VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION

VALIDATIEPLAN PLAN DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique IMETFLVVT058 Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders Screening pour des substances antibactériennes dans les aliments pour animaux Agardiffusie 7 platen (Bioautografisch systeem) Diffusion en gélose 7 plaques (Système bioautographique) Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Dierenvoeders Aliments pour animaux Totaal Totale Secundair Secondaire Minivalidatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie Fonction: Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Datum Date: Nvt Naam Nom: Mandy Lekens Functie Fonction: Labomanager Datum Date: 092002 Handtekeningen Signatures: (get.) Handtekeningen Signatures: (get.) LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 20120315 1/40

Stap Phase 1: Bepaling van het toepassingsgebied Déterminer le champs d application De methode moet geschikt zijn voor de kwalitatieve screening op antibacteriële activiteit in dierenvoeders (aanvullende diervoeders, volledige diervoeders en voormengsels). Stap Phase 2: Doel en statuut van de analysemethode Le but et status de la méthode d analyse Kwalitatieve screeningsmethode, interne (inhouse) methode gebaseerd op Bepaling van antimicrobiële activiteit met behulp van een 5platen bioautografisch systeem (CCL, Veghel, 1993). Stap Phase 3: Keuze validatieparameters Choisir les paramètres à valider Voor deze methode dienen minimaal de volgende prestatiekenmerken te worden bepaald: specificiteit / selectiviteit, toepasbaarheid / robuustheid / stabiliteit en detectievermogen CCβ. Daarnaast wordt ook de uitbreiding van de referentiemethode van 5 platen naar 7 platen toegelicht. Stap Phase 4: Externe eisen voor validatieparameters Des exigences externes pour les paramètres à valider Nvt. Stap Phase 5: Keuze van de monsters Le choix d échantillons De geschiktheid van de methode zal getest worden op (gedopeerde) routinemonsters die een grote gelijkenis met de meest voorkomende praktijkmonsters vertonen. LAB 00 P 180 F 002 Template validatieplan Modèle plan de validation v.01 20120315 2/40

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption IMETFLVVT058 Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders Screening pour des substances antibactériennes dans les aliments pour animaux Agardiffusie 7 platen (Bioautografisch systeem) Diffusion en gélose 7 plaques (Système bioautographique) Dierenvoeders Aliments pour animaux 2013/11/20 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 3/40

Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie paragraaf 4 De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Zie paragraaf 4 Historiek validatie Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen 01 09/2002, M. Lekens Opsteller initiële versie Volledige tekst 02 11/2013, M. Vanbrabant Voorbereiding publicatie + NC s BELAC audit (incubatietemperatuur, activiteit van enzymen en toelichting CCβ) Toevoeging validatieplan en overzicht validatierapport + historiek + extra validatiegegevens LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 4/40

VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique IMETFLVVT058 Screeningstest antibacteriële stoffen in dierenvoeders Screening pour des substances antibactériennes dans les aliments pour animaux Agardiffusie 7 platen (Bioautografisch systeem) Diffusion en gélose 7 plaques (Système bioautographique) Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Dierenvoeders Aliments pour animaux Totaal Totale Secundair Secondaire Minivalidatie validation minimale Mieke Vanbrabant Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Responsable section additifs Naam Nom: Mieke Vanbrabant Functie Fonction: Verantwoordelijke sectie toevoegingsmiddelen Datum Date: 20131120 Veerle Cloet: laborant Annemie Voets: laborant Martine Bral: laborant Nele Maris: laborant Start Début: 200201 Einde Fin: 201311 Naam Nom: Mandy Lekens Functie Fonction: Labomanager Datum Date: 20131206 Handtekeningen Signatures: (get.) Handtekeningen Signatures: (get.) Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P 00 180. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 5/40

Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation... 7 1 Doel en toepassingsgebied... 7 2 Analisten... 7 3 Toelichting uitbreiding aantal platen bioautografisch systeem (sept. 2002)... 7 3.1 ATCC 10240... 8 3.2 B. cereus LMG 18365... 8 4 Prestatiekenmerken... 9 4.1 Toepasbaarheid / robuustheid / stabiliteit (2002)... 9 4.1.1 Bereiding en controle entsuspensies... 9 4.1.1.1 Micrococcus luteus ATCC 9341... 10 4.1.1.2 Micrococcus luteus ATCC 10240... 10 4.1.1.3 Bacillus cereus LMG 18365 (tetracycline resistent)... 10 4.1.1.4 Bacillus subtilis BGA sporensuspensie... 11 4.1.1.5 Vergelijking entsuspensies IMETFLVVT058 met referentiemethode... 11 4.1.2 Concentratie en houdbaarheid trimethoprimoplossing... 12 4.1.2.1 Hoeveelheid TMP per ml voedingsbodem... 12 4.1.2.2 Houdbaarheid TMP oplossing.... 14 4.1.3 Controlestandaarden... 14 4.1.3.1 Remzones controlestandaarden per plaat... 14 4.1.3.2 Overzicht gemiddelde remzones tylosine en tetracycline... 17 4.1.4 Overentingstermijn stamculturen en houdbaarheid entsuspensies... 18 4.1.5 Kwaliteitscontrole... 20 4.1.5.1 Solventblanco... 20 4.1.5.2 Controlestandaarden... 20 4.1.6 Resultaatinterpretatie en weergave... 21 4.1.7 Reproduceerbaarheid (Inter)... 21 4.2 Selectiviteit / specificiteit (2002 + 2013)... 22 4.2.1 Rempatronen (2002)... 22 4.2.1.1 Rempatronen van enkele zuivere antibacteriële stoffen in methanol/water (70/30)... 22 4.2.1.2 Rempatronen van enkele monsterextracten met gekend gehalte antibacteriële stof... 23 4.2.1.3 Rempatronen van enkele gedopeerde voederextracten met gekend gehalte antibacteriële stof (op detectieniveau)... 23 4.2.2 Effect van sporenelementen (2002)... 24 4.2.3 Temperatuur broedstoof tijdens incubatie (juni 2013, NM)... 26 4.3 CCβ (juni 2013)... 28 4.3.1 Definitie CCβ... 28 4.3.2 Vergelijking MICs IMETFLVVT058 met referentiemethode... 28 4.3.3 Detectielimieten IMETFLVVT058... 29 5 Werking enzymen screening antibiotica (βlactamase en penicillinase)... 30 5.1 Test werking enzymen (nov. 2013, AV)... 30 5.2 Interpretatie resultaten... 32 5.3 Overzicht grootte remzones met/zonder enzymen... 33 5.4 Overzicht foto s 7 platen met/zonder enzymen... 34 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 6/40

Samenvatting validatiegegevens Résumé des données de validation 1 Doel en toepassingsgebied Kwalitatieve screening van de aanwezigheid van stoffen met antibacteriële activiteit in dierenvoeders met behulp van een agardiffusiemethode bestaande uit een 7 platen bioautografisch systeem (CCL, Veghel). Voor bacterieel sterk verontreinigde monsters is deze methode niet bruikbaar. 2 Analisten Het validatieonderzoek wordt uitgevoerd onder toezicht van sectieverantwoordelijken Mandy Lekens (2002) / Mieke Vanbrabant (2013) door de volgende analisten: Veerle Cloet (VC) (2002) Annemie Voets (AV) (2002 + 2013) Martine Bral (MB) (2002) Nele Maris (NM) (2013) 3 Toelichting uitbreiding aantal platen bioautografisch systeem (sept. 2002) Referentiemethode IMETFLVVT058 B. subtilis BGA ph 6 B. subtilis BGA ph 6 B. subtilis BGA ph 8 B. subtilis BGA ph 8 B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP ATCC 9341 ph 6 ATCC 9341 ph 6 ATCC 9341 ph 8 ATCC 9341 ph 8 ATCC 10240 ph 6,5 B. cereus LMG 18365 ph 6,5 (tetracycline resistent) 5 platen 7 platen Conventie: De grootte van remmingszones of remzones wordt in de regel weergegeven door een absoluut getal, variërend van 120 tot meer dan 260. Dit getal is het resultaat van een 7,5 maal vergroting van de remzone in mm om een ponsgat met een diameter van 13,3 mm. Een andere manier om de grootte van remzones weer te geven is het gebruik van volgende notatie: remzone < 120 remzone 120140 + remzone 140170 ++ remzone 170200 +++ remzone 200230 ++++ remzone 230260 +++++ remzone > 260 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 7/40

3.1 ATCC 10240 Het microorganisme ATCC 10240 wordt in het FLVVT gebruikt bij de kwantitatieve bepaling van zinkbacitracine (IMETFLVVT047). Uit vooronderzoek van gedopeerde stalen bleek dat het gebruik van deze plaat, naast de opsporing van bacitracine, ook de detectie van avilamycine vergemakkelijkt. Door gebruik van deze plaat bij de screeningsmethode vergroot bijgevolg de kans op detectie van deze producten. Bacitracine Bacitracine Bacitracine Avilamycine Avilamycine Conc (mg/kg) Staal nr. 70 3754/01 3754/01 3754/01 5 10 3274/01 6460/01 B. subtilis BGA ph6 156 149 147 145 159 B. subtilis BGA ph8 132 122 B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP 140 134 131 142 155 ATCC 9341 ph6 170 165 168 162 170 ATCC 9341 ph8 136 142 144 ATCC 10240 ph 6,5 210 200 215 192 209 3.2 B. cereus LMG 18365 Het microorganisme B. cereus LMG 18365 is resistent voor antibiotica van de groep tetracyclines. Het gebruik van een plaat beënt met dit microorganisme bij de routinescreening laat toe om eventueel aanwezige tetracyclines op te sporen. Verdwijnen of verkleinen van remzones, wel aanwezig op de plaat beënt met B. subtilis BGA ph 6 (gevoeligste testplaat voor tetracyclines), op de plaat B. cereus LMG 18365 kan een indicatie zijn voor de aanwezigheid van antibiotica van de groep tetracyclines. Analyse van een tetracyclinestandaard (1µg/ml, bereid zoals beschreven in IMETFLVVT058) levert de volgende gegevens op (zie ook 4.1.3): Diameter remzone tetracyclinestandaard (1 µg/ml) Plaat B. subtilis BGA ph 6 B. cereus LMG 18365 Uitvoerder 1 Uitvoerder 2 Uitvoerder 1 Uitvoerder 2 200 193 196 187 211 196 205 201 198 193 201 196 Gemiddelde 197 199 Stdev 8,0 4,2 RSD (%) 4,1 2,1 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 8/40

4 Prestatiekenmerken 4.1 Toepasbaarheid / robuustheid / stabiliteit (2002) 4.1.1 Bereiding en controle entsuspensies Validatie van de bereiding en controle van de entsuspensies met als doelstelling: a. Aantonen dat met de werkwijze vermeld in de methode een reproduceerbaar aantal kve (kolonievormende eenheden) per ml voedingsbodem bekomen wordt. b. Door middel van absorptiemetingen bij 650 nm en kiemtellingen van de verschillende entsuspensies een verband leggen tussen gemeten absorptie en aantal kiemen zodat in de praktijk een snelle controle van de verschillende entsuspensies mogelijk wordt. Om een zo uitgebreid mogelijke gegevensreeks te krijgen, werden de verschillende entsuspensies ¼ serieel verdund met fysiologische zoutoplossing. Van elk van de bekomen verdunningen werd vervolgens een decimale verdunningsreeks gemaakt door telkens 1 ml in 9 ml fysiologische zoutoplossing te brengen. Van al de bekomen oplossingen werd de absorptie t.o.v. fysiologische zoutoplossing gemeten bij 650 nm. Vervolgens werd 1 ml van de verdunningsreeksen in duplo in steriele petriplaten gebracht, waarna ca. 15 ml tot 45 C afgekoelde plate count agar (PCA, R0580) werd toegevoegd. Na mengen en stollen van de agar werden de platen 1824 uur bebroed bij 37 ± 1 C. Daarna werden de kolonies van de bebroede duploplaten van de laagste verdunning, die 30 tot 300 kolonies bevatten, geteld. Het aantal kve/ml van de suspensie kan dan berekend worden door het gemiddelde van het aantal kolonies op de twee platen te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor. De beschreven test werd uitgevoerd door twee personen. Drie afzonderlijke slants van de stamculturen (bekomen zoals beschreven in IMETFLVVT058) van ATCC 9341, ATCC 10240 en B. cereus LMG 18365 werden door dezelfde persoon gesuspendeerd in 3 x 4 ml fysiologische zoutoplossing. Vervolgens werd de test uitgevoerd zoals hoger beschreven (resultaten kiemtelling entsuspensie in tabel weergegeven). De relatie tussen het aantal kiemen in deze suspensies en de gemeten absorpties bij 650 nm wordt weergegeven in bijlage. Voor B. subtilis BGA werd nagegaan of het gemiddeld aantal kve/ml van de sporensuspensie voldeed aan de gegevens vermeld op het bijgevoegde attest. Het attest is tevens terug te vinden in bijlage. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 9/40

4.1.1.1 Micrococcus luteus ATCC 9341 Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV (meting 1) 64 x 10 6 69 x 10 6 71 x 10 6 69 x 10 6 73 x 10 6 75 x 10 6 7 x 10 7 7 x 10 7 7 x 10 7 06/01/2002 06/01/2002 06/01/2002 VC (meting 2) 42 x 10 6 56 x 10 6 48 x 10 6 50 x 10 6 46 x 10 6 48 x 10 6 5 x 10 7 5 x 10 7 5 x 10 7 07/01/2002 07/01/2002 07/01/2002 Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat indien bij 1/10 verdunning van de entsuspensie een absorptie wordt gemeten tussen 0,30 en 0,60, de entsuspensie zelf 5.10 7 1.10 8 kiemen per ml bevat. Bij bereiding van nieuwe entsuspensie kan dus via absorptiemetingen het aantal kiemen gecontroleerd worden. 4.1.1.2 Micrococcus luteus ATCC 10240 Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV (meting 1) 296 x 10 5 271 x 10 5 253 x 10 5 289 x 10 5 294 x 10 5 287 x 10 5 3 x 10 7 3 x 10 7 3 x 10 7 09/01/2002 09/01/2002 09/01/2002 VC (meting 2) 40 x 10 6 45 x 10 6 47 x 10 6 38 x 10 6 32 x 10 6 54 x 10 6 4 x 10 7 4 x 10 7 5 x 10 7 09/01/2002 09/01/2002 09/01/2002 Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat indien bij 1/10 verdunning van de entsuspensie een absorptie wordt gemeten tussen 0,25 en 0,50, de entsuspensie zelf 1.10 7 5.10 7 kiemen per ml bevat. Bij bereiding van nieuwe entsuspensie kan dus via absorptiemetingen het aantal kiemen gecontroleerd worden. 4.1.1.3 Bacillus cereus LMG 18365 (tetracycline resistent) Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV (meting 1) 243 x 10 5 246 x 10 5 259 x 10 5 237 x 10 5 257 x 10 5 261 x 10 5 2 x 10 7 3 x 10 7 3 x 10 7 13/01/2002 13/01/2002 13/01/2002 VC (meting 2) 47 x 10 6 55 x 10 6 56 x 10 6 49 x 10 6 42 x 10 6 58 x 10 6 5 x 10 7 5 x 10 7 6 x 10 7 13/01/2002 13/01/2002 13/01/2002 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 10/40

Uit deze gegevens kan geconcludeerd worden dat indien bij 1/10 verdunning van de entsuspensie een absorptie wordt gemeten tussen 0,25 en 0,50, de entsuspensie zelf 1.10 7 5.10 7 kiemen per ml bevat. Bij bereiding van nieuwe entsuspensie kan dus via absorptiemetingen het aantal kiemen gecontroleerd worden. 4.1.1.4 Bacillus subtilis BGA sporensuspensie Deze sporensuspensie bevat volgens het bijgevoegde attest 1.10 7 kve/ml (met als grenzen 8.10 6 tot 5.10 7 kve/ml). Van deze suspensie werd een decimale verdunningsreeks uitgeplaat. Kiemtelling entsuspensie Uitvoerder Resultaat plaat 1 Resultaat plaat 2 Gemiddelde kve/ml Datum AV 30 x 10 5 35 x 10 5 43 x 10 5 44 x 10 5 30 x 10 5 32 x 10 5 4 x 10 6 3 x 10 6 4 x 10 6 06/01/2002 06/01/2002 06/01/2002 MB 46 x 10 5 50 x 10 5 35 x 10 5 35 x 10 5 46 x 10 5 46 x 10 5 4 x 10 6 5 x 10 6 4 x 10 6 07/01/2002 07/01/2002 07/01/2002 Gezien de inhoud van een ampul (volume 2 ml) wordt toegevoegd aan 4 ml fysiologische zoutoplossing, bedraagt het totale volume 6 ml met daarin, volgens het attest, 2.10 7 kve wat overeenkomt met 3.10 6 kve/ml (theoretische grenzen 2,7 10 6 tot 1,7 10 7 kve/ml, zie tabel). Rekening houdend met de verdunningsfactor voldoet de sporensuspensie aan het attest gezien het gemiddeld aantal kve/ml 3.10 6 tot 5.10 6 bedraagt. Minimum Gemiddelde Maximum Attest (kve/ml) 8.10 6 10.10 6 50.10 6 Attest (kve/2 ml) 16.10 6 20.10 6 100.10 6 Na verdunning (kve/6 ml) 16.10 6 20.10 6 100.10 6 Na verdunning (kve/ml) 2,7.10 6 3,3.10 6 17.10 6 4.1.1.5 Vergelijking entsuspensies IMETFLVVT058 met referentiemethode ATCC 9341: KDLL: 10 5 10 6 kve per ml voedingsbodem IMETFLVVT058: 0,1 ml toevoegen van 5.10 7 1.10 8 kve/ml per 100 ml bodem geeft 5.10 4 1.10 5 kve per ml bodem. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 11/40

M.luteus ATCC 10240; B. cereus TC resistent: IMETFLVVT058: 0,1 ml toevoegen van 1.10 7 5.10 7 kve/ml per 100 ml bodem geeft 1.10 4 5.10 4 kve per ml bodem. B. subtilis BGA sporensuspensie: KDLL: 10 4 10 5 kve per ml voedingsbodem IMETFLVVT058: 0,3 ml toevoegen van 3 10 6 kve/ ml per 100 ml bodem geeft 9 10 3 kve per ml bodem Indien men onder de omstandigheden zoals vermeld in IMETFLVVT058 de entsuspensies maakt, bekomt men een reproduceerbare maat voor het gehalte aan kiemen. Controle van het aantal kiemen in de entsuspensie kan gebeuren door het maken van een 1/10 verdunning van de entsuspensie en meting van absorptie van deze verdunning (t.o.v. fysiologische zoutoplossing) bij 650 nm. Bij afwijkende absorptiemetingen moet de entsuspensie hetzij verdund (bij te hoge absorptie), hetzij opnieuw bereid worden (beschreven in IMETFLVVT058). Toevoegen van 0,3 ml B. subtilis BGA entsuspensie en 0,1 ml en B. cereus entsuspensie per 100 ml voedingsbodem levert een reproduceerbaar aantal kiemen per ml voedingsbodem op. Mogelijke schommelingen hierop worden opgevolgd via de controlestandaarden tylosine en tetracycline (zie 4.1.3). 4.1.2 Concentratie en houdbaarheid trimethoprimoplossing Van de gebruikte trimethoprimoplossing werden de houdbaarheid en de optimale toe te voegen hoeveelheid per 100 ml voedingsbodem bepaald. 4.1.2.1 Hoeveelheid TMP per ml voedingsbodem Om zo groot en zo scherp mogelijke remmingszones op de plaat met TMP toevoeging te verkrijgen, werden verschillende hoeveelheden TMP toegevoegd per ml bodem van de plaat beënt met B. subtilis BGA ph 7,2 (0,07 µg; 0,14 µg; 0,28 µg en 0,56 µg.) Vervolgens werden 6 maal de controlestandaarden tylosine (2 µg/ml) en tetracycline (1 µg/ml) en een sulfadimidinestandaard (0,3 µg/ml) opgebracht. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 12/40

Aantal µg TMP per ml voedingsbodem Tylosine Tetracycline Sulfadimidine Opmerkingen 0,07 200 198 202 203 196 199 154 153 151 149 152 150 Gemiddelde 200 152 Stdev 2,6 1,9 RSD (%) 1,3 1,2 0,14 209 213 211 210 205 215 161 163 159 165 162 161 121 124 122 131 128 130 135 129 126 Gemiddelde 211 162 130 Stdev 3,4 2,0 3,1 RSD (%) 1,6 1,3 2,4 0,28 214 211 210 216 209 210 158 163 160 162 165 162 142 145 150 143 147 152 Gemiddelde 212 162 147 Stdev 2,7 2,4 3,9 RSD (%) 1,3 1,5 2,7 0,56 216 211 212 215 210 211 163 162 165 159 161 160 143 146 150 149 147 151 Gemiddelde 21 162 148 Stdev 2, 2,2 2,9 RSD (%) 1,1 1,3 2,0 controle: kleine, wazige zones sulfa: niet altijd te detecteren controle: zones groter, redelijk scherp sulfa: zones niet duidelijk controle: zones even groot, scherper sulfa: duidelijke zones geen verbetering zonegrootte of scherpte Gezien door toevoeging van meer dan 0,28 µg TMP per ml voedingsbodem geen aanzienlijke verbetering van de remmingszones optrad en de zones bekomen bij 0,14 µg/ml minder scherp waren, wordt geopteerd voor toevoeging van 0,28 µg TMP per ml voedingsbodem LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 13/40

4.1.2.2 Houdbaarheid TMP oplossing. De houdbaarheid van de TMP oplossing werd bij 4±4 C vastgesteld op 1 maand. Hiertoe werd de analyse uitgevoerd met een 1 maand oude TMP oplossing en met een vers bereide TMP oplossing (gegevens cf. validatie controlestandaarden A. Voets). De bekomen resultaten worden hieronder weergegeven en geven aan dat er geen significante verschillen bestaan tussen de bekomen remzones met de oude en de nieuwe oplossing. Validatiegegevens van de gebruikte controlestandaarden worden weergegeven in 4.1.3. Plaat Tylosine Tetracycline nieuwe TMP TMP 1 maand oud nieuwe TMP TMP 1 maand oud B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP 200 213 208 210 222 210 217 207 213 209 206 212 163 161 172 163 158 161 Gemiddelde 211 211 163 162 Stdev 7,1 4,1 4,8 2,5 RSD (%) 3,4 2,0 2,9 1,5 ttest 0,96 0,71 Ftest 0,25 0,18 165 159 164 160 161 164 4.1.3 Controlestandaarden In de referentiemethode wordt gebruikgemaakt van de controlestandaarden tylosine (5,0 ± 0,2 µg/ml) en natriumsulfadimidine (5,0 ± 0,2 µg/ml). In IMETFLVVT058 wordt de natriumsulfadimidinestandaard vervangen door een tetracyclinestandaard om zo antibiotica van de groep tetracyclines te kunnen opsporen. Van de gebruikte concentraties van de controlestandaarden (tylosine 2 µg/ml en tetracycline 1 µg/ml) werd aangetoond dat ze voldoende grote remzones geven. 4.1.3.1 Remzones controlestandaarden per plaat De validatie van het gebruik van de controlestandaarden werd uitgevoerd op 14/01/2002 en 15/01/2002 door AV en VC. De controlestandaarden worden bereid volgens IMETFLVVT058 Op elk van de 7 platen (beënt met vers bereide entsuspensie) worden 6 maal de controlestandaarden aangebracht (100 µl per ponsgat) Voor de plaat waaraan TMP wordt toegevoegd, wordt vers bereide TMP oplossing gebruikt LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 14/40

Plaat M. Luteus ATCC 9341 ph 6 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 175 179 172 166 173 165 183 176 181 171 170 166 143 147 145 142 148 150 Gemiddelde 172 175 146 147 Stdev 5,4 6,7 3,1 4,5 RSD (%) 3,1 3,8 2,1 3,0 153 150 148 141 143 145 Plaat M. Luteus ATCC 9341 ph 8 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 237 252 243 251 245 233 260 238 251 242 253 237 Gemiddelde 244 247 Stdev 7,5 9,2 RSD (%) 3,1 3,7 Plaat M. Luteus ATCC 10240 ph 6,5 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 226 236 247 224 234 228 232 221 231 227 237 244 163 166 151 155 160 161 Gemiddelde 233 232 159 160 Stdev 8,5 7,9 5,5 5,2 RSD (%) 3,6 3,4 3,4 3,2 158 164 160 167 162 160 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 15/40

Plaat Bacillus subtilis BGA ph 6 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 124 129 132 125 134 131 130 128 136 125 130 126 200 193 196 187 211 196 Gemiddelde 128 129 197 199 Stdev 3,9 3,9 8,0 4,2 RSD (%) 3,0 3,0 4,1 2,1 205 201 198 193 201 196 Plaat Bacillus subtilis BGA ph 8 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 193 186 190 201 198 203 186 197 207 198 203 191 Gemiddelde 195 197 Stdev 6,6 7,7 RSD (%) 3,4 3,9 Plaat Bacillus subtilis BGA ph 7,2 + TMP Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 200 213 208 210 222 210 216 208 212 203 211 225 163 161 172 163 158 161 Gemiddelde 211 213 163 160 Stdev 7,1 7,5 4,8 7,6 RSD (%) 3,4 3,5 2,9 4,7 169 159 163 146 160 161 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 16/40

Plaat Bacillus cereus TC resistent ph 6,5 Diameter remzone tylosine (2 µg/ml) Diameter remzone tetracycline (1 µg/ml) V C V C 133 140 134 130 132 130 135 130 127 139 130 127 Gemiddelde 133 131 Stdev 3,7 4,8 RSD (%) 2,8 3,6 4.1.3.2 Overzicht gemiddelde remzones tylosine en tetracycline Uitgaande van bovenstaande gegevens kunnen per plaat voor beide controlestandaarden gemiddelde remzones en bijhorende standaarddeviaties worden berekend: Plaat/Kiem Bacillus subtilis BGA ph 6 Bacillus subtilis BGA ph 8 Bacillus subtilis BGA ph 7,2 M. Luteus ATCC 9341 ph 6 M. Luteus ATCC 9341 ph 8 M. Luteus ATCC 10240 ph 6,5 B. cereus TC resistent ph 6,5 Remzone Tylosine (2 µg/ml) Stdev 128 3,78 196 6,89 212 7,06 173 5,95 245 8,22 232 7,84 132 4,18 Remzone Tetracycline (1 µg/ml) Stdev 198 6,2 161 6,29 147 4,38 160 5,08 De tylosine referentiestandaard zal op alle platen worden aangebracht (beschreven in IMETFLVVT 058). De tetracycline referentiestandaard wordt in methode IMETFLVVT058 enkel op de platen beënt met Bacillus cereus TC resistent en met Bacillus subtilis BGA ph 6 (gevoeligste testorganisme) aangebracht, dit ter indicatie van mogelijk aanwezige tetracyclines. De bekomen gemiddelde remzones en de bijhorende standaardafwijkingen kunnen gebruikt worden voor de kwaliteitscontrole van de methode (zie 4.1.5) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 17/40

4.1.4 Overentingstermijn stamculturen en houdbaarheid entsuspensies Volgens de officiële EU agardiffusiemethoden bedraagt de overentingstermijn van stamculturen 4 weken. Gezien zowel ATCC 9341 als ATCC 10240 gebruikt worden voor respectievelijk de kwantitatieve bepaling van tylosine en bacitracine (beide geaccrediteerde agardiffusiemethoden) ligt hun overentingstermijn vast op 4 weken. De overentingstermijn van B. cereus LMG 18365 werd vastgelegd op 4 weken aangezien werd aangetoond dat met een kiem van een maand oud vergelijkbare resultaten werden verkregen als met een nieuwe pas overgeënte kiem (resultaten in tabel weergegeven). Ook van de enstuspensies werd de houdbaarheidstermijn bepaald. Hiertoe werd de stamcultuur (bereid zoals beschreven in IMETFLVVT058) afgespoeld in 4 ml fysiologische zoutoplossing. Vervolgens werden de controlestandaarden geanalyseerd met deze vers bereide entsuspensie (gegevens cf. validatie controlestandaarden, AV). De entsuspensie werd vervolgens een maand bewaard bij 4±4 C, waarna de analyse werd herhaald en de bekomen remzones met elkaar werden vergeleken. ATCC 9341 ATCC 10240 Tylosine nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud ph 6 175 169 179 175 172 168 166 171 173 173 165 167 Gemiddelde Stdev RSD(%) 172 5,4 3,1 ph 8 237 252 243 251 245 233 Gemiddelde Stdev RSD(%) Gemiddelde Stdev RSD(%) 244 7,5 3,1 226 236 247 224 234 228 233 8,5 3,6 171 3,1 1,8 243 236 250 246 244 251 245 5,4 2,2 225 232 229 243 235 224 231 7,1 3,1 Tetracycline nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud 143 143 147 145 145 144 142 145 148 147 150 151 146 3,1 2,1 163 166 151 155 160 161 159 5,5 3,4 146 2,9 2,0 158 160 165 155 159 161 160 3,3 2,1 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 18/40

B. cereus LMG 18365 Gemiddelde Stdev RSD(%) nieuwe entsuspensie van verse stam 133 140 134 130 132 130 133 3,7 2,8 Tylosine Entsuspensie 1 maand oud 135 129 137 133 132 130 133 3,0 2,3 nieuwe entsuspensie van stam 1 maand oud 132 137 133 130 128 133 133 3,9 2,9 Tetracycline alle platen Hoewel sommige entsuspensies eventueel een langere houdbaarheidstermijn kunnen hebben, wordt per definitie de houdbaarheid van de bereide entsuspensies beperkt tot 1 maand. B. subtilis BGA ph 6 124 129 132 125 134 131 Gemiddelde Stdev RSD(%) Tylosine nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud 126 128 126 132 131 129 128 3,9 3,0 ph 8 193 186 190 201 198 203 Gemiddelde Stdev RSD(%) ph 7,2 + TMP Gemiddelde Stdev RSD(%) 195 6,6 3,4 200 213 208 210 222 210 211 7,1 3,4 129 2,5 1,9 189 192 193 203 196 201 196 5,4 2,8 207 201 215 209 220 218 212 7,3 3,4 Tetracycline nieuwe entsuspensie entsuspensie 1 maand oud 200 200 193 205 196 195 187 197 211 187 196 194 197 8,0 4,1 163 161 172 163 158 161 163 4,8 2,9 196 6,1 3,1 169 165 164 157 160 161 163 4,2 2,6 De aangekochte ampul entsuspensie van Bacillus subtilis BGA heeft volgens het bijgevoegde attest een houdbaarheid van 1 jaar. De gebruikte entsuspensie voor IMETFLVVT058 wordt bereid door LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 19/40

aan deze ampul 4 ml fysiologische zoutoplossing toe te voegen. Voor deze bereide suspensie werd tevens een houdbaarheid van 1 maand bij 4±4 C aangetoond. 4.1.5 Kwaliteitscontrole 4.1.5.1 Solventblanco De solventblanco wordt meegenomen bij elke analyse en bestaat erin dat 100 µl methanol/water (70/30) in een ponsgaatje wordt gebracht. In de referentiemethode moet een analyse herhaald worden indien voor de blanco een remzone > 11 mm diameter wordt bekomen voor een ponsgat met diameter 9 mm. In methode IMETFLVVT058 geeft het toepassen van het criterium op een ponsgat van 13,3 mm een maximale remzone van 15,3 mm, of rekening houdend met de afleesapparatuur (x 7,5) een waarde van 114,75. In de methode wordt de maximale zonegrootte voor de blanco vastgelegd op 115. 4.1.5.2 Controlestandaarden Door bereiding van de entsuspensie volgens IMETFLVVT058 en het toevoegen van steeds dezelfde hoeveelheid entsuspensie per 100 ml voedingsbodem, wordt er gestreefd naar een reproduceerbaar aantal kiemen per ml voedingsbodem, wat onder andere kan opgevolgd worden aan de hand van de grootte van de remzones van de controlestandaarden. In de referentiemethode moet de analyse herhaald worden wanneer de voor de controleoplossingen gevonden remzone buiten het gebied valt, gevormd door de gemiddelde remzone ± 3x de standaarddeviatie voor de betreffende controleoplossing en plaat. Toepassing van dit criterium op de waarden bekomen bij validatie van de controlestandaarden levert de volgende gegevens op: Maximale afwijking controlestandaarden, rekening houdend met de standaarddeviatie Tylosine (2 µg/ml) Tetracycline (1 µg/ml) Plaat/Kiem min gem max min gem max Bacillus subtilis BGA ph 6 Bacillus subtilis BGA ph 8 Bacillus subtilis BGA ph 7,2 M. Luteus ATCC 9341 ph 6 M. Luteus ATCC 9341 ph 8 M. Luteus ATCC 10240 ph 6,5 B. cereus TC resistent ph 6,5 117 175 190 155 220 209 120 128 196 212 173 245 232 132 139 217 233 191 270 256 145 179 198 217 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 20/40

De bekomen maximale afwijkingen blijken goed benaderd te kunnen worden door te stellen dat de gemeten remzone van de controlestandaarden maximaal 10 % mag afwijken van de gemiddelde waarde. Maximale afwijking controlestandaarden, berekend als 10 % van gemiddelde waarde Tylosine (2 µg/ml) Tetracycline (1 µg/ml) Plaat/Kiem min gem max min gem max Bacillus subtilis BGA ph 6 Bacillus subtilis BGA ph 8 Bacillus subtilis BGA ph 7,2 M. Luteus ATCC 9341 ph 6 M. Luteus ATCC 9341 ph 8 M. Luteus ATCC 10240 ph 6,5 B. cereus TC resistent ph 6,5 115 176 191 156 221 209 119 128 196 212 173 245 232 132 141 216 233 190 270 255 145 178 198 218 4.1.6 Resultaatinterpretatie en weergave Referentie: Een resultaat wordt als positief beschouwd wanneer er een remzone 15 mm voor een ponsgat van 9 mm wordt bekomen. IMETFLVVT058: Toepassen van dit criterium op methode IMETFLVVT058 levert een positief resultaat wanneer er een remzone 13,3 + 6 = 19,3 mm wordt bekomen of (x 7,5) een waarde van 144,75. Het criterium vermeld in IMETFLVVT058 beschouwd een resultaat als positief als de remzone > 140 of de remrand 15 en dit omwille van de zeer kleine remzones die soms worden verkregen bij lage concentraties van remmende stoffen (zie ook 0). Details van resultaatweergave worden vermeld in IMETFLVVT058. 4.1.7 Reproduceerbaarheid (Inter) Er werd nog niet deelgenomen aan ringtesten. In afwachting hiervan wordt er intern een tweedelijnscontrole uitgevoerd, welke moet voldoen aan de aanvaardingscriteria. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 21/40

4.2 Selectiviteit / specificiteit (2002 + 2013) 4.2.1 Rempatronen (2002) De rempatronen, zichtbaar op de platen van het bioautografisch systeem, verschillen al naargelang het zuivere standaarden in oplossing of reële antibioticumbevattende monsters betreft. Bovendien kunnen omwille van matrixeffecten de waargenomen rempatronen bij reële monsters licht wijzigen. Bij poging tot identificatie van een bepaald antibioticum, moet dus de nodige voorzichtigheid in acht genomen worden. Ter illustratie zijn hier rempatronen van enkele standaarden opgelost in methanol/water (70/30), alsook van enkele reële monsters weergegeven. Ook gegevens van op detectieniveau gedopeerde voeder en vleesextracten worden weergegeven. 4.2.1.1 Rempatronen van enkele zuivere antibacteriële stoffen in methanol/water (70/30) B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC 10240 B. cereus LMG 18365 ph 7,2 + µg/ml ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Tylosine 2 ++ +++ ++ +++ +++ ± 3 + +++ +++ ++ ++++ +++ ± Virginiamycine 3 +++ ++++ +++ ± Oxytetracycline 3 +++ + +++ ++ ++ Avoparcine 5 ++ + ++ + + + + Penicilline 1 ++++ ++++ +++++ +++++ +++++ +++ +++ Lincomycine 5 + ++ +++++ + Flavofosfolipol 1 + 5 ++ + ++++ + Salinomycine 3 +++ ++ ++ + ++ Bacitracine 1 ++ ++ 5 ++ ++ Monensin 5 ++/+++ + + + ++ Lasalocid 5 ++ / + +++ ++ ++ LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 22/40

4.2.1.2 Rempatronen van enkele monsterextracten met gekend gehalte antibacteriële stof B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC 10240 B. cereus LMG 18365 mg/kg ph 6 ph 8 ph 7,2 + TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Lincomycine 19 + + ++ ++ +++ ++ +/ Flavofosfolipol 5 ++ ++ + Salinomycine 30 ++ ++ +++ + + + + Bacitracine 70 + ± + +++ +++ +/ Monensin 80 ++ ++ + + + 5 ± + +/ Avilamycine 10 + + ++ +++ +++ + Tylosine 100 +++ ++++ +++ ++++ ++++ ++++ + Tetracycline 250 +++++ ++++ +++++ ++++ ++++ ++++ Lasalocid 75 +++ ++ +++ + +++ +++ ++ 4.2.1.3 Rempatronen van enkele gedopeerde voederextracten met gekend gehalte antibacteriële stof (op detectieniveau) B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC 10240 B. cereus LMG 18365 µg/ml ph 6 ph 8 ph 7,2 + TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Penicilline 0,01 + Bacitracine 0,6 + + Avoparcine 0,2 + Flavomycine 0,4 + + Lincomycine 0,3 + Tylosine 0,2 + Spiramycine 0,4 + Tetracycline 0,5 + + Sulfadimidine 0,3 + Virginiamycine 0,2 + LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 23/40

Samenvattend kan volgend overzicht opgesteld worden (opgenomen in IMETFLVVT058): Produkt of ~ klasse Virginiamycine Penicillines Macroliden Vb. Tylosine Lincomycine Spiramycine. Tetracyclines Avoparcine Salinomycine Monensin Flavomycine Sulfonamides Bacitracine Avilamycine Gevoeligste plaat ATCC 9341 ph 6 ATCC 9341 ph 8 B. subtilis BGA ph 6 B. subtilis BGA ph 8 en B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP B. subtilis BGA ph 7,2 + TMP ATCC 10240 4.2.2 Effect van sporenelementen (2002) Uit de literatuur blijkt dat sommige sporenelementen kunnen interfereren met de bepaling van antibacteriële activiteit, in die zin dat ze ook remzones op de verschillende platen zouden kunnen veroorzaken. Gezien sporenelementen in bepaalde concentraties inherent zijn aan bepaalde voeders werd volgende proef uitgevoerd om dit effect te kunnen inschatten. Gebaseerd op het maximaal toegelaten gehalte aan sporenelementen in volledig diervoeder of dagrantsoen (MB 12/2/99, update 2002) werd volgende proef opgezet. Van zinkchloride, kopersulfaat en mangaansulfaat werden oplossingen bereid met een concentratie van 1000 mg/l in methanol/water (70/30). Vervolgens werden deze oplossingen verder ½ serieel verdund tot een eindconcentratie van 31,25 mg/l. Voor ijzersulfaat bedroeg de hoogste concentratie 1500 mg/l en werd er verdund tot een concentratie van 125 mg/l. Voor de concentraties waarbij er remzones werden vastgesteld, werd de analyse een paar dagen later ter bevestiging herhaald. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 24/40

B. subtilis BGA ATCC 9341 10240 B. cereus TCResistent ph 7,2 + mg/l ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Zink 100 118 118 119 277 +++++ 120 / 0 265 +++++ 500 105 261 +++++ 113 269 +++++ 250 260 ++++ 256 ++++ 125 221 +++ 228 +++ 62,5 204 +++ 210 +++ 31,2 189 ++ 5 176 ++ Koper 100 118 111 122 219 +++ 120 / 0 130 226 +++ 500 107 144 + 146 + 250 125 62,5 31,2 5 Mangaan 100 gb gb 131 161 + gb 0 126 155 + 500 gb gb gb 250 gb gb gb 125 gb gb gb 62,5 gb gb gb 31,2 5 gb gb gb Ijzer 150 138 116 123 180 ++ 120 / 0 131 191 ++ 100 121 0 500 114 250 125 Controle Tylosine 151 133 138 138 177 179 178 172 233 222 208 211 208 185 189 186 276 287 263 272 238 221 214 218 122 122 130 132 Controle Tetracycline 182 188 178 170 168 176 170 171 Solventblanco Blanco voeder gb: groeibevorderende zones LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 25/40

Samenvattend kan volgende tabel worden opgesteld: Maximum gehalte in volledig diervoeder of dagrantsoen volgens MB Plaat waarop remzone zichtbaar bij toegelaten gehaltes element Bemerkingen Totaal ijzer 1250 mg/kg B. subtilis BGA ph 6 Totaal koper 175 mg/kg Totaal mangaan 250 mg/kg groeibevorderende zones op B. subtilis BGA ph6 en ph8 en op B. cereus TC resistent Totaal zink 250 mg/kg ATCC 10240 Bij poging tot identificatie van een bepaald antibioticum kan deze tabel dienen als richtlijn bij de interpretatie van de analyseresultaten. 4.2.3 Temperatuur broedstoof tijdens incubatie (juni 2013, NM) Incubatie van de 5 platen gebeurt in de referentiemethode als volgt: de B. subtilis BGA platen worden gedurende 18 à 24 uur bij 30 C bebroed en de platen worden 18 à 24 uur bij 37 C bebroed. In methode IMETFLVVT058 worden de 7 platen bebroed bij een temperatuur van 37 C gedurende 18 à 24 uur. Dat de incubatietemperatuur geen invloed heeft op de uiteindelijke grootte van de remzones wordt aangetoond door 2 routinemonsters en 2 controlestandaarden toe te voegen aan alle platen en één reeks platen te bebroeden op 30 C en de andere reeks op 37 C. Een overzicht van de bekomen remzones is terug te vinden in onderstaande tabel. Remzones reële voederextracten en controlestandaarden na incubatie op 37 C en 30 C ATCC 9341 ATCC 10240 B. cereus LMG 18365 B. subtilis BGA Monster Temp. ph 7,2 + ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 13230573 37 C 142 118 130 160 192 154 13230573 30 C 143 114 132 160 199 152 13231301 37 C 166 132 186 170 177 13231301 30 C 169 132 175 179 182 Controle TYL 37 C 118 178 224 176 238 211 121 Controle TYL 30 C 115 181 216 176 244 216 120 Controle TC 37 C 182 Controle TC 30 C 184 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 26/40

Interpretatie aan de hand van onderstaande tabel resulteert in een identieke beoordeling voor de remzones van de monsters voor de 2 incubatietemperaturen. remzone < 120 remzone 120140 + remzone 140170 ++ remzone 170200 +++ remzone 200230 ++++ remzone 230260 +++++ remzone > 260 Remzones reële voederextracten en controlestandaarden na incubatie op 37 C en 30 C ATCC 9341 ATCC 10240 B. cereus LMG 18365 B. subtilis BGA Monster Temp. ph 7,2 + ph 6 ph 8 TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 13230573 37 C + + + ++ + 13230573 30 C + + + ++ + 13231301 37 C + ± ++ ++ ++ 13231301 30 C + ± ++ ++ ++ LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 27/40

4.3 CCβ (juni 2013) 4.3.1 Definitie CCβ CCβ is de kleinste hoeveelheid van de stof die met een foutkans van β in een monster kan worden aangetoond en is gelijk aan de laagste concentratie waarbij een methode met een statistische zekerheid van 95 % kan aantonen dat een monster werkelijk verontreinigd is (in geval van niet toegelaten stoffen). 4.3.2 Vergelijking MICs IMETFLVVT058 met referentiemethode Een overzicht van de minimale remmende concentraties (MICs) van enkele antibiotica en chemotherapeutica wordt gegeven in bijlage 1 van methode IMETFLVVT058. Uittreksel uit tabel van bijlage 1 van methode IMETFLVVT058: Antibiotica afgeleid van Type Molmassa (g/mol) Gevoeligste testorganisme ph MIC (µg/ml) Aminozuren Di Penicilline G 334,4/356 6 0,01 Aminozuren Poly Bacitracine Virginiamycine 1422,7 525,6823,9 6 6 0,6 0,10,2 Aminoglucosiden Avoparcine Flavomycine Lincomycine 1500 1592 406,5 B. subtilis BGA 6 8 8 0,2 0,4 0,3 Macroliden Tylosine Spiramycine 904 843,1/800900 8 8 0,2 0,4 Tetracyclines Tetracycline 444,4/444 B. subtilis BGA 6 0,5 Sulfamides Sulfadimidine 172588 B. subtilis BGA + TMP 7,2 0,3 In paragraaf 4.2.1.3 van dit validatiedossier wordt voor enkele vaak voorkomende antibiotica nagegaan of deze MICs haalbaar zijn. De gevoeligste plaat (testorganisme) en MIC per antibioticum komen inderdaad overeen met deze vermeld in bijlage 1 van IMETFLVVT058. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 28/40

Rempatronen van enkele gedopeerde voederextracten met gekend gehalte antibacteriële stof (op detectieniveau) B. subtilis BGA ATCC 9341 ATCC 10240 B. cereus LMG 18365 ph 7,2 + ph 6 ph 8 µg/ml TMP ph 6 ph 8 ph 6,5 ph 6,5 Avoparcine 0,2 + Bacitracine 0,6 + + Flavomycine 0,4 + + Lincomycine 0,3 + Penicilline G 0,01 + Spiramycine 0,4 + Sulfadimidine 0,3 + Tetracycline 0,5 + + Tylosine 0,2 + Virginiamycine 0,2 + 4.3.3 Detectielimieten IMETFLVVT058 Wanneer we vervolgens rekening houden met de verdunning van het monster volgens IMETFLVVT 058, bekomen we de onderstaande minimale detecteerbare concentraties voor enkele van de meest voorkomende antibiotica: MIC Concentratie aan antibioticum in te analyseren dierenvoeder (µg/ml) (mg/kg) Avoparcine 0,2 1 Bacitracine 0,6 3 Flavomycine 0,4 2 Lincomycine 0,3 1,5 Penicilline G 0,01 0,05 Spiramycine 0,4 2 Sulfadimidine 0,3 1,5 Tetracycline 0,5 2,5 Tylosine 0,2 1 Virginiamycine 0,2 1 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 29/40

5 Werking enzymen screening antibiotica (βlactamase en penicillinase) 5.1 Test werking enzymen (nov. 2013, AV) Penicillinasegevoelige penicillines en cephalopsporines kunnen aangetoond worden door aan het monsterextract in het ponsgaatje op plaat M.luteus ATCC 9341 ph 6 het enzyme lactamase of penicillinase (penase) toe te voegen. Indien er penicillines of cephalosporines aanwezig zijn zal de remzone beduidend kleiner worden of verdwijnen na toevoeging van lactamase (breed spectrum). Bij penicillines zal de remzone beduidend kleiner worden of verdwijnen na toevoeging van penase (specifiek), bij cephalosporines verdwijnen de remzones niet. Ter validatie van de werking van beide enzymen werden de volgende oplossingen geanalyseerd volgens methode IMETFLVVT058: 11 10 12 9 1 13 16 8 2 14 15 7 3 6 4 5 1. Zinkbacitracine (2,4 µg/ml) 2. Zinkbacitracine + penase 3. Zinkbacitracine + βlactamase 4. Amoxicilline (2,0 µg/ml) 5. Amoxicilline + penase 6. Amoxicilline + βlactamase 7. Cephalexin (2,0 µg/ml) 8. Cephalexin + penase 9. Cephalexin + βlactamase 10. Penicilline G (2,0 µg/ml) 11. Penicilline G + penase 12. Penicilline G + βlactamase 13. Controlestd Tylosine (2,0 µg/ml) 14. Controlestd Tylosine + penase 15. Controlestd Tylosine + βlactamase 16. Controlestd Tetracycline (1,0 µg/ml) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 30/40

De 7 platen zagen er uit als volgt (zie bijlage voor grotere afbeeldingen): ML ph 6 ML ph 8 MFl ph 6,5 BGA ph6 BGA ph8 BGA ph 7,2 + TMP BC TCres LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 31/40

5.2 Interpretatie resultaten Stoffen die de celwand aantasten βlactamantibiotica Andere antibiotica Penicillines Cephalosporines Carbapenems Monobactams Amoxicilline Cephalexin Zinkbacitracine Penicilline G Tylosine Amoxicilline en penicilline G behoren tot de penicillinasegevoelige βlactamantibiotica en cephalexin tot de cephalosporines. Zinkbacitracine is een polypeptide antibioticum en behoort tot geen van beide groepen, tylosine behoort tot de groep van de macrolide antibiotica. Bekijken we de foto s van de platen ML ph6 en ML ph 8, dan is duidelijk te zien dat de remzones van de β lactamantibiotica verdwijnen na toevoeging van βlactamase, terwijl de remzones van zinkbacitracine en tylosine gelijkaardig blijven. Toevoeging van penase doet de remzones van amoxicilline en penicilline G volledig verdwijnen, terwijl de remzones van cephalexin vertroebelen, maar niet volledig verdwijnen (enkel zichtbaar met tegenlicht). De remzones van zinkbacitracine en tylosine blijven gelijkaardig na toevoeging van penase. Met behulp van het enzym βlactamase kan er bijgevolg een onderscheid gemaakt worden tussen de β lactamantibiotica en de andere antibiotica. Indien er ook dient bepaald te worden of het om een penicilline of cephalosporine antibioticum gaat, kan het enzym penase gebruikt worden. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 32/40

5.3 Overzicht grootte remzones met/zonder enzymen Nr. ML6 ML8 MFl BGA6 BGA8 TMP TC 1 BAC 144 234 2 BAC + P 132 225 3 BAC + B 134 221 4 AMOX 259 267 171 229 244 239 235 5 AMOX + P 134 6 AMOX + B 233 7 CEPH 268 195 151 228 8 CEPH + P 9 CEPH + B 10 PEN G 251 269 181 268 272 258 252 11 PEN G + P 12 PEN G + B 13 TYL 183 239 220 124 183 214 220 14 TYL + P 188 237 209 120 181 221 15 TYL + B 185 238 208 119 185 223 16 TC 192 100 µl stdoplossing +/ 100 µl βlactamase of penaseoplossing o BAC stockoplossing 595 µg/ml 0,2 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,4 µg/ml o AMOX stockoplossing 200 µg/ml 0,5 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,0 µg/ml o CEPH stockoplossing 200 µg/ml 0,5 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,0 µg/ml o PEN G stockoplossing 200 µg/ml 0,5 ml/ 50 ml MeOH/H 2 O (70/30) => 2,0 µg/ml o TYL o TC LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 33/40

5.4 Overzicht foto s 7 platen met/zonder enzymen Micrococcus luteus ATCC 9341 plaat ph 6 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 34/40

Micrococcus luteus ATCC 9341 plaat ph 8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 35/40

Micrococcus luteus ATCC 10240 plaat ph 6,5 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 36/40

Bacillus subtilis BGA plaat ph 6 Bacillus subtilis BGA plaat ph 8 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 37/40

LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 38/40

Bacillus subtilis BGA plaat ph 7,2 met trimethoprim LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 39/40

Bacillus cereus TC resistent plaat ph 6,5 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v.01 20120315 40/40