VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Transcriptie

1 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date du dernière adaption Bepaling van Aflatoxine B 1, B 2, G 1, G 2 in dierenvoeders, granen, noten en afgeleide producten en van Aflatoxine B 1 in babyvoeding op basis van granen I-MET-FLVVT-083 HPLC granen en afgeleide producten 30/11/2012 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

2 Overzicht van de prestatiekenmerken: - Lineariteit: werkgebied range: 0,1 4 ng/ml (0,5 20 μg/kg) - Bepaalbaarheidsgrens (LOQ): 0,5 μg/kg - Aantoonbaarheidsgrens (LOD): 0,25 μg/kg - Herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding. niveau herh. rep. herh. rep. herh. rep. herh. rep. 0,5 µg/kg 6,01 14,43 5,53 13,32 5,64 32,18 5,02 28,31 2,5 µg/kg 4,28 8,95 3,02 8,9 3,08 6,06 3,69 13,77 5 µg/kg 2,85 11,07 3,34 4,35 1,83 4,46 3,93 15,27 7,5 µg/kg 2,76 14,85 5,13 6,72 1,87 3,41 6,92 14,54 - Meetonzekerheid meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm 40% 40% 80% 70% gebied ½ norm 3/2 norm 45% 25% 65% 50% gebied > 3/2 norm 50% 20% 65% 50% - Selectiviteit en specificiteit: gebruik immunoaffiniteitskolom en fluorescentiedetectie - Robuustheid: langetermijnvalidatie De validatie voldoet aan de procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: Prestatiecriteria uit EU-Verordening 401/2006: LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

3 Inhoud: validatierapport van 30/11/2012 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Bepaling van Aflatoxine B 1, B 2, G 1, G 2 in dierenvoeders, granen, noten en afgeleide producten en van Aflatoxine B 1 in babyvoeding op basis van granen I-MET-FLVVT-083 HPLC dierenvoeders, granen, noten en afgeleide producten, babyvoeding op basis van granen Totaal Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Jeroen Vancutsem Naam Nom: Jeroen Vancutsem Functie - Fonction: Sectieverantwoordelijke Datum - Date: 30/11/2012 Roel Tits - technisch deskundige Rudy Van Meerbeek - technisch deskundige Start - Début: januari 2012 Einde - Fin: juni 2012 Handtekeningen - Signatures: Get. Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Naam Nom: Mandy Lekens Functie - Fonction: Laboratoriummanager Datum - Date: 30/11/2012 Handtekeningen - Signatures: Get. Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

4 Validatiedossier Bepaling van Aflatoxine B 1, B 2, G 1, G 2 UHPLC 1. Lineariteit: range 0,4-4 ng/ml - De lineariteitscurve werd opgesteld in het gebied van 0,4 4 ng/ml (2 20 µg/kg) De concentraties die geïnjecteerd werden, zijn: 0,4 ng/ml ; 1 ng/ml ; 2 ng/ml ; 4 ng/ml Resultaat: concentratie Piekoppervlak 0,4 ng/ml (2 µg/kg) ng/ml (5 µg/kg) ng/ml (10 µg/kg) ng/ml (20 µg/kg) Resultaten: parameter limiet R 2 > 0,99 OK OK OK OK intercept p > 0,05 OK OK OK OK standaardstoringen tussen -2 en 2 OK OK OK OK Besluit: De rechte is lineair en loopt door het nulpunt. De range van het werkgebied is 0,5-20 µg/kg 2. Bepaling in blanco maïs Analyses van het blanco monster wijzen uit dat aflatoxine afwezig is. Er zijn enkel sporen van aflatoxine B2 (<0,02 µg/kg) 3. De aantoonbaarheidsgrens (LOD) De aantoonbaarheidsgrens werd bepaald door spiking op maïs van 0,25 µg/kg. Er werd gespiket met 100 µl van een standaardoplossing van 0,25 µg/ml bereid uit de aangemaakte standaardoplossing (1000 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemengd waren. Reeks nr Reeks 1 1 0,182 72,8 0,153 61,2 0, ,181 72,4 27/01/12 2 0, ,156 62,4 0, ,187 74,8 R. tits 3 0,196 78,4 0,158 63,2 0, ,191 76,4 4 0,189 75,6 0,152 60,8 0,172 68,8 0,186 74,4 5 0,1 40 0, ,094 37,6 0,094 37,6 6 0, ,069 27,6 0,078 31,2 0,082 32,8 gemiddelde 0,16 0,13 0,15 0,15 gemiddelde recovery 63,1 51,2 58,3 61,4 herhaalbaarheid STDEV 0,05 0,04 0,05 0,05 RSD 20,43 16,66 18,67 20,39 2,8 x STDEV 0,14 0,12 0,13 0,14 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,65 G hoogste waarde OK OK OK OK G laagste waarde OK OK OK OK Besluit: De LOQ kan vastgelegd worden op 0,25 µg/kg. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

5 4. De bepalingsgrens: De bepalingsgrens werd bepaald door spiking op maïs van 0,5 µg/kg. Er werd gespiket met 100 µl van een standaardoplossing van 2,5 µg/ml bereid uit de aangemaakte standaardoplossing (1000 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemend waren voor de reeksen aangeduid met *. Er werd gespiket met 40 µl van een standaardoplossing bereid uit de 10x verdunde aangekochte standaardoplossing (25 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemengd waren. Reeks nr Reeks 1* 1 0,4 80 0, , , /01/12 2 0, , , ,46 92 R. Tits 3 0, , , , , ,4 80 0, , , ,4 80 0, ,48 96 Reeks 2 16/03/12 R. Van Meerbeek Reeks 3 12/06/12 J. Vancutsem 6 0, ,4 80 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,4 80 0, , , , , , , , , , ,32 64 *na correctie van de concentratie tot de referentiestandaardvan 4 ng/ml: AFLA B1: 4,22 ng/nl; AFLA B2: 3,45 ng/nl; AFLA G1: 5,17 ng/ml; AFLA G2: 4,01 ng/ml gemiddelde 0,46 0,48 0,42 0,45 gemiddelde recovery 91,7 96,6 84,1 90,8 herhaalbaarheid RSD 6,01 5,53 5,64 5,02 2,8 x STDEV 0,08 0,07 0,07 0,06 reproduceerbaarheid RSD 14,43 13,32 32,18 28,31 2,8 x STDEV 0,19 0,18 0,38 0,36 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,65 G hoogste waarde OK OK OK OK G laagste waarde OK OK OK OK Besluit: De LOQ kan vastgelegd worden op 0,5 µg/kg LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

6 5. De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding: De herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid werden bepaald conform template LAB 00 P 180 F 004 ( _LAB-00-P-180-F-004-valkidatie-berekeningen-formules_v01_NL-FR) Op basis van Verordening 401/2006 is een maximale RSD r van 0,66x Horwitz, een maximale RSD R volgens Horwitz en een terugvindingspercentage van % toegestaan voor gehalten 1 µg/kg, % voor gehalten 1-10 µg/kg en % voor gehalten > 10µg/kg. De herhaalbaarheid en intralaboratoriumreproduceerbaarheid werd bepaald a. door spiking op maïs van 0,5 µg/kg (zie 4. bepalingsgrens) Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. b. door spiking op maïs van 2,5 µg/kg (1/2 norm). Er werd gespiket met 50 µl van een standaardoplossing van 25 µg/ml bereid uit de aangemaakte standaardoplossing (1000 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemend waren voor de reeksen aangeduid met *. Er werd gespiket met 20 µl van een standaardoplossing bereid uit de aangekochte standaardoplossing (25 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemengd waren. Reeks nr Reeks 1* 24/01/12 R. Tits Reeks 2* 01/02/12 R. Van Meerbeek Reeks 3 12/06/12 J. Vancutsem 1 2,01 80,5 2,41 96,6 1,92 76,8 2,44 97,4 2 2,12 84,6 2,46 98,4 1,99 79,5 2,45 97,8 3 1,75 69,8 2,52 100,8 1,95 78,0 2,53 101,4 4 2,07 82,7 2,38 95,2 1,92 76,8 2,39 95,4 5 2,07 82,7 2,47 98,9 1,98 79,2 2,45 97,8 6 2,05 82,0 2,41 96,6 1,89 75,5 2,50 100,2 1 1,88 75,1 1,98 79,4 1,94 77,7 1,79 71,5 2 1,90 75,9 2,09 83,6 2,07 82,6 2,05 81,8 3 1,93 77,0 2,10 84,0 2,07 82,6 2,03 81,0 4 2,00 80,1 2,17 86,8 2,13 85,1 2,11 84,2 5 2,06 82,4 2,24 89,6 2,11 84,5 2,12 84,6 6 1,97 78,9 1,97 78,9 1,94 77,7 2,08 83,0 1 2,26 90,4 2,42 96,8 1,78 71,2 1,87 74,8 2 2,23 89,2 2,38 95,2 1,89 75,6 1,93 77,2 3 2,26 90,4 2,4 96,0 1,83 73,2 1,93 77,2 4 2,29 91,6 2,44 97,6 1,85 74,0 1,93 77,2 5 2,34 93,6 2,47 98,8 1,88 75,2 1,97 78,8 6 2,24 89,6 2,41 96,4 1,78 71,2 1,89 75,6 *na correctie van de concentratie tot de referentiestandaardvan 4 ng/ml: AFLA B1: 4,22 ng/nl; AFLA B2: 3,45 ng/nl; AFLA G1: 5,17 ng/ml; AFLA G2: 4,01 ng/ml gemiddelde 2,08 2,32 1,94 2,13 gemiddelde recovery 83,1 92,8 77,6 85,4 herhaalbaarheid RSD 4,28 3,02 3,08 3,69 2,8 x STDEV 0,25 0,20 0,17 0,22 reproduceerbaarheid RSD 8,95 8,90 6,06 13,77 2,8 x STDEV 0,52 0,20 0,33 0,82 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,65 G hoogste waarde OK OK OK OK G laagste waarde OK OK OK OK Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

7 c. door spiking op maïs van 5 µg/kg (norm). Er werd gespiket met 100 µl van een standaardoplossing van 25 µg/ml bereid uit de aangemaakte standaardoplossing (1000 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemend waren voor de reeksen aangeduid met *. Er werd gespiket met 40 µl van een standaardoplossing bereid uit de aangekochte standaardoplossing (25 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemengd waren. Reeks nr Reeks 1* 1 3,62 72,5 4,57 91,5 3,76 75,2 4,78 95,6 24/01/12 2 3,87 77,4 4,55 91,0 3,79 75,8 4,65 93,0 R. Tits 3 4,04 80,8 4,84 96,8 3,93 78,6 5,05 101,0 4 3,98 79,7 4,79 95,9 3,84 76,8 4,91 98,2 5 3,82 76,5 4,33 86,6 3,61 72,3 4,38 87,6 Reeks 2* 01/02/12 R. Van Meerbeek Reeks 3 12/06/12 J. Vancutsem 6 3,76 75,1 4,82 96,3 3,85 77,1 4,95 99,0 1 4,02 80,5 4,45 88,9 3,54 70,7 4,36 87,2 2 3,97 79,3 4,41 88,2 3,63 72,6 4,30 86,0 3 3,74 74,8 4,13 82,6 3,55 71,0 4,03 80,6 4 4,09 81,8 4,57 91,5 3,54 70,9 4,44 88,8 5 3,91 78,2 4,32 86,4 3,56 71,2 4,20 84,0 6 3,85 77,0 4,39 87,8 3,53 70,6 4,25 85,0 1 4,72 94,4 4,64 92,8 3,54 70,8 3,63 72,6 2 4,58 91,6 4,51 90,2 3,52 70,4 3,50 70,0 3 4,66 93,2 4,53 90,6 3,52 70,4 3,53 70,6 4 4,61 92,2 4,53 90,6 3,51 70,2 3,51 70,2 5 4,72 94,4 4,71 94,2 3,52 70,4 3,57 71,4 6 4,66 93,2 4,54 90,8 3,51 70,2 3,53 70,6 gemiddelde 4,15 4,54 3,63 4,20 gemiddelde recovery 82,9 90,7 72,5 84,0 herhaalbaarheid RSD 2,85 3,34 1,83 3,93 2,8 x STDEV 0,33 0,42 0,19 0,46 reproduceerbaarheid RSD 11,07 4,35 4,46 15,27 2,8 x STDEV 1,28 0,55 0,45 1,80 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,65 G hoogste waarde OK OK OK OK G laagste waarde OK OK OK OK Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

8 d. door spiking op maïs van 7,5 µg/kg (1,5 X norm). Er werd gespiket met 150 µl van een standaardoplossing van 25 µg/ml bereid uit de aangemaakte standaardoplossing (1000 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemend waren voor de reeksen aangeduid met *. Er werd gespiket met 60 µl van een standaardoplossing bereid uit de aangekochte standaardoplossing (25 µg/ml) waarna de 4 aflatoxines in gelijke verhouding gemengd waren. Reeks nr Reeks 1* 1 6,04 80,6 7,21 96,1 5,64 75,2 7,01 93,4 24/01/12 2 6,20 82,7 7,37 98,3 5,56 74,1 7,27 96,9 R. Tits 3 6,39 85,1 7,59 101,2 5,73 76,4 7,45 99,3 4 5,83 77,7 6,30 84,0 5,47 72,9 6,07 80,9 5 5,75 76,7 7,05 93,9 5,43 72,4 6,89 91,8 Reeks 2* 01/02/12 R. Van Meerbeek Reeks 3 12/06/12 J. Vancutsem 6 6,08 81,1 7,30 97,3 5,71 76,1 7,12 94,9 1 5,30 70,7 6,83 91, ,53 73,7 2 5,28 70,3 7,87 104, ,48 86,4 3 5,51 73,5 8,11 108, ,95 92,6 4 5,34 71,2 7,73 103, ,47 86,2 5 5,28 70,3 7,46 99, ,20 82,6 6 5,30 70,7 7,60 101, ,58 74,4 1 7,07 94,3 7,03 93,7 5,38 71,7 5,43 72,4 2 6,84 91,2 6,65 88,7 5,39 71,9 5,26 70,1 3 7,24 96,5 6,99 93,2 5,43 72,4 5,39 71,9 4 7,24 96,5 6,93 92,4 5,28 70,4 5,37 71,6 5 7,19 95,9 7,00 93,3 5,26 70,1 5,40 72,0 6 7,19 95,9 6,92 92,3 5,43 72,4 5,26 70,1 gemiddelde 6,17 7,22 5,16 6,17 gemiddelde recovery 82,3 96,3 73,0 82,3 herhaalbaarheid RSD 2,76 5,13 1,87 6,92 2,8 x STDEV 0,48 1,04 0,29 1,20 reproduceerbaarheid RSD 14,85 6,72 3,41 14,54 2,8 x STDEV 2,57 1,36 0,52 2,51 outliers (Grubbs test) G kritisch : 2,65 G hoogste waarde OK OK OK OK G laagste waarde OK OK OK OK Besluit: De herhaalbaarheid, intralaboratoriumreproduceerbaarheid en terugvinding voldoen aan de voorwaarden gesteld in Verordening 401/2006. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

9 6. Meetonzekerheid: Voor het bepalen van de meetonzekerheid werd de volgende strategie gevolgd: Eerst wordt nagegaan of de bias significant is (in dat geval is de bias > 2s RW ). b > b > b > bias 2s RW bias 2s 2s RW? RW bias 2s 2s RW? RW 2s RW? bias 2s RW LOQ -0,04 0,38-0,02 0,36-0,08 0,76-0,05 0,72 2,5-0,42 1,04-0,18 0,4-0,56 0,66-0,37 1,64 5-0,85 2,56-0,46 1,1-1,37 0,9 JA -0,8 3,6 7,5-1,33 5,14-0,28 2,72-2,34 1,04 JA -1,33 5,02 b > 2s RW? Dit is het geval voor AFLA G1 bij een concentratie van 5 en 7,5 µg/kg. De uitgebreide meetonzekerheid is daar gelijk aan: U b 2* s RW Dit geeft volgende waarden: U, U, U, U, U, U, U, b 2s RW b2s rel RW b 2s rel RW b 2s rel RW LOQ 2,5 5 1,37 0,9 2,27 62,5 7,5 2,34 1,04 3,38 65,5 U, rel 2 2 In de andere gevallen is de bias < 2s RW en kiezen we volgende formule: uc ubias u(rw) met u bias RMS bias Met RMS bias 2 2 u ( spiking) 2 u(cref, spike) LOQ 160,22 256,89 588,67 529,78 2,5 325,19 99,83 518,86 308, ,21 99,32 369,75 7,5 415,33 48,87 417,87 Met u(spiking) 2 2 (meetonzekerheid op basis van recovery) en u(r W ) = s R Van de standaard van 25 µg/ml werd een bepaald volume genomen dat dan gebruikt werd om te spiken (mengoplossing van de 4 aflatoxines). Er werd gebruik gemaakt van een micropipet van µl. Volgende onzekerheidsparameters werden in rekening gebracht: a. onzekerheid op precisie van de pipet (driehoeksverdeling) pipet µl: accuracy: 1% (voor 500µl)-> onzekerheid: 0,41% b. reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus meetonzekerheid ) c. (enkel voor LOQ): onzekerheid op precisie van de pipet (driehoeksverdeling) pipet µl: accuracy: 1% (voor 500µl)-> onzekerheid: 0,41% a. (enkel LOQ): reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus meetonzekerheid) LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

10 b. (enkel LOQ): onzekerheid op de precisie van de maatkolf (5 ml): +/- 0,04 ml -> onzekerheid: 0,8/ 6 =0,32% c. (enkel LOQ): variatie in het vullen van de maatkolf: 0,1% (zie cursus meetonzekerheid) d. reproduceerbaarheid in pipetteren: 1% (geschat, zie cursus meetonzekerheid ) e. temperatuurseffect: 0,21% (zie cursus meetonzekerheid) f. onzekerheid op precisie van de pipet om te spiken (driehoeksverdeling) LOQ: pipet µl: accuracy: 1% (voor 10µl)-> onzekerheid: 1,43% 2,5 en 5 µg/kg: pipet µl: accuracy: 1% (voor 100µl)-> onzekerheid: 0,41% 7,5 µg/kg: pipet: µl: accuracy: 1% (voor 500µl)-> onzekerheid: 0,41% u(spiking) LOQ 2 = 0, , , =5,54 u(spiking) andere 2 = 0, , , =3,03 Met u(cref spike) 2 Concentratie 25 24,9 24,9 25 (µg/ml) onzekerheid 0,56 0,56 0,56 0,56 Onzekerheid relatief 2,24 2,25 2,25 2,24 u(cref spike) 2 5,02 5,06 5,06 5,02 Samengevat RMSbias 2 LOQ 2,5 5 7,5 LOQ 2,5 5 7,5 160,22 325,19 349,21 415,33 256,89 99,83 99,32 48,87 588,67 518,86 529,78 308,85 369,75 417,87 u(spiking) 2 5,54 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 3,03 u(cref 2 spike) 5,02 5,06 5,06 5,02 5,02 5,06 5,06 5,02 5,02 5,06 5,02 5,06 5,06 5,02 som (ubias 2 ) 170,78 333,28 357,3 423,38 264,94 107,92 107,41 56,92 596,72 526,95 537,83 316,94 377,84 425,92 u 2 Rw = s 2 R (rel) LOQ 208,22 177, ,55 801,46 2,5 80,10 79,21 36,72 189, ,54 18,92 233,17 7,5 220,52 45,16 211,41 LOQ 2,5 5 7,5 LOQ 2,5 5 7,5 c LOQ 19,19 20,84 40,30 36,49 2,5 20,13 13,38 23,57 22, ,72 10,87 24,55 7,5 25,22 9,70 25,09 c LOQ 38,39 41,68 80,60 72,97 2,5 40,26 26,76 47,14 44, ,44 21,75 62,5 49,11 7,5 50,43 19,39 65,5 50,17 Samengevat Relatieve meetonzekerheid: LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

11 LOQ , , Besluit meetonzekerheid: meetonzekerheid gebied LOQ-1/2 norm 40% 40% 80% 70 gebied ½ norm 3/2 norm 45% 25% 65% 50 gebied > 3/2 norm 50% 20% 65% 50% 7. Specificiteit De specificiteit van de methode wordt gegarandeerd door de immunoaffiniteitskolom bij de opzuivering die specifieke antilichamen voor aflatoxine bevat. Bovendien gebeurt de detectie op een voor het molecule specifieke golflengte. 8. Robuustheid De robuustheid wordt nagegaan door middel van langetermijnvalidatie op basis van controlekaarten. 9. Criteria volgens EU-Verordening 401/2006 REFERENTIEMETHODE: Afgeleide methode gebaseerd op: ISO 16050:2003 Foodstuffs - Determination of aflatoxin B1, and the total content of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in cereals, nuts and derived products - High-performance liquid chromatographic method LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12

12 9. Foto's a) Extractie met Ultraturrax b) Opzuivering met immunoaffiniteitskolom c) Chromatografie d) Chromatogram LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /12