VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION

Transcriptie

1 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Datum laatste aanpassing / Date de la dernière adaption I-MET-FLVVT-125: Bepaling van Glyceroltriheptanoaat GC-MS Diermelen Vetten 15/09/2009 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

2 Overzicht van de prestatiekenmerken: o Zie samenvatting prestatiekenmerken (p. 5) De validatie voldoet aan procedure LAB 00 P180 De laboratoria die deze methode willen overnemen, moeten aantonen dat de criteria hieronder aangegeven voldaan zijn: o Verordening (EG) nr. 1432/2007 van de Commissie van 5 december 2007 tot wijziging van de bijlagen I, II en VI bij Verordening (EG) nr. 1774/2002 van het Europees Parlement en de Raad wat betreft het merken en het vervoer van dierlijke bijproducten Historiek validatie Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen Versie 01 Eva Wevers 04/2009 Oorspronkelijke validatie / Versie 02 Eva Wevers 09/2009 Bespreking interlaboratoriumvalidatiestudie IRMM / LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

3 VALIDATIERAPPORT RAPPORT DE VALIDATION Analysemethode Méthode d analyse Techniek Technique Matrix / matrixgroep Matrice / Groupe de matrices Type validatie Type de validation Verantwoordelijke (Naam en functie) Responsable (Nom et fonction) Opgesteld door Rédaction par I-MET-FLVVT-125: Bepaling van Glyceroltriheptanoaat GC-MS Diermelen Vetten Totaal Eva Wevers Sectieverantwoordelijke Contaminanten Eva Wevers Handtekeningen - Signatures: Sectieverantwoordelijke Contaminanten 15/09/2009 Get. Medewerkers (Naam en functie) Collaborateurs (Nom et fonction) Periode van validatie Période de validation Methode goedgekeurd en geschikt bevonden door Méthode approuvée et jugé convenable pour la routine par Sara Crauwels Analist Mieke Van Thienen Analist Geert Verhoeven Analist Start - Début: 03/09/2008 Einde - Fin: 15/09/2009 Eva Wevers Sectieverantwoordelijke Contaminanten 15/09/2009 Handtekeningen - Signatures: Get. Hierna volgt een beschrijving van de resultaten van het validatieonderzoek zoals aangegeven in stap 8 van de procedure LAB 00 P 180. Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB P LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

4 Inhoudstabel INHOUDSTABEL... 4 SAMENVATTING PRESTATIEKENMERKEN VERSIE VERSIE FOTO S LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

5 VALIDATIEDOSSIER Samenvatting prestatiekenmerken s r s R %RSD diermeel 20 mg/kg mg/kg vet 20 mg/kg mg/kg LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

6 1 Versie 01 Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen Versie 01 Eva Wevers 04/2009 Oorspronkelijke validatie / Validatiedossier GTH Doelstelling Deze methode beschrijft de kwantitatieve en kwalitatieve bepaling van GTH in diermelen en vetten. In stalen van categorie 1 en 2 dient GTH aanwezig te zijn in een minimale concentratie van 250 mg/kg, terwijl GTH afwezig moet zijn in stalen van categorie 3. Voor stalen van categorie 1 en 2 wordt geopteerd voor een kwantitatieve bepaling, terwijl voor stalen van categorie 3 een kwalitatieve bepaling uitgevoerd zal worden. Lineariteit De kalibratiecurve werd bepaald aan de hand van 7 kalibratiepunten (waaronder het nulpunt). Er werd een goodness of fit van de tweede orde aangetoond. Selectiviteit/specificiteit Er zal worden nagegaan of de soxlet-extractie vervangen kan worden door een soxtec-extractie of een koude extractie. Hiertoe zullen zowel de bekomen vetpercentages als de GTH-gehalten vergeleken worden. GTH zal geïdentificeerd worden op basis van retentietijd en op basis van de ionverhouding. Voor GTH zijn er twee ionen van belang: en De ionenverhoudingen zullen bepaald worden op 3 concentratieniveaus: 0 mg/kg, 30 mg/kg en 250 mg/kg. Juistheid De juistheid zal worden nagegaan aan de hand van blanco monsters waaraan GTH wordt toegevoegd en dit voor beide matrices (diermeel en vet) op twee concentratieniveaus namelijk 20 mg/kg en 250 mg/kg. De terugvinding dient minimaal 80 % te bedragen. Precisie De herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid zullen worden bepaald voor beide matrices op twee concentratieniveaus (20 mg/kg en 250 mg/kg). De interlaboratorium-variatiecoëfficiënt zal vergeleken worden met de waarde bekomen uit de Horwitz-vergelijking (2/3 van de Horwitz-waarde voor de herhaalbaarheid). Daarnaast zal de bekomen reproduceerbaarheid vergeleken worden met de resultaten van de interlaboratoriumstudie waaraan ons laboratorium deelneemt. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

7 Rapporteringsgrens Op basis van de technische nota van het IRMM en een kritische analyse van meerdere blanco-standaarden werd de rapporteringsgrens op 20 mg/kg vastgelegd. Deze waarde werd op het einde van het validatieproces verlaagd tot 15 mg/kg. Overzicht s r s R %RSD gem diermeel 20 mg/kg mg/kg vet 20 mg/kg mg/kg LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

8 respons ratios FAVV BESTUUR LABORATORIA / AFSCA ADMINISTRATION DES LABORATOIRE 1.1 Lineariteit De kalibratiecurve wordt bepaald op basis van 7 kalibratieoplossingen met volgende concentraties: 0 mg/kg, 75 mg/kg, 125 mg/kg, 250 mg/kg, 375 mg/kg, 500 mg/kg en 625 mg/kg. Voor het nagaan van de lineariteit werden de respons ratio gegevens van de kalibratiecurve van 8, 13 en 15 januari 2009 gebruikt (zie tabel 1). In figuur 1 worden de drie kalibratiecurven grafisch weergegeven. Tabel 1: Gegevens respons ratio kalibratiecurve (uitgevoerd door Geert Verhoeven (GV) op 08/01/2009, Mieke Van Thienen (MVT) op 13/01/2009 en Sara Crauwels (SC) op 15/01/2009) mg/kg 8/01/ /01/ /01/ , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,10203 De vergelijkingen van de kalibratiecurven zijn: y = x x R 2 = (08/01/2009) y = x x R 2 = 1 (13/01/2009) y = x x R 2 = (15/01/2009) 1, , , , , /01/ /01/ /01/2009 0, , mg/kg Figuur 1: kalibratiecurven op basis van respons ratio Conclusie: Lineariteit Op basis van de gegevens kan geconcludeerd worden dat een kwadratisch model (y = ax 2 + bx + c) een goede fit oplevert (zie statistische gegevens in bijlage). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

9 1.2 Vergelijking vetpercentage Soxlet Soxtec koude extractie Verschillende extractiemethoden werden geleken wat betreft hun efficiëntie om vet te extraheren uit de matrix diermeel. Eerst en vooral werd een Soxlet-extractie (de voorgeschreven extractiemethode in de technische nota van het IRMM) vergeleken met een Soxtec-extractie (zie tabel 2). Uit de gegevens blijkt dat er vergelijkbare hoeveelheden vet werden teruggevonden. Ook met koude extractietechnieken (zie tabel 2 voor hexaan en tabel 3 voor petroleumether) werden voldoende hoeveelheden vet teruggevonden, alhoewel de hoeveelheden wel lager lagen dan bij de warme extractiemethoden. Tabel 2: Vergelijking verschillende extractietechnieken Gemiddelde Stdev Soxlet extractie met petroleumether GV, 02/09/2008 en 03/09/ ,26 0,16 Soxtec-extractie met petroleumether GV, 12/12/2008 9,70 0,11 Koude extractie met hexaan (2u) GV, 04/09/2008 8,66 0,31 Tabel 3: Vergelijking verschillende extractietechnieken op verschillende stalen staal 1 staal 2 staal 3 GV, 21/01/2009 GV, 27/01/2009 GV, 27/01/2009 soxtec extractie met petroleumether 13,44 12,08 11,24 koude extractie met hexaan 9,2 7,4 7,5 koude extractie met petroleumether 9,2 7,3 7,5 Conclusie: Uit bovenstaande resultaten blijkt dat er met de warme extractietechnieken meer vet wordt geëxtraheerd dan met de koude extractietechnieken. Toch zijn de verschillen in vetpercentages eerder klein. Met de koude extractie wordt minstens 65% à 85% van het vet geëtraheerd in vergelijking met de warme extractietechnieken. Bovendien worden de resultaten uitgedrukt op vetbasis. De resultaten worden dus niet significant beïnvloed door het vetpercentage, m.a.w. aangezien de GTH-concentraties steeds uitgedrukt worden op vetbasis, heeft het al dan niet volledig extraheren van het vet uit een monster geen invloed op de aanwezige GTH-concentraties. Aangezien de koude extractie met petroleumether de meeste voordelen biedt (sneller dan koude extractietechnieken, veiliger dan hexaan) wordt er voor deze optie gekozen. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

10 1.3 Vergelijking GTH-gehalte Soxtec koude extractie met petroleumether Er werd onderzocht of koude extractie met petroleumether aanleiding geeft GTH-gehalten die verschillen van de GTH-gehalten gemeten na een Soxtec-extractie. Hiertoe werd een diermeel gedopeerd op 250 mg/kg vet waarbij er werd verondersteld dat het diermeel ongeveer 10 % vet bevatte. In tabel 4 zijn de gemiddelden voor beide methoden met hun respectievelijke standaarddeviaties van 6 monsters (duplo-injecties) weergegeven. Tabel 4: Vergelijking van de GTH-gehalten (in mg/kg vet) bepaald met behulp van GC-MS na een soxtec-extractie met petroleumether en een koude extractie met petroleumether (uitgevoerd op 10/02/2009 door GV) warme extractie petroleumether gemiddelde 187,65 181,41 stdev 11,50 28,63 Conclusie: Statistische analyse (voor meer details: zie bijlage) toonde aan dat het gemiddelde GTH-gehalte bekomen na warme extractie niet verschilde van het gemiddelde GTH-gehalte bekomen na een koude extractie met petroleumether. In de rest van dit validatiedossier zal bijgevolg geopteerd worden voor een koude extractie met petroleumether. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

11 1.4 Juistheid De juistheid werd nagegaan door voor twee verschillende GTH-gehalten het percentage terugvinding te berekenen aan de hand van de resultaten voor de reproduceerbaarheid (zie verder). Er werd gedopeerd op een laag niveau (20 mg/kg vet) en op het niveau dat verwacht wordt voor positieve stalen (250 mg/kg vet) en dit voor beide matrices (vet en vet uit diermeel) (zie tabel 5). Grubbs-analyse toonde aan dat er geen outliers aanwezig zijn. Tabel 5: Percentage terugvinding voor stalen (18 vetten uit diermelen en 18 vetten) die gespiked werden op 20 mg/kg vet en 250 mg/kg vet (uitgevoerd op 13/02/2009, 17/02/2009 en 20/02/2009) % terugvinding diermeel vet 20 mg/kg 119,8 133,8 250 mg/kg 128,2 107,4 Terugvinding trainingsfase interlaboratoriumstudie Uit trainingsfase van de interlaboratoriumstudie waaraan ons laboratorium deelneemt blijkt dat er voor de stalen met gehalte 112 mg/kg, 194 mg/kg en 404 mg/kg respectievelijk door ons laboratorium mg/kg, mg/kg en mg/kg werd teruggevonden. Dit komt overeen met een terugvinding van 99.8 %, % en 95.2 %. (Gegevens: zie bijlage reproduceerbaarheid) Conclusie: Juistheid In de technische nota 1 van het IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) wordt vermeld dat de terugvinding minstens 80% moet bedragen. Deze voorwaarde is voldaan zowel bij GTH-gehalten van 20 mg/kg als 250 mg/kg en dit in beide matrices (vetten en vetten uit diermeel). Ook de terugvindingen in de trainingsfase van de interlaboratoriumstudie voldeden. 1 Determination of glyceroltriheptanoate (GTH) in processed animal by-products by gas chromatography. Authors: C. von Holst, A. Boix, S. Bellorini, S. Androni, F. Serano LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

12 1.5 Precisie Herhaalbaarheid De herhaalbaarheid werd bepaald aan de hand van stalen die gedopeerd werden met GTH op een laag niveau (20 mg/kg) en op het verwachte niveau in positieve stalen (250 mg/kg). Zowel vet als vet geëxtraheerd uit diermeel werden gedopeerd. De herhaalbaarheid wordt gedefinieerd als 2.8 maal de standaardafwijking (s r ) (zie tabel 6). Tabel 6: GTH-gehalten van stalen (6 vetten uit diermelen en 6 vetten) die gespiked werden op 20 mg/kg vet en 250 mg/kg vet (uitgevoerd op 13/02/2009 door MVT) 20 mg/kg 250 mg/kg diermeel vet diermeel vet gem 22,63 21,28 285,22 281,87 s r 0,28 1,44 10,65 12,14 %RSD 1,25 6,78 3,74 4,31 2,8 x s r 0,79 4,04 29,82 33,98 Conclusie: Herhaalbaarheid In de technische nota 2 van het IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) wordt voor diermeel een herhaalbaarheid van 6% en 4% vermeld voor een GTH-gehalte van 84.5 mg/kg vet en 845 mg/kg vet respectievelijk. Deze waarden stemmen goed overeen met de waarden die door ons werden berekend. De Horwitz-waarde wordt berekend als volgt VC ( logc) en is weergegeven in onderstaande tabel. Tabel 7: Horwitz-waarden voor herhaalbaarheid concentratie c (Horwitz) Horwitz 2/3 Horwitz 20 mg/kg mg/kg Bij beide concentraties (20 mg/kg en 250 mg/kg) geldt dat de RSD lager is dan 2/3 van de Horwitz-waarde en dit zowel voor de matrix diermeel als voor de matrix vet. 2 Determination of glyceroltriheptanoate (GTH) in processed animal by-products by gas chromatography. Authors: C. von Holst, A. Boix, S. Bellorini, S. Androni, F. Serano LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

13 Reproduceerbaarheid De reproduceerbaarheid werd bepaald aan de hand van stalen die gedopeerd werden met GTH op een laag niveau (20 mg/kg) en op het verwachte niveau in positieve stalen (250 mg/kg). Zowel vetten als vet geëxtraheerd uit diermeel werden gedopeerd op drie verschillende dagen. De reproduceerbaarheid wordt gedefinieerd als 2.8 maal de standaardafwijking (s R ) (zie tabel 8). Tabel 8: GTH-gehalten van stalen (18 vetten uit diermelen en 18 vetten) die gespiked werden op 20 mg/kg vet en 250 mg/kg vet (uitgevoerd op 13/02/2009, 17/02/2009 en 20/02/2009) 20 mg/kg 250 mg/kg diermeel vet diermeel vet gem 23,97 26,76 320,43 268,46 s R 2,94 4,60 29,42 40,66 %RSD 12,28 17,19 9,18 15,15 2,8 x s R 8,83 13,80 88,25 121,99 Conclusie: Reproduceerbaarheid Uit de resultaten van de trainingsfase van de interlaboratorium studie waaraan ons laboratorium deelneemt was het mogelijk om RSD-waarden te berekenen. Voor de GTH-gehalten 112, 194 en 404 mg/kg vet bedroeg de RSD 11.51%, 11.69% en 19.24% respectievelijk. Deze waarden sluiten goed aan bij de waarden berekend op basis van bovenstaande resultaten. De Horwitz-waarde is weergegeven in onderstaande tabel. Tabel 9: Horwitz-waarden voor reproduceerbaarheid concentratie c (Horwitz) Horwitz 20 mg/kg mg/kg Bij beide concentraties (20 mg/kg en 250 mg/kg) geldt dat de RSD hoger is dan de Horwitz-waarde en dit zowel voor de matrix diermeel als voor de matrix vet. De RSD waarden voor de concentraties uit de trainingsfase van de interlaboratoriumstudie overschrijden echter ook de Horwitz-waarden bij bijhorende concentratie (7.86 voor 112 mg/kg, 7.24 voor 194 mg/kg en 6.48 voor 404 mg/kg). LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

14 1.6 Kwalitatieve GTH-bepaling met behulp van spike op 30 mg/kg De respons ratio gegevens werden bepaald voor gedopeerde stalen vet en gedopeerde stalen vet geëxtraheerd uit diermeel. Er werden van elke matrix telkens 6 stalen gedopeerd en dit op twee concentratieniveaus: 15 mg/kg en 30 mg/kg. De resultaten zijn weergegeven in tabel 10. Tabel 10: Gegevens respons ratio voor 6 stalen vet geëxtraheerd uit diermeel en 6 stalen vet gedopeerd op 15 mg/kg of 30 mg/kg, uitgevoerd op 03/04/2009 door GV diermeel vet 15 mg/kg 30 mg/kg 15 mg/kg 30 mg/kg gemiddelde 0,134 0,374 0,193 0,482 s R 0,025 0,021 0,026 0,019 helft 30 mg/kg 0,187 0,241 Conclusie Uit de gegevens blijkt dat voor zowel de matrix diermeel als voor de matrix vet de gemiddelde respons ratio bij 15 mg/kg lager is dan de helft van de gemiddelde respons ratio bij 30 mg/kg. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

15 1.7 Ionenverhoudingen De ionenverhoudingen werden berekend voor drie verschillende concentraties: 0 mg/kg, 30 mg/kg en 250 mg/kg. Voor GTH zijn er twee ionen van belang: (confirmatory ion) en (quantifier). 250 mg/kg De ionenverhoudingen werden berekend voor 6 stalen diermeel en 6 stalen vet die elk gedopeerd werden op 250 mg/kg. Deze vergelijking werd uitgevoerd op gegevens van drie verschillende dagen (13/02/2009, 17/02/2009 en 20/02/2009). Voor alle stalen geldt dat de ionenverhouding van het ion met massa ten opzichte van het ion met niet meer dan 15 % afwijkt ten opzichte van de ionenverhouding van de standaard 250 mg/kg uit dezelfde analysereeks. 0 mg/kg 30 mg/kg De ionenverhouding van de standaard 0 mg/kg werd gecontroleerd voor de analysereeks van 13/02/2009, 17/02/2009, 20/02/2009 en 03/04/2009. De ionen waren ofwel afwezig, ofwel aanwezig in een verkeerde verhouding (met ion in dezelfde grootteorde of zelfs groter dan ion 299.3). De ionenverhoudingen werden bovendien berekend voor 6 stalen diermeel en 6 stalen vet, elk gedopeerd op 30 mg/kg, op basis van de analysereeks van 03/04/2009. Uit deze gegevens blijkt dat binnen een analysereeks de ionenverhouding van gedopeerde stalen in dezelfde grootteorde ligt. Conclusie Voor stalen waarin GTH wordt aangetroffen zal de ionenverhouding berekend worden en vergeleken worden met de ionenverhouding van een controlemonster dat gedopeerd werd op 30 mg/kg of 250 mg/kg, afhankelijk van de aangetroffen hoeveelheid GTH. De ionenverhoudingen mogen niet meer dan 15% afwijken voor 250 mg/kg en niet meer dan 50% voor 30 mg/kg. 1.8 Signaal/ruis verhouding De signaal/ruis verhoudingen werden gecontroleerd voor twee verschillende concentraties: 15 mg/kg en 30 mg/kg en dit voor telkens 6 stalen diermeel en 6 stalen vet. Voor alle gecontroleerde stalen geldt dat de signaal/ruis verhouding groter is dan 6 voor de concentratie van 30 mg/kg terwijl voor alle stalen gedopeerd op 15 mg/kg de signaal/ruis verhouding groter is dan 3. De rapporteringsgrens wordt bijgevolg ingesteld op 15 mg/kg. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

16 1.9 Meetonzekerheid De meetonzekerheden werden berekend volgens de procedure LAB P 508 Meetonzekerheid. De berekeningen bevinden zich in bijlage. Conclusie Voor een GTH-gehalte in de grootteorde van 250 mg/kg bedraagt de meetonzekerheid enerzijds 63.8% voor diermeel, en anderzijds 39.9% voor vet. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

17 2 Versie 02 Versie Herziening door/datum Reden van herziening Wijzigingen Versie 02 Eva Wevers 09/2009 Bespreking interlaboratoriumvalidatiestudie IRMM / BESPREKING INTERLABORATORIUMVALIDATIESTUDIE IRMM Het FLVVT nam in 2009 deel aan een officiële studie voor de validatie van de analytische methode ter bepaling van glyceroltriheptanoaat (GTH) in dierlijke bijproducten. Het doel van deze studie bestond eruit om de performantiekarakteristieken van de methode voor de bepaling van GTH te bepalen. De studie werd uitgevoerd door 20 officiële laboratoria uit 13 lidstaten. Alle resultaten van deze interlaboratoriumstudie zijn terug te vinden in het rapport in bijlage. Referentie rapport: Validation of an Analytical Method for the Determination of Glyceroltriheptanoate (GTH) in Processed Animal By-Products. Report on the collaborative method-performance study. Administrative Arrangement SANCO/2008/ANIMAL HEALTH/0035/D1/SI Ana Boix, Stefano Bellorini, Christoph von Holst. In dit validatiedossier zullen de resultaten van deze studie vergeleken worden met de prestatiekenmerken die eerder door het FLVVT bepaald werden voor methode LAB 25-MET-FLVVT-125 Bepaling van Glyceroltriheptanoaat. De inhoud van paragraaf 1 tem paragraaf 4 werd letterlijk overgenomen uit het rapport van de interlaboratoriumstudie. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

18 2.1 Opbouw van de studie De studie werd ontworpen volgens de principes van het IUPAC protocol (Horwitz, 1995). De studie bestond uit twee fasen: (i) een trainingsfase en (ii) de eigenlijke validatiefase. De deelnemers dienden de resultaten te rapporteren uitgedrukt in mg GTH per kg vet (zoals vereist volgens de wettelijke bepalingen). De laboratoria analyseerden een set van blinde stalen, bestaande uit duplo-stalen, met verschillende GTHconcentraties. Na het verwijderen van outlyers volgens een vaste procedure werden de resultaten onderworpen aan variantieanalyse (ANOVA) zodat de RSD r en de RSD R bepaald konden worden. 2.2 Testmateriaal en homogeniteitstudie De teststalen bestonden uit diermeel (MBM) en vet van categorie 1 en 2 dat geproduceerd werd onder realistische condities uit de vetsmelterij. De GTH-concentraties werden zodanig gekozen dat er voor beide matrices stalen waren met een concentratie lager, op en boven de wettelijke minimumconcentratie van 250 mg/kg vet. De homogeniteit van de stalen werd gecontroleerd door voor elke matrix-concentratie combinatie 10 containers met staal willekeurig te selecteren en de GTH-concentratie in duplo te bepalen. Op basis van de resultaten werd een schatting gemaakt van de variabiliteit in één container (maat voor de analytische fout) en de variabiliteit tussen de verschillende containers (maat voor de mogelijke heterogeniteit in het testmateriaal). Beide varianties werden met behulp van de F-test vergeleken met de kritische F-waarde waaruit bleek dat de testmaterialen uit de validatiestudie voldoende homogeen waren. Daarnaast werd op basis van deze homogeniteitstudie de gemiddelde GTH-concentratie berekend die gebruikt wordt als doelconcentratie in de validatiestudie. 2.3 Resultaten interlaboratorium-validatiestudie Het FLVVT nam zowel deel aan de trainingsfase als aan de validatiefase. Trainingsfase De trainingsfase liet de deelnemers toe om vertrouwd te worden met het analyseprotocol. De resultaten van de trainingsfase bevatten weinig variatie. Hieruit blijkt dat de laboratoria geen problemen hebben om het analyseprotocol toe te passen en dat zij consistente GTH-waarden rapporteren. Bovendien werd het analyseprotocol op basis van de feedback van de laboratoria aangepast om de toepassing van de methode te vergemakkelijken. Tijdens de trainingsfase konden de laboratoria resultaten inleveren bepaald met FID of met MS. Enkele laboratoria rapporteerden resultaten op basis van FID-detectie, sommige laboratoria rapporteerden zowel resultaten op basis van MS-detectie als FID-detectie, maar de meeste laboratoria rapporteerden enkel resultaten op basis van MS-detectie. Aangezien te weinig laboratoria resultaten rapporteerden op basis van FID werd er besloten om voor de validatiefase enkel laboratoria uit te nodigen die resultaten op basis van MS rapporteerden in de trainingsfase. De resultaten van de trainingsfase zijn weergegeven in tabel 11. Het labonummer van FLVVT is 3. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

19 FLVVT rapporteerde resultaten op basis van MS-detectie en werd op basis van de resultaten van de trainingsfase uitgenodigd voor de validatiefase. Voor een uitgebreidere bespreking van de resultaten uit de trainingsfase wordt er verwezen naar het validatiedossier. Tabel 11: Overzicht van de resultaten van alle deelnemers aan de trainingsfase van de interlaboratoriumstudie. Het labonummer van FLVVT is 3. De matrix (diermeel (MBM) of vet (FAT)) en doelconcentratie (tussen haakjes) van elk staal zijn weergegeven. MS: detectie op basis van massaspectrometrie, FID: detectie met behulp van Flame Ionisation Detector, n.b.: resultaat niet beschikbaar. Elk staal werd in duplo geanalyseerd. mat 1 mat 2 mat 3 mat 4 nr labo detectie MBM (blanco) MBM (112 mg/kg) MBM (404 mg/kg) FAT (194 mg/kg) 1 MS FID MS < 7.5 < ,8 115,2 n.b. 140,7 185,5 210,4 3 MS 4,5 6, , ,5 224,5 192,5 5 MS 1, ,7 135,3 432,7 399,6 230,1 222,6 6 MS < 5 < 5 108,8 107,8 399,8 347,4 206,5 193,7 7 MS < 15 < ,5 104,4 397,9 397,3 194, MS < 1.0 < MS < 10 < 10 88,7 79,8 271,8 303,1 128,1 146,8 10 MS < 10.0 < ,9 118,6 423,7 n.b. 187,2 211,2 11 MS < 5 < , , ,5 12 MS < 10 < FID 258, ,5 344, ,3 419,7 14 FID < 20 < , FID 0 19,8 35,4 53,5 127,7 138, ,2 16 MS < ,4 131,3 < ,2 423,2 220,3 229,9 17 MS < 7.5 < , ,5 413,8 211,3 206,3 18 MS < 0.1 < , , ,1 18 FID < 8.0 < ,1 125,9 323,6 332,1 206,6 202,9 19 MS < 16.0 < ,8 114,2 364,4 359,3 194,4 191,3 20 MS 4,4 25,9 121, ,3 360,8 244,5 243,6 21 MS < 7.0 < ,1 112,1 373,9 388,6 167,1 157,6 LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

20 Validatiefase Alle laboratoria rapporteerden negatieve resultaten voor de blancostalen. Er waren bijgevolg geen vals positieve resultaten. Hieruit kan besloten worden dat de methode voldoende specifiek is. Vooraleer berekeningen werden uitgevoerd met de data, werd de dataset gescreend op aanwezigheid van data die verwijderd dienden te worden. Data werden verwijderd indien er een belangrijke afwijking van het analyseprotocol had plaatsgevonden of indien het om een uitbijter bleek te gaan na statistische analyse. Op basis van deze criteria werden alle resultaten van 4 laboratoria en een duplo-resultaat van één laboratorium voor één testmateriaal uitgesloten. De resultaten van de validatiefase zijn weergegeven in tabel 12. Het labonummer van FLVVT is 3. De resultaten die niet werden meegenomen in de statistische analyse zijn weergegeven in het grijs. Alle resultaten van FLVVT werden in rekening gebracht bij de statistische analyse van de data van de interlaboratoriumstudie. Op basis van deze resultaten werden er waarden bepaald voor de precisie en de juistheid van de methode. Tabel 12: Overzicht van de resultaten van alle deelnemers aan de validatiefase van de interlaboratoriumstudie. Het labonummer van FLVVT is 3. De matrix (diermeel (MBM) of vet (FAT)) en doelconcentratie van elk staal zijn weergegeven. Elk staal werd in duplo geanalyseerd. Resultaten die verwijderd werden uit de dataset zijn grijs gemarkeerd. mat 5 mat 6 mat 7 mat 8 mat 9 mat 10 mat 11 mat 12 nr MBM MBM MBM MBM FAT FAT FAT FAT labo blanco 191 mg/kg 256 mg/kg 455 mg/kg blanco 186 mg/kg 301 mg/kg 61 mg/kg 1 < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

21 2.4 Performantiecriteria afgeleid uit de interlaboratoriumstudie Precisie Op basis van de resultaten werden de precisiewaarden, weergegeven in tabel 13, berekend. Tabel 13: Overzicht van de precisiewaarden bekomen in de interlaboratoriumvalidatiestudie Mat 6 MBM Mat 7 MBM MAT 8 MBM MAT 10 FAT MAT 11 FAT MAT 12 FAT aantal laboratoria a 19 (4) 19 (4) 19 (4) 19 (4) 19 (4) 19 (5) doelconcentratie (mg/kg) gemiddelde (mg/kg) S r (mg/kg) RSD r (%) S R (mg/kg) RSD R (%) HORRAT-waarde a het aantal tussen haakjes betreft het aantal laboratoria dat uitgesloten werd wegens afwijken van het analyseprotocol of wegens identificatie als uitbijter door statistische testen doelconcentratie: de gemiddelde concentratie bepaald tijdens de homogeniteitstudie S r: standaardafwijking van de herhaalbaarheid S R: standaardafwijking van de reproduceerbaarheid RSD r: relatieve standaardafwijking van de herhaalbaarheid RSD R: relatieve standaardafwijking van de reproduceerbaarheid De precisiewaarden werden vergeleken met de aanvaardbare referentiewaarden berekend op basis van de Horwitz-vergelijking (Horwitz et al., 1980). De HORRAT-waarde waarbij de precisie van de methode vergeleken wordt met de precisie berekend volgens de Horwitz-vergelijking geeft een indicatie van het al dan niet voldoende precies zijn van de methode (Horwitz en Albert, 2006). De streefwaarde voor de HORRATwaarde is 1, de aanvaardingslimiet is 1.5 en de kritische afkeuringslimiet bedraagt 2. HORRAT RSD RSD R R, Horwitz waarbij RSD R, Horwitz 2 (1 0.5 log C) met C de massaconcentratie uitgedrukt als macht van 10 (vb 1 mg/kg = 10-3 ) Uit tabel 13 blijkt dat de RSD r varieerde van 3.4% tot 7.8%. Deze waarden komen goed overeen met de overeenkomstige precisiewaarden uit de in-huis validatie van de methode (zie validatiedossier voor de precisiewaarden uit de in-huis validatie van het IRMM). De RSD R varieerde van 9.0% tot 16.5% en de overeenkomstige HORRAT-waarden zijn allen kleiner of gelijk aan 2. Er kan besloten worden dat de precisiewaarden aanvaardbaar zijn en dat de analysemethode bijgevolg geschikt is voor het beoogde doel. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

22 Juistheid De juistheid van de methode werd geëvalueerd aan de hand van een vergelijking tussen de gemiddelde GTH-concentratie bekomen in de validatiestudie en de doelwaarde voor de GTH-concentratie bepaald in de homogeniteitstudie. Uit deze vergelijking blijkt dat de juistheid varieerde van 95% tot 106% (zie figuur 2). Er werden met andere woorden aanvaardbare waarden bekomen voor de juistheid van de methode. Figuur 2: Schatting van de juistheid van de methode, uitgedrukt in de verhouding tussen de gemiddelde concentratie uit de validatiestudie en de doelconcentratie. De foutbalken geven de uitgebreide meetonzekerheid weer die gelijk is aan tweemaal de standaardfout, berekend op basis van de RSD R (zie tabel 13) en het aantal laboratoria. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

23 2.5 Vergelijking tussen performantiecriteria interlaboratoriumstudie IRMM en validatiedossier FLVVT De performantiecriteria bepaald door het FLVVT worden vergeleken met de performantiecriteria berekend op basis van de interlaboratoriumstudie van het IRMM. De herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid werden in het validatiedossier zowel voor de matrix diervoeder als voor de matrix vet bepaald en dit voor twee GTHconcentraties nl. 20 mg/kg en 250 mg/kg. Deze waarden zijn terug te vinden in respectievelijk tabel 14 en tabel 15. De waarden voor de herhaalbaarheid en de reproduceerbaarheid van de interlaboratoriumstudie van het IRMM zijn terug te vinden in tabel 13. Volgende vergelijking kan gemaakt worden tussen enerzijds de precisiegegevens van het FLVVT en anderzijds de gegevens uit de studie van het IRMM: Diermeel 250 mg/kg: o MAT 6 (MBM met doelconcentratie 191 mg/kg en gemiddelde concentratie 188 mg/kg o MAT 7 (MBM met doelconcentratie 256 mg/kg en gemiddelde concentratie 273 mg/kg o MAT 8 (MBM met doelconcentratie 455 mg/kg en gemiddelde concentratie 467 mg/kg Diermeel 20 mg/kg: o Geen vergelijking mogelijk wegens ontbreken van matrix-concentratie-combinatie in studie IRMM Vet 250 mg/kg: o MAT 10 (MBM met doelconcentratie 186 mg/kg en gemiddelde concentratie 181 mg/kg o MAT 11 (MBM met doelconcentratie 301 mg/kg en gemiddelde concentratie 306 mg/kg Vet 20 mg/kg o MAT 12 (MBM met doelconcentratie 61 mg/kg en gemiddelde concentratie 58 mg/kg Herhaalbaarheid Tabel 14: Overzicht van de precisiewaarden voor herhaalbaarheid bekomen in de validatiestudie van het FLVVT Diermeel Vet 250 mg/kg 20 mg/kg 250 mg/kg 20 mg/kg S r (mg/kg) RSD r (%) De waarden voor herhaalbaarheid van het FLVVT (zowel S r als RSD r (%) zijn voor alle onderzochte matrixconcentratie-combinaties zeer gelijklopend of liggen zelfs lager dan deze uit de interlaboratoriumstudie. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

24 Reproduceerbaarheid Tabel 15: Overzicht van de precisiewaarden voor reproduceerbaarheid bekomen in de validatiestudie van het FLVVT Diermeel Vet 250 mg/kg 20 mg/kg 250 mg/kg 20 mg/kg S R (mg/kg) RSD R (%) De waarden voor reproduceerbaarheid van het FLVVT (zowel S R als RSD R (%) zijn voor alle onderzochte matrix-concentratie-combinaties zeer gelijklopend met deze uit de interlaboratoriumstudie. 2.6 Conclusie De precisiekenmerken bepaald tijdens de validatie van het FLVVT zijn zeer gelijkaardig of zelfs beter dan de kenmerken uit de interlaboratoriumstudie van het IRMM. Hieruit kan besloten worden dat het FLVVT methode LAB 25-MET-FLVVT-125 Bepaling van Glyceroltriheptanoaat correct uitvoert en betrouwbare resultaten behaald. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

25 3 Foto s Foto 1: Smelten van de vetten in de oven. Foto 2:Opzuivering met behulp van SPE-kolommetjes. LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26

26 Foto 3: Indampen van extract bekomen na opzuiveringsstap LAB 00 P 180 F 003 Template validatierapport Modèle rapport de validation v /26