1. Deelnemers. 2. Stalen

Transcriptie

1 Externe kwaliteitsevaluatie in Microbiologie 2013 Identificatie van Mycobacteriën Gevoeligheidsbepaling van Mycobacterium tuberculosis complex isoniazide (INH), rifampicine (RMP), ethambutol (EMB) en facultatief pyrazinamide (PZA). Rapport opgesteld door Vanessa MATHYS, Bernard CHINA en Kris VERNELEN, Wetenschappelijk Instituut voor Volksgezondheid 1. Deelnemers Onze-Lieve-Vrouw Ziekenhuis, AALST ZNA, Campus Stuivenberg, ANTWERPEN Instituut voor Tropische Geneeskunde, ANTWERPEN UZ-VUB, BRUSSEL Laboratoire de la Porte de Hal, BRUXELLES CHU Erasme, ULB, BRUXELLES Cliniques Universitaires Saint-Luc, UCL, BRUXELLES Tuberculose & Mycobacteriën, OD Overdraagbare en besmettelijke ziekten, WIV, BRUSSEL CHU de Charleroi, CHARLEROI Ch Jolimont-Lobbes, site Jolimont, HAINE-SAINT-PAUL UZ Gasthuisberg, LEUVEN CHR de la Citadelle, LIEGE CHU Sart-Tilman, LIEGE Laboratoire Nationale de Santé, LUXEMBOURG, Grand Duché de Luxembourg Cliniques UCL de Mont-Godinne, YVOIR 2. Stalen Pakketten van 5 tubes, genummerd van 1 tot en met 5, werden naar de deelnemers verstuurd op 16 september Het betrof culturen van 3 verschillende stammen van het Mycobacterium tuberculosis complex, die gevoelig of resistent waren aan de te testen antibiotica en 2 atypische mycobacteriën (M. gordonae en M. abscessus). Alle stammen werden verstuurd in MGIT 7H9 milieu. De stalen werden voorbereid door het laboratorium Tuberculose en Mycobacteriën van het WIV (Dr. Vanessa Mathys) (selectie van de stammen, kweek, verdeling in tubes) en vervolgens naar de deelnemers verzonden door de afdeling Kwaliteit van Medische Laboratoria van het WIV (Dr. Kris Vernelen). Rapport EKE Mycobacteriën

2 Kenmerken van de stammen Stam Resistentie profiel of identificatiemethode in het referentielabo I-R-E-Z Isoniazide mutatie (I) Rifampicine Mutatie (R) 1 Mycobacterium 12MY1412 gordonae 2 Mycobacterium 12MY1242 S-R-S-S/R Wild-type H526Y tuberculosis 3 Mycobacterium tuberculosis 13MY0681 R-S-S-S S315T (katg) 4 Mycobacterium 12MY1551 abscessus 5 Mycobacterium tuberculosis 12MY1257 S-S-S-S 16S r DNA= DNA dat codeert voor 16S rrna Rapport EKE Mycobacteriën

3 3. Resultaten Aantal deelnemers: 15 (identificatie en AB) Eerste resultaat ontvangen na 23 dagen. Laatste resultaat ontvangen na 51 dagen. Gebruikte methoden voor identificatie: - 7 laboratoria gebruikten enkel moleculaire technieken (3 laboratoria vermeldden 1 techniek, 3 vermeldden 2 technieken en 1 vermeldde 3 technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van twee moleculaire technieken en biochemische technieken - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van een moleculaire techniek, biochemische technieken en de Malditof biotyper - 2 laboratoria gebruikten een combinatie van moleculaire technieken en de Chromatogram Immunoassay: MGIT TBC Identification Test (BD) (1 laboratorium gebruikte 2 moleculaire technieken en 1 laboratorium 3 moleculaire technieken) - 1 laboratorium gebruikte een combinatie van twee moleculaire technieken en de TB Ag MPT 64 Rapid (Standard Diagnostics) - 1 laboratorium gebruikte biochemische technieken en analyse van mycolzuren via gaschromatografie - 1 laboratorium gebruikte de combinatie van de MGIT TBC Identification Test (BD) (M. tuberculosis complex) en de Malditof biotyper (atypische mycobacteriën) - 1 laboratorium gebruikte enkel de TB Ag MPT 64 Rapid (Standard Diagnostics) Moleculaire methoden: - Inno-Lipa Mycobacteria: 3 deelnemers - GenProbe Sonde: 3 deelnemers - GenoType Mycobacterium (Hain): 2 deelnemers - In house PCR (target 16S rdna): 2 deelnemers - In house PCR (target IS6110): 2 deelnemers 2 - In house PCR (target 16S 23S rdna): 1 deelnemer - Sequencing (target 16S rdna): 6 deelnemers 2 - Sequencing (target hsp 65): 1 deelnemer - Gene expert: 1 deelnemer - Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder): 1 deelnemer 1 Twee laboratoria vermeldden de In house PCR (target IS6110) te gebruiken voor de M. tuberculosis en de Sequencing (target 16S rdna) voor de atypische mycobacteriën. De uitgevoerde biochemische testen bestonden uit: productie van niacine, nitraatreductie, hydrolyse van Tween 80, arylsulfatase 3 dagen, Na-citraat, ijzerreductase, vergisting van inositol en mannitol, groei op 5% NaCl, groei op nitriet-sauton-agar, groei op pikrine- Sauton-agar en pigmentvorming (aantal en aard van de gebruikte technieken verschillen naargelang de laboratoria). Rapport EKE Mycobacteriën

4 Gebruikte methoden voor bepaling van antibiogram: 2 types van methoden - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - proportionele methode van Canetti op vaste bodem Zeven laboratoria hebben de gevoeligheid voor pyrazinamide bepaald; ze hebben 2 types van methoden gebruikt: - 1 methode die gebruik maakt van een vloeibaar medium: Bactec MGIT - bepaling van pyrazinamide-activiteit met Rosco-tablet Gedetailleerde bespreking van de resultaten: 1) Identificaties Het overzicht van de antwoorden worden hieronder weergegeven. De correcte of aanvaardbare resultaten zijn onderlijnd Tabel 4 geeft de identificatietechnieken, gebruikt door de laboratoria, en de geantwoorde identificaties weer. Staal 1: M. gordonae M. gordonae 12 (80.0%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 2 (13.3%) M. avium complex 1 (het laboratorium dat dit antwoord verstrekte, contacteerde ons na de ontvangst van het voorlopig rapport met de melding dat het een overschrijffout betrof) Staal 2: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (60%) M. tuberculosis 6 (40%) Staal 3: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (60%) M. tuberculosis 6 (40%) Staal 4: M. abscessus M. abscessus 5 (33.3%) M. abscessus/chelonae 3 (20.0%) M. chelonae complex ((gr. III M. abscessus) 2 (13.3%) M. chelonae complex 1 (6.7%) M. chelonae 1 (6.7%) Mycobacterium species (niet M. tuberculosis) 2 (13.3%) Afwezigheid van mycobacteriën (Nocardia sp.) 1 Staal 5: M. tuberculosis complex M. tuberculosis complex 9 (60%) M. tuberculosis 6 (40%) Rapport EKE Mycobacteriën

5 2) Antibiogrammen a) Tabel 1 geeft het aantal uitgevoerde testen weer per methode, evenals het aantal testen dat volledig overeenstemmende resultaten opleverde met de resultaten van het laboratorium, dat de stammen selecteerde (Tuberculose & Mycobacteriën, DG Overdraagbare en besmettelijke ziekten van het WIV). We stellen vast dat 93.3% van de testen uitgevoerd werden in een vloeibaar medium met een geautomatiseerde methode. 14 van de 15 bepalingen (93.3%) leverden resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Eén laboratorium bekwam afwijkende resultaten voor isoniazide en rifampicine voor stam 5 (in beide gevallen: R waar S verwacht werd). De Bactec MGIT techniek wordt het meest gebruikt door de Belgische laboratoria (14 testen op 15). 92.9% (13/14) van de resultaten die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum werden bekomen met een geautomatiseerde methode in vloeibaar medium. Voor pyrazinamide (rechter deel van de tabel): Staal 2 werd niet geëvalueerd gezien de wisselende resultaten voor de gevoeligheidstest die door het Referentiecentrum gerapporteerd werden. Voor de twee overige stalen leverden 6 van de 8 bepalingen (75%) voor dit antibioticum resultaten op die volledig in overeenstemming waren met deze van het referentiecentrum. Ook voor dit antibioticum is de Bactec MGIT techniek de meest gebruikte door de Belgische laboratoria (7 testen op 8); 85.7% (6/7) van de resultaten die met deze techniek bekomen werden waren in overeenstemming met deze van het referentiecentrum. b) Tabel 2a geeft de gedetailleerde resultaten weer per laboratorium (aangeduid door een letter). De gebruikte methode, de eindconcentratie van elk antibioticum per ml milieu et het volume van het inoculum worden eveneens weergegeven. Voor elk laboratorium werd voor elk antibioticum het percentage resultaten in overeenstemming met deze van het referentiecentrum berekend. Zoals reeds hoger vermeld werd er voor zowel rifampicine als isoniazide één afwijkend resultaat vastgesteld door hetzelfde laboratorium. Voor ethambutol was de concordantie met het referentiecentrum 100%. Tabel 2b geeft dezelfde gegevens weer voor pyrazinamide. Zowel voor staal 3 als voor staal 5 was er telkens één laboratorium dat een afwijkend resultaat bekwam ( R waar S verwacht werd). Commentaar Twee van de 14 gebruikers van de Bactec MGIT techniek, hebben niet vermeld welke antibioticadoses zij gebruikt hebben. Van de 12 anderen, gebruiken allen de concentraties die BD voorschrijft, gebruikt 1 labo de 2 voorgeschreven dosissen van ethambutol en gebruiken 4 de 2 voorgeschreven dosissen van isoniazide Voor de gevoeligheidsbepaling aan pyrazinamide, hebben 5 van de 7 gebruikers van het Bactec MGIT de door BD voorgeschreven dosissen gebruikt; twee laboratoria hebben de dosis niet vermeld. c) Tabel 3 geeft de samenvatting weer van de resultaten van de testen, die op elk der 3 stalen uitgevoerd werden. Het aantal evalueerbare resultaten bedroeg 45 voor isoniazide, rifampicine Rapport EKE Mycobacteriën

6 en ethambutol en 14 voor pyrazinamide. Het percentage correcte resultaten (in vergelijking met deze van het referentiecentrum voor het geheel der testen, per antibioticum bedraagt 100 % voor ethambutol, 97.8% voor isoniazide en rifampicine en 87.5% voor pyrazinamide. Voor elk antibioticum werd eveneens de gevoeligheid en de specificiteit van een resultaat voor resistentie berekend (ten opzichte van het resultaat van het referentiecentrum) en de voorspellende waarde van een resistent of gevoelig resultaat. 4. Bespreking A. Identificatie van Mycobacteriën. Twee identificaties waren incorrect. Ze zijn in het rood gehighlighted in tabel 4. Eén resultaat vertoonde een gebrek aan nauwkeurigheid gezien de gebruikte techniek. Dit werd in het geel gehighlighted in de tabel. Mycobacterium tuberculosis complex. We veronderstellen dat de laboratoria die naast de moleculaire ook biochemische testen gebruikt hebben, het onderscheid tussen M. tuberculosis en M. bovis kunnen maken. Mycobacterium gordonae Eén laboratorium gaf het antwoord M. avium complex; dit laboratorium contacteerde ons na de ontvangst van het voorlopig rapport met de melding dat het een overschrijffout betrof. Mycobacterium abscessus Eén laboratorium slaagde er niet in mycobacteriën aan te tonen, doch stelde de aanwezigheid van een Nocardia species vast (dit is het laboratorium dat eveneens de vals positieve resistentie voor isoniazide en rifampicine antwoordde). Het laboratorium dat M. chelonae geantwoord heeft, had moeten kunnen M. abscessus antwoorden gezien het gebruik van de Genotype Mycobacterium kit die in staat is de 2 species te onderscheiden. B. Gevoeligheidstesten De resultaten zijn uitstekend voor ethambutol. Voor isoniazide en rifampicine vond één laboratorium een afwijkend resultaat voor stam 5 (in beide gevallen: R waar S verwacht werd; MGIT techniek). Voor pyrazinamide vonden twee laboratoria een afwijkend resultaat: staal 3: ( R waar S verwacht werd; Rosco tablet) en staal 5 ( R waar S verwacht werd; MGIT techniek). 5. Besluit De kwaliteitscontrole voor identificatie van mycobacteriën leverde goede resultaten op: de 5 stammen (3 M. tuberculosis, 1 M. gordonae en 1 M. abscessus) werden correct geïdentificeerd door de meerderheid van de laboratoria. De Belgische kwaliteitscontrole 2013 van de gevoeligheid van Mycobacterium tuberculosis voor INH, RMP en EMB, uitgevoerd door 15 deelnemers op 3 stalen, leverde voor EMB uitstekende resultaten op; voor INH en RMP stelde zich voor één staal een probleem voor één laboratorium. We stelden 100 % concordante resultaten vast voor EMB en 97.8% voor INH en RMP. Rapport EKE Mycobacteriën

7 De sensitiviteit en de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat bedroegen 100% voor isoniazide en rifampicine; de specificiteit bedroeg 96.7% voor deze antibiotica en de voorspellende waarde van een resistent resultaat 93.8%. Voor ethambutol bedroegen de specificiteit en de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat 100% (de sensitiviteit en voorspellende waarde van een resistent resultaat werden niet berekend aangezien de 3 stammen gevoelig waren aan dit antibioticum). De gevoeligheidstesten voor PZA werden door 8 laboratoria uitgevoerd: de concordantie en de voorspellende waarde van een gevoelig resultaat bedroegen 100%; de specificiteit bedroeg 87.5%. Rapport EKE Mycobacteriën

8 6. Tabellen Tabel 1 Gebruikte methoden en technische details Methode Aantal testen Aantal testen 100% overeenkomend PZA: Aantal testen PZA: Aantal testen 100% overeenkomend Bactec MGIT Canetti op vaste bodem Rosco disks Totaal (93.3 %) 8 6 (75%) Tabel 3 Globale resultaten van de testen, uitgevoerd op de 3 stalen Stam nummer Isoniazide Rifampicine Ethambutol Pyrazinamide 1 Ref S R Ref S R Ref S R Ref S R 2 S 15 0 R 0 15 S 15 0 S/R R 0 15 S 15 0 S 15 0 S S 14 1 S 14 1 S 15 0 S 7 1 Concordantie 44/45 = 97.8 % 44/45 = 97.8 % 45/45 = 100 % 14/16 = 87.5 % Sensitiviteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam R een resultaat R oplevert 15 R vastgest. /15 R verwacht = 100 % 15 R vastgest. /15 R verwacht = 100 % - - Specificiteit van de Resistentie Waarschijnlijkheid dat een stam S een resultaat S oplevert 29 S vastgest. /30 S verwacht = 96.7 % 29 S vastgest. /30 S verwacht = 96.7 % 45 S vastgest. /45 verwacht = 100 % 14 S vastgest./ 16 verwacht = 87.5 % Waarschijnlijkheid dat een stam R is als hij op AB als R gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 15 juiste R vastgest./16 R tot. vastgest. = 93.8 % 15 juiste R vastgest./16 R tot. vastgest. = 93.8 % - 0 juiste R vastgest./2 R tot. vastgest. Waarschijnlijkheid dat een stam S is als hij op AB als S gevonden wordt (in België onafh. van de methode) 29 juiste S vastgest./29 S tot. vastgest. = 100 % 29 juiste S vastgest./29 S tot. vastgest. = 100 % 45 juiste S vastgest. / 45 S tot. vastgest. = 100 % 14 juiste S vastgest. / 14 S tot. vastgest. = 100 % 1 De resultaten van staal 2 werden voor pyrazinamide niet in rekening gebracht. Rapport EKE Mycobacteriën

9 Tabel 2a Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Isoniazide Rifampicine Ethambutol Stam Methode Res.Refer. S R S R S S S S S A B C D E F G H I S R S R S S S S S Canetti 7H10 J K L S R R R S R S S S Bactec MGIT M N O Labo Concordantie INH RMP EMB Inoc. INH RMP EMB µg/ml µg/ml µg/ml ml % % % 100 % Correct Methode A Bactec MGIT 0, B Bactec MGIT 0, , C Bactec MGIT 0, D Bactec MGIT 0.1 en E Bactec MGIT 0.1 en , F Bactec MGIT 0.1 en en 7,5 0, G Bactec MGIT 0.1 en , H Bactec MGIT 0, , I Canetti 7H en * J Bactec MGIT 0, K Bactec MGIT L Bactec MGIT 0, , M Bactec MGIT 0, N Bactec MGIT 0, O Bactec MGIT 0, , * 3 druppels van van 1 McF Rapport EKE Mycobacteriën

10 Tabel 2b Gedetailleerde tabel voor de resultaten voor pyrazinamide voor elk der 3 stalen bekomen door de deelnemers die de gevoeligheid voor dit antibioticum bepaald hebben RESULTATEN van de DEELNEMERS Labo Pyrazinamide Stam Methode Res.Refer. S/R S S A R S S Bactec MGIT C R S S Bactec MGIT D R S S Bactec MGIT E R S R Bactec MGIT F R S S Bactec MGIT G R S S Bactec MGIT I S R S Rosco tablet M S S S Bactec MGIT Concordantie PZA Inoc. PZA 1 µg/ml ml % 100 % Correct 1 Labos Methode A Bactec MGIT C Bactec MGIT D Bactec MGIT E Bactec MGIT 100 0,5 50 F Bactec MGIT 100 0,5 G Bactec MGIT 100 0,5 100 I Rosco tablet * ** 50 M Bactec MGIT 100 0,1 100 * 900 µg/tablet ** 3 druppels van van 1 McF 1 De resultaten van staal 2 werden niet in rekening gebracht. Rapport EKE Mycobacteriën

11 Tabel 4 Gedetailleerde tabel voor de resultaten van de identificaties Labo Methode Resultaten stammen 2, 3 en 5 Resultaat stam 1 Resultaat stam 4 A Sequencing (target hsp 65) M. tuberculosis complex M. gordonae M. abscessus B C Sequencing (target 16S rdna) + Biochemische testen + Malditof Biotyper In house PCR (target 16S rdna) + Sequencing (target 16S rdna) + SD TB Ag MPT64 Rapid M. tuberculosis M. gordonae M. abscessus M. tuberculosis complex M. gordonae M. chelonae complex D In house PCR (target 16S - 23S rdna) M. tuberculosis M. non-tuberculosis M. non-tuberculosis E SD TB Ag MPT64 Rapid M. tuberculosis complex M. non-tuberculosis M. non-tuberculosis F GenProbe Sonde + In house PCR (target 16S rdna) + Sequencing (target 16S rdna) + BD MGIT TBC Identification M. tuberculosis M. gordonae M. abscessus G H I J K L M N O In house PCR (target IS6110 ) + Sequencing (target 16S rdna) + GenoType Mycobacterium (Hain) GenProbe Sonde + Sequencing (target 16S rdna) + Biochemische testen Biochemische testen + analyse van mycolzuren via gaschromatografie In house PCR (target IS6110) + Sequencing (target 16S rdna) BD MGIT TBC Identification test + Malditof Biotyper M. tuberculosis complex M. gordonae M. abscessus M. tuberculosis M. gordonae M. abscessus/chelonae M. tuberculosis M. gordonae M. abscessus M. tuberculosis complex M. gordonae M. abscessus/chelonae M. tuberculosis complex M. gordonae M. abscessus/chelonae Inno-Lipa Mycobacteria M. tuberculosis complex M. gordonae Afwezigheid van mycobacteriën Inno-Lipa Mycobacteria + Gene expert + BD MGIT TBC Identification test Inno-Lipa Mycobacteria + Real Accurate Mycobacterium tuberculosis GIT (Pathofinder) GenProbe Sonde + GenoType Mycobacterium (Hain) Incorrect resultaat 1 Overschrijffout M. tuberculosis complex M. avium complex (M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum) 1 M. chelonae complex (gr. III M. abscessus) M. tuberculosis M. gordonae M. chelonae complex (gr. III M. abscessus) M. tuberculosis complex M. gordonae M. chelonae Onvoldoende nauwkeurig resultaat Rapport EKE Mycobacteriën