Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en Mycobacteriën.

Transcriptie

1 Referentielaboratorium - Brussel Gegevens van het referentielaboratorium Dr. Ap. M. DUFAUX WIV - Dpt Pasteur Engelandstraat Brussel Tel.: 02/ Fax: 02/ : Mfauville@wiv-isp.be Onderstaande gegevens zijn afkomstig van het referentielaboratorium van het WIV-Dpt Pasteur, Dienst Tuberculose en. Inleiding De volgende analysen werden uitgevoerd: op DNA-extract identificatie opsporing van genmutaties geassocieerd met antibioticaresistentie op positieve culturen identificatie, door moleculaire biologie (specifieke PCR van verschillende mycobacteriële species, amplificatie van een fragment van het gen coderend voor 16S rrna of voor hsp65, gevolgd door een sequentieanalyse, Inno-Lipa- Mycobacteriatest, PCR aan de hand waarvan het M. tuberculosiscomplex kan worden ontleed) gevoeligheidstest voor M. tuberculosis - in Bactec MGIT 960 of in Bactec 460TB (vloeibare voedingsbodems) voor de eerstelijnstuberculostatica, met name isoniazide (I), rifampicine (R), ethambutol (E). Pyrazinamide (PZA) werd niet getest omdat het resultaat van de invitrotest niet overeenstemt met de activiteit van de in-vivo-pza - door de methode Bactec 460TB voor bepaalde tweedelijnsantituberculostatica - door de test Inno-Lipa-Rif-TB of door een sequentieanalyse van een regio van 81 pb van het gen rpob om de resistentie tegen rifampicine na te gaan - door PCR om de mutatie S315T in het gen katg en de mutatie C-15T op te sporen in de regio die bevorderlijk is voor gen inha om de resistentie tegen isoniazide na te gaan gevoeligheidstests op atypische mycobacteriën, alleen wanneer het klinische geval dit rechtvaardigt (proportiemethode van Canetti in vaste voedingsbodem, gevoeligheidsmethode bij een snelle kweek) genotypering van M. tuberculosis, in geval van resistentie tegen eerstelijnstuberculostatica, in geval van een vermoeden van een epidemie of laboratoriumbesmetting of op uitdrukkelijk verzoek (technieken: spoligotyping, MIRU-VNTR op 15 of 24 loci). Stalen ontvangen voor analyse in 2009 Aantal: culturen voor identificatie 16 klinische stalen 8 referentiestammen voor verzameling 55 stammen voor externe kwaliteitscontrole (gevoeligheidstest) 97 DNA-extracten Geografische oorsprong: zij waren afkomstig van 103 verschillende laboratoria, verspreid over Brussel, Wallonië en Vlaanderen, waarvan er 42 meer dan 10 aanvragen opgestuurd hebben. Geïdentificeerde mycobacteriën van klinische oorsprong culturen (86% in vloeibare voedingsbodem en 14% op vaste voedingsbodem) werden voor identificatie opgestuurd. Mycobacterie Tuberculose werd geïdentificeerd in van die culturen: 409 (36,6%) M. tuberculosiscomplexen en 707 (63,4%) atypische mycobacteriën of NTM. De verschillende mycobacteriën geïdentificeerd in klinische monsters en kweken worden in tabel 2 vermeld. De identificaties per type klinisch staal wordt in tabel 3 gedetailleerd. In tabel 4 staan de verschillende mycobacteriële species die sinds 1998 jaarlijks worden geïdentificeerd. Opmerkelijk is het feit dat 346 (23,7%) van de culturen opgestuurd ter identificatie geen mycobacteriën bevatten (zij bevatten een besmettend micro-organisme of geen enkele bacteriële ontwikkeling en waren dan vals positief voortgekomen uit de kweekautomaat van het laboratorium van oorsprong). 1

2 Referentielaboratorium - Brussel Gevoeligheidstests 1. M. tuberculosis In 2009 werd M. tuberculosis (M. tuberculosiscomplex) geïdentificeerd in 409 klinische stalen van 332 verschillende patiënten. De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 261 patiënten (op 1 klinisch isolaat voor 256 patiënten en op 2 isolaten voor 5 van hen). Het antibiogram werd alleen uitgevoerd op de stammen verstuurd voor genotypering, op geinoculeerde culturen, of wanneer de stam geïsoleerd was in een laboratorium dat zelf de gevoeligheidstests uitvoerde (tabel 1). Tabel 1: : gevoeligheidstests (N, %; ) N % N % N % N % N % N % N % N % N % gevoelig voor I, R en E , , , , , , , , ,7 alleen resistent tegen E 1 0,3 1 0,3 alleen resistent tegen I 9 3, ,7 22 8,7 26 8,0 21 6,1 32 9,5 23 6,1 28 8,4 26 9,6 alleen resistent tegen R 1 0,3 2 0,8 1 0,3 0 0,0 2 0,6 1 0,3 2 0,7 resistent tegen I + E 4 1,2 7 1,9 multiresistent (I+R) 1 0,3 3 0,9 2 0,8 7 2,1 4 1,1 4 1,2 2 0,7 multiresistent (I+R+E) 9 3,0 12 3,7 7 2,8 14 4,3 11 3,2 13 3,8 18 4,8 18 5,4 14 5,2 Totaal , , , , , , , , ,0 I : isoniazide, R : rifampicine, E : ethambutol myco_b_t1 Onder de multiresistente stammen tellen we 9 stammen (56%) behorend tot de familie Beijing. Een mutatie in rpob werd aangetroffen in alle isolaten resistent tegen rifampicine (mutatie S531L in 75% van de gevallen). Een mutatie in katg of inha werd aangetroffen in 87% (14/16) van de MDR-isolaten (katg in 81%; katg + inha in 6%). Onder de isolaten monoresistent tegen isoniazide (of resistent tegen isoniazide en ethambutol) werd de mutatie S315T in katg aangetroffen in 50% van de isolaten en de mutatie -C15T in inha in 25% van de isolaten. De resterende 25% van de isolaten hadden de gezochte mutatie in deze 2 genen niet. 2. Atypische mycobacteriën of NTM De gevoeligheidstest werd uitgevoerd voor 180 patiënten (187 isolaten) besmet met de volgende mycobacteriën: 97 M. avium-intracellulare, 32 M. xenopi, 36 M. kansasii, 10 complexe chelonae, 5 complexe fortuitum, 6 M. marinum, 2 M. simiae en 9 andere atypische mycobacteriën. Analyse van DNA geëxtraheerd uit klinische stalen Wij hebben 97 DNA stalen (geëxtraheerd in het laboratorium dat het staal had gekregen) ontvangen ter identificatie en/of opsporing van genmutaties geasocieeerd met resistentie tegen isoniazide en rifampicine. Van de 97 DNA stalen werden er 10 (waarvan 8 van respiratoire oorsprong) ontvangen van een ziekenhuis voor snelle opsporing van mutaties in rpob, katg en inha (patiënten met mogelijke multiresistente tuberculose) en 68 (47 afkomstig van long of orgaan biopten, 6 huidbiopten en 15 van klieren) van een laboratorium voor anatomo-pathologie voor de opsporing van de aanwezigheid van mycobacterieel DNA. Van de 8 extracten van respiratoire oorsprong bevatten er 7 DNA van M. tuberculosis (waarvan 1 met mutaties geassocieerd met multiresistentie). 84% van het DNA van het laboratorium voor anatomo-pathologie bevatten geen mycobacterieel DNA, slechts 3 bevatten DNA van het M. tuberculosis-complex en 2 DNA van atypische mycobacterieën. 2

3 Referentielaboratorium - Brussel Genotypering van de tuberculosebacillen : 80 M. tuberculosis In ons laboratorium worden twee genotyperingstechnieken op basis van verschillende merkers gebruikt om de genetische afdruk van de tuberculosebacillen te bepalen: spoligotyping, MIRU-VNTR (Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit - Variable Number Tandem Repeat) op 24 loci. Genotypering biedt de gelegenheid om de overdrachtswegen van de tuberculose na te gaan (bevestiging van intrafamiliale besmetting of besmetting onder buren, micro-epidemies, opsporing van kruisbesmettingen in laboratoria tussen twee stalen die tezelfdertijd worden behandeld). Dankzij de techniek kan ook humane tuberculose ten gevolge van M. bovis worden onderscheiden van klassieke tuberculose ten gevolge van M. tuberculosis. Genotypering wordt toegepast op alle klinische isolaten resistent tegen isoniazide, op alle multiresistente isolaten en op verzoek, op isolaten gevoelig voor antituberculose in geval van een vermoeden van een epidemie of besmetting. Geen enkel cluster van identieke stammen werd waargenomen bij isoniazide monoresistente isolaten. Van de 16 multiresistente isolaten waren twee broers besmet met dezelfde stam (intra-familiale besmetting), een patiënt met Noord-Afrikaanse oorsprong was besmet met een stam van hetzelfde genotype geïsoleerd in 2007 van een patiënt van dezelfde geografische afkomst. Tot slot, een Tibetaanse patiënt was geïnfecteerd door een stam van hetzelfde genotype als een andere Tibetaanse patiënt opgespoord in Daarboven werden 12 uitzonderlike aanvragen voor de genotypering doorgestuurd uit een totaal van 38 stammen (38 patiënten). Verschillende clusters van identieke stammen werden gevonden: een recidief geval van tuberculose bij een patiënt na 9 jaar, buurtbesmetting, meerdere besmettingen in laboratoria wat geleid heeft tot het vermijden van de behandeling van vals positieve patiënten. Opmerkingen De nationale gegevens over het aantal gevallen van tuberculose in België en het aantal multiresistente patiënten worden verzameld en verspreid door FARES-VRGT. Het aantal gevallen van tuberculose resistent tegen isoniazide en van multiresistente tuberculose (MDR-TB: hetzij resistentie tegen ten minste isoniazide en rifampicine) geregistreerd in ons laboratorium is vergelijkbaar met de percentages vastgesteld in 2008 (6,1 % de MDR versus 6,6 % en 2008). Daarentegen, MDR stammen zijn resistent tegen meerdere antibiotica, wat een stijging van de mislukte behandelingen doet vermoeden. Van de 16 MDR-patiënten, werden 4 patiënten besmet met een XDR stam (XDR: MDR stam met extra resistentie tegen amikacine en quinolone), 4 andere patiënten werden besmet met een resistente stam met extra resistentie tegen amikacine (maar gevoelig voor quinolones) en 1 patiënt met een MDR stam gevoelig voor amikacine, maar resistent tegen chinolonen. Deze gevallen van XDR-tbc zijn zeer moeilijk te behandelen en vereisen de isolatie van patiënten, negatieve druk kamer in het Sint-Pieter ziekenhuis, voor meerdere maanden. Deze patiënten worden opgenomen in de BELTA TB NET studie en hun behandeling wordt gefinancierd door het RIZIV 86% van de kweken verstuurd voor identificatie waren kweken in een vloeibare voedingsbodem (556 BACTEC MGIT, 537 MB/BacT, 169 Bactec 9.000) en 14% (200) ervan waren kweken op een vaste voedingsbodem. Anderzijds bevatten 341 kweken (24,5%) geen mycobacterie (besmette of vals positieve kweken). Het percentage zonder mycobacterie varieerde in functie van de gebruikte voedingsbodem. Percentages vals positieven: 33,8% (188/556) van de kweken MGIT, 24,2 % (130/537) van de kweken afkomstig van de MB/BacT (of BacT/Alert), 7,1% (12/169) van de kweken in Bactec en 8,0% (16/200) van de vaste kweken. De besmette of negatieve kweken vereisen veel meer werk (om zich ervan te vergewissen dat zij echt geen mycobacteriën bevatten) dan de identificatie van een zuivere mycobacteriële kweek. De meest geïsoleerde species van NTM waren net zoals voorgaande jaren M. xenopi (19,9% des NTM) en M. gordonae (28% des NTM; niet pathogeen). Het aantal M. avium en M. intracellulare is gedaald in vergelijking met voorgaande jaar (32,8% van de atypische mycobacterieëngeidentificeerd in 2009, versus 37,6% in 2008, 32% in 2007 en 22% in 2006 (tabel 4). Wat de NTM betreft weten wij niet hoeveel er werkelijk aan de oorsprong liggen van een ziekte omdat wij niet over de klinische gegevens van de patiënten beschikken. 3

4 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 2: : identificatie van culturen uit klinische monsters (N; 2009) % NTM TUBCPX Cpx M. tuberculosis 397 Mengeling cpx M.tub & atypisch 2 Pathogeen M. bovis 5 M. bovis ssp B.C.G. 5 Totaal TUBCPX ,9% NTM M. avium ,3% M. Intracellulare ,5% M. celatum 4 Cpx M. chelonae-abscessus 32 Cpx M. fortuitum-peregrinum 16 M. interjectum 2 M. intermedium 5 M. kansasii 24 M. lentiflavum 5 Potentieel M. malmoense 3 pathogeen M. marinum 6 M. mucogenicum 3 M. paraffinicum 2 M. scrofulaceum 1 M. simiae 9 M. szulgaï 3 M. xenopi ,8% Mengeling M. xenopi M. gordonae 1 M. alvei * 1 M. anthracenicum * 3 M. arupense 1 M. branderi 1 M. cookii 1 M. frederiksbergense * 1 Niet of zeer M. gordonae ,4% zelden Mengeling M. gordonae M. simiae 1 pathogeen M. noviomagense 1 M. palustre 1 M. phlei 1 M. sherrisii 1 M. shimoidei 1 M. terrae 2 M. triplex 1 Totaal NTM ,1% Totaal Mycobacteria 1107 Corynebacterium of andere Negatieve (kweken zonder mycobacteriën) 346 Totaal klinische kweken getest 1462 Referentiestammen voor collectie 8 kwaliteitscontrole 55 DNA-extracten Klinische monsters 16 Totaal 1638 * Voor het ogenblik geen gevallen beschreven voor deze species myco_b_t2 4

5 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 3: : species geïdentificeerd vertrekkende van kweekbodems (N; 2009) Kweken Cpx M. tuberculosis Mengeling cpx M.tub & atypisch Mycobacterium bovis ssp B.C.G. Mycobacterium bovis Mycobacterium alvei Mycobacterium anthracenicum Mycobacterium arupense Mycobacterium avium Mycobacterium branderi Mycobacterium celatum Cpx chelonae-abscessus Cpx fortuitum peregrinum septicum Mycobacterium cookii Mycobacterium frederiksbergense Mycobacterium gordonae Mycobacterium interjectum Mycobacterium intermedium Mycobacterium intracellulare Mycobacterium kansasii Mycobacterium lentiflavum Mycobacterium malmoense Mycobacterium marinum Mycobacterium mucogenicum (M. fort Mycobacterium noviomagense Mycobacterium palustre Mycobacterium paraffinicum (M. scrofu Mycobacterium parascrofulaceum Mycobacterium phlei Mycobacterium sherrisii Mycobacterium shimoidei Mycobacterium simiae Mycobacterium szulgai Mycobacterium terrae Mycobacterium triplex Mycobacterium xenopi Mengeling M. gordonae & M. xenopi Mengsel M. gordonae & M. simiae Corynebacterium Ander microorganisme Geelimineerd Totaal Sputum Bronchiale aspiraties Broncho-alv. vocht Maagvocht Ascites vocht Pleuraalvocht Peric. vocht Periton. vocht Cerebrospinaal vocht Gewrichtsvocht Blood Biopsieën organen Huidbiopsieën of pees Magere biopsie Klier Etter Abces Urine Faeces Anderen Onbepaald Totaal myco_b_t3 5

6 Referentielaboratorium - Brussel Tabel 4: : mycobacteriële species van klinische oorsprong (N; ) Cpx Cpx M. tuberculosis M. tuberculosis M. tuberculosis Mengeling M. tuberculosis + atypique M. africanum M. bovis M. bovis BCG Mengeling M. bovis BCG + M. gordonae 1 Opportunistische M. avium atypische M. Intracellulare Mengeling M. avium + atypique 2 M. celatum Cpx M. chelonae-abscessus Cpx M. fortuitum-peregrinum M. genavense 2 1 M. haemophilum M. immunogen M. interjectum M. intermedium M. kansasii Mengeling M. kansasii M. avium 1 Mengeling M. kansasii M. gordonae 1 M. lentiflavum M. malmoense M. marinum M. paraffinicum M. peregrinum M. scrofulaceum Mengeling M. scrofulaceum M. gordonae 1 M. simiae M. szulgaï M. xenopi Mengeling M. xenopi M. gordonae 1 2 M. species zeer zelden of M. agri niet pathogeen M. alvei* M. anthracenicum* M. arupense 1 M. aubagnense 1 M. bohemicum M. branderi 1 2 M. cookii 1 M. duvalli 1 1 M. elephantis 1 M. frederiksbergense* 1 M. gadium 1 1 M. gilvum 1 M. gordonae Mengeling M. gordonae M. simiae 1 M. heckeshornense 2 2 M. hiberniae M. holsaticum M. kumamotonense 1 M. mucogenicum M. negraskense 1 M. neoaurum 1 1 M. nonchromogenicum M. noviomagense 1 1 M. novocastrense 2 2 M. palustre 1 M. phlei M. ratisbonense M. senegalense 1 1 M. sherrisii 1 3 M. shimoidei M. smegmatis M. sphagni M. terrae Cpx Terrae-mucogenicum-ratisbonense M. triplex M. triviale 1 Andere bacteriën Corynebacterium (andere familie) 7 4 Totaal myco_b_t4 6