S Bactec MGIT Concordantie INH RMP EMB Inoc. INH RMP EMB Labo Methode µg/ml µg/ml µg/ml ml % % % A Bactec MGIT 0, B BBL MGIT Man 0,1 1 3,5 0, C Bactec MGIT 0, D Bactec MGIT E Bactec MGIT 0, , F Bactec MGIT en 7,5 0, G Bactec MGIT 0, , H Bactec MGIT 0, , I Canetti 7H ,15* J Bactec MGIT 0, , K Bactec MGIT L Bactec MGIT 0, , M Bactec MGIT 0, N Bactec MGIT O Bactec MGIT 0, , ,15* van 1 McF 100 % Correct Rapport EKE Mycobacteriën

10 Tabel 2b Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor pyrazinamide voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers die de gevoeligheid voor dit antibioticum bepaald hebben RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Pyrazinamide Stam Methode Res.Refer. R S S A R S S Bactec MGIT C R S S Bactec MGIT D R S S Bactec MGIT E R S R Bactec MGIT F R S R Bactec MGIT H R S S Bactec MGIT I S S S Canetti 7H10 M R S S Bactec MGIT N R S S Bactec MGIT Concordantie PZA Inoc. PZA Labos Methode µg/ml ml % 100 % Correct A Bactec MGIT 100 C Bactec MGIT D Bactec MGIT 100 E Bactec MGIT 100 0, F Bactec MGIT 100 0, H Bactec MGIT 100 0,5 100 I Canetti 7H10 * 0,15** 66.7 M Bactec MGIT 100 0,5 100 N Bactec MGIT * 900 µg/tablet 0,15** van 1 Mc F Rapport EKE Mycobacteriën

11 Tabel 4 Gedetailleerde tabel voor de resultaten van de identificaties Labo Methode Resultaten stammen 1, 3 en 4 A B C D E F G H I GenProbe Sonde + Sequencing (target hsp 65) Inno-Lipa-Rif-TB + Inno-Lipa Mycobacteria + Sequencing (target DNA coderend voor 16S rrna)+ Chromatogram Immunoassay In house PCR (target DNA coderend voor 16S rrna) + Sequencing (target DNA coderend voor 16S rrna) + Biochemische testen Resultaat stam 2 Resultaat stam 5 M. tuberculosis complex M. interjectum M. kansasii M. tuberculosis M. interjectum M. kansasii groep 1 M. tuberculosis complex M. interjectum M. kansasii In house PCR M. tuberculosis Geen groei Atypische mycobacterie SD TB Ag MPT64 Rapid M. tuberculosis complex Geen groei Atypische mycobacterie GenProbe Sonde + M. tuberculosis M. interjectum M. kansasii In house PCR (target DNA coderend voor 16S rrna) + Sequencing (target DNA coderend voor 16S rrna 1000 bp) + BD MGIT TBC Identification test + Biochemische testen GenProbe Sonde + Sequencing (target 16S DNA) + Biochemische testen In house PCR (target IS6110: M. tbc; CSB: M bovis ) + Sequencing (target DNA coderend voor 16S rrna) Sequencing (target DNA coderend voor 16S rrna) + Biochemische testen M. tuberculosis M. interjectum M. kansasii M. tuberculosis M. interjectum M. kansasii M. tuberculosis M. interjectum M. kansasii J In house PCR (target 16S DNA) M. tuberculosis complex M. interjectum M. kansasii/gastrii K GenProbe Sonde + Biochemische testen M. tuberculosis M. gordonae M. marinum L Inno-Lipa Mycobacteria M. tuberculosis complex Geen groei M. kansasii groep 1 M N O Inno-Lipa Mycobacteria M. tuberculosis complex Mycobacterium species Pathofinder RT-PCR (M.tbc) M. tuberculosis complex Mycobacterium species GenProbe Sonde + GenoType Mycobacterium (Hain) Oranje: onjuist resultaat M. kansasii groep 1 M. kansasii groep 1 M. tuberculosis complex M. interjectum M. kansasii Geel: onvoldoende nauwkeurige resultaten Rapport EKE Mycobacteriën

12 7. Uitstrijkje Mycobacteriën Op 6 september 2011 werden 2 uitstrijkjes verstuurd voor microscopisch onderzoek: M/11476 was positief (++ tot +++) M/11480 was negatief 7.1. Gebruikte methoden 7.2. Resultaten Methode Aantal laboratoria Zuurvast Ziehl-Neelsen 1 Kinyoun 2 Fluorescentie Auramine 12 Alle laboratoria vonden M/11476 positief. Veertien laboratoria vonden M/11480 negatief; één laboratorium antwoordde ± voor dit staal. De graad van positiviteit van staal M/11476 werd als volgt beoordeeld: Graad van positiviteit Aantal laboratoria Aangezien dit een eerste enquête betrof werd de kwalitatieve beoordeling vrij gelaten. Enkele laboratoria gaven weer met welke aantallen deze kwalitatieve beoordeling in hun laboratorium overeenkomt: +++: 4 36 bacillen/veld 1 10 bacillen/veld ++: 5 10 bacillen/veld 1 10 bacillen/veld ±: 1 2 bacillen/100 velden Ter gelegenheid van een volgende gelijkaardige enquête zal een codetabel verstrekt worden ten einde een standaardisering van de antwoorden toe te laten. Rapport EKE Mycobacteriën